Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gær luminometriske og Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

Som supplement til almindeligt anvendte metoder til at studere TRPV4 s er to metoder beskrevet: Dens mechanosensitivity kan studeres af Ca 2 +-aequorin-luminometri i transgene gær ved hypo-osmotisk udfordring. Det kan også undersøges i TRPV4-RNA injicerede Xenopus oocytter ved hel-celle to-elektrode spænding klemme eller patch clamp i on-celle eller fjernede tilstand.

Abstract

TRPV4 (Transient Receptor Potentialer, vanilloid familie, type 4) er almindeligt udtryk i hvirveldyr væv og aktiveres af flere stimuli, bl.a. ved hjælp af mekaniske kræfter. Visse TRPV4 mutationer forårsager kompleks arvelig knogle eller neuronale patologier i menneskelig. Vildtype-eller mutant TRPV4 transgener almindeligvis udtrykkes i dyrkede pattedyrceller og undersøges af Fura-2 fluorometri og elektroder. Med hensyn til mekanismen for mechanosensitivity og molekylære grundlag for de sygdomme, den nuværende litteratur er forvirrende og kontroversiel. Som supplement til de eksisterende metoder beskriver vi yderligere to metoder til at undersøge de molekylære egenskaber TRPV4. (1) Rat TRPV4 og en aequorin transgen omdannes til spirende gær. En hypo-osmtic chok transformantens befolkning giver et luminometrisk signal på grund af kombinationen af aequorin med Ca 2 +, frigivet gennem TRPV4 kanal. Her TRPV4 er isoleret fra sine sædvanlige pattedyr partner proteinerog afslører sin egen mechanosensitivity. (2) cRNA af TRPV4 injiceres i Xenopus-oocytter. Efter en passende inkubationstid, er den makroskopiske TRPV4 aktuelle undersøgt med en to-elektrode spændingsklemme. Den aktuelle stigning på fjernelse af inaktive osmotikum fra oocyt bad er tegn på mechanosensitivity. De mikroampereområdet (10 -6 til 10 -4 A) strøm fra oocytter er langt større end de subnano-til nanoampere (10 -10 til 10 -9 A) strøm fra dyrkede celler, hvilket giver klarere kvantificeringer og mere fortrøstningsfulde. Mikroskopiske strømme afspejler aktiviteterne i de enkelte kanalproteiner kan også direkte registreret under en patch clamp, i on-celle eller fjernede tilstand. Det samme oocyt giver flere patch prøver, så der bedre data replikation. Sugerør anvendes på patches kan aktivere TRPV4 til direkte at vurdere mechanosensitivity. Disse metoder bør også være nyttige i studiet af andre typer af TRP kanaler.

Introduction

TRP (forbigående receptor potentialer) omfatter syv underfamilier af kationkanaler der tjener sensoriske funktioner 1,2. I pattedyr, TRPV den vanilloid underfamilie af TRP, har seks sorter. TRPV4 (type 4) 3,4 reagerer på varme, visse kemikalier, osmotisk hævelse eller shear stress. Den TRPV4 genet blev gentagne gange isoleres ved kandidat-genet og / eller ekspressionskloning 5-8. Sidstnævnte metode efterfulgt genproduktet reaktion på hypo-osmolaritet. TRPV4 udtrykkes i næsten alle organer og funktioner i udvikling, fysiologi, eller patologi mange forskellige celletyper 3,4.

Slående er de> 50 menneskelig autosomal dominant TRPV4 mutationer, der forårsager perifere neuropatier og / eller skelet dysplasier (abnormiteter i skelet udvikling) 9-11. De skelet dysplasier spænder fra mild brachyomia type 3 (type-3 dværgvækst), spondylometaphyseal dysplasi Kozlowski typen, at Severe dysplasier, nogle forårsager neonatal eller fosterdød. Selv synes muligt alle manerer af mekanismer, ingen forklarer mangfoldighed, kompleksitet, variation og lejlighedsvise overlapninger af disse sygdomme 4.

Ligesom andre TRP kanaler 1, TRPV4 er en tetramer. I rotte eller menneske TRPV4 er hver underenhed bestod af 871 rester. Dens centrale element er den seks transmembrane et helices (S1-S6), som sandsynligvis arrangeret på en måde, der svarer til spændingsåbnede K +-kanaler. Der S1 til S4 danner en perifer domæne og S5 og S6 danner gennemtrængning pore domæne. Mellem S5 og S6 TRPV4 er en kort pore helix efterfulgt af sekvensen LDLFKLTIGMGDL, hvoraf fire formentlig konvergere til dannelse af kationen filteret. Den 470-rest N-terminal cytoplasmatisk segment indeholder 6 ankyrin gentagelser, der er kendt for at binde proteiner eller små ligander. Den C-terminale 152-rest cytoplasmatisk segment omfatter en calmodulin-bindende sekvens blandt andre brancher, der binder othendes elementer 3.

TRPV4 er en kation kanal, der hovedsagelig udelukker anioner 1. Mens dets fysiologiske funktion er at transducere stimuli Ca2 + indstrømning, er det også permeabelt for andre kationer med en permeabilitet sekvens Eisenman IV begunstige divalent til en P Ca: P Na ~ 7 12. Single-kanals ledningsevne afhjælper på ~ 90 pS udad og ~ 40 pS indad 6,13,14. Heterologt udtrykt strøm (nedenfor) kan aktiveres ved hypo-osmotisk hævelse, forskydningsspænding eller varme 15. Det er også aktiveres af polyumættede fedtsyrer 16,17 og syntetiske phorbal ester 4αPDD 18. På nuværende tidspunkt er den mest potente agonist GSK1016790A 19 og antagonisten er GSK2193874 effektiv i 10 -9 10 -8 M 20, begge opdaget af high-throughput, lille molekylvægt skærm.

To centrale områder af TRPV4 forskning forblive forvirrende: (1) Selv som TRPV4 vid udstrækning er undersøgt for sin mechanosensitivity, dens molekylære grundlag er kontroversiel. En model beskriver hypo-osmolaritet måde aktiverer phospholipase A2 (PLA2) at producere polyumættet fedtsyre (PUFA) arachidonsyre (AA), som omdannes til epoxyeicosatrienoic syre (EET) af en epoxygenase og bindingen af EET aktiverer TRPV4 16. 17.. Alligevel har TRPV4 selv blevet vist at direkte svare membran stretch 14 (nedenfor), hvilket giver en enklere forklaring. (2) TRPV4 mutant patologier er forvirrende. På fundamentet, er man nødt til at vide, om de sygdomme skyldes tab, reduktion eller forøgelse af kanal-aktiviteter. Selv her, litteraturen er langt fra klart. Mens flere skelet-dysplasi alleler blev rapporteret til at have højere aktiviteter (gain-of-funktion, GOF) 4,21, adskillige blev rapporteret at have reduceret aktiviteter (tab af funktion, LOF) 10,22. En systematisk undersøgelse af 14 alleler fandt dem tilalle skal GOF mutationer (nedenfor) 23. Påstanden om, at nogle er LOF synes at modsige den fænotype TRPV4-/ - knockout-mus, som er levedygtige eller frugtbar, med kun mindre fejl, på trods af en fuldstændig tab af TRPV4 funktion.

En del af disse kontroverser har metodologisk oprindelse. Laboratorier anvender forskellige metoder, eller varianter af en fremgangsmåde og anvende forskellige dømme standarder. Mest almindeligt er TRPV4 forbigående udtrykkes i dyrkede pattedyrceller (HEK, CHO, HeLa) og fremkomsten af intern [Ca 2 +] ved agonist eller hypotonisk stimulation er registreret med Ca 2 + fluorescensfarvestof, Fura-2. De over-afhængighed af denne fluorometrisk assay er blevet kritiseret 1. Ekspressionsniveauet i forskellige populationer, fordelingen deri, såvel som den effektive farvestofkoncentration, skal kontrolleres og dokumenteres. Mere pålidelig er de direkte elektrofysiologiske undersøgelser. Selv dette som commonly praktiseres, er heller ikke uden problemer. Fordi ekspressionsniveauer i individuelle dyrkede celler er vanskelige at styre, helcelle-strømme har store variationer. Endvidere fordi strøm er lille, vil pålidelige statistikker nødt til at stole på store stikprøvestørrelser, ofte ikke praktisk. Patch-clamp undersøgelser er sjældent blevet udført. Nogle af disse optagelser viser klynger af aktivitet byger, der gør statistisk evaluering udfordrende 16,17.

For bedre at forstå den molekylære mechanosensitivity, har vi udviklet yderligere to systemer til at undersøge TRPV4. (1) For at isolere TRPV4 væk fra sine sædvanlige pattedyr partnere, vi har udtrykt rotte TRPV4 i spirende gær 24. Funktionel udtryk for TRPV4 i denne evolutionært fjernt forbindelse viste, at det stadig kan reagere på osmotisk kraft uden sine sædvanlige samarbejdspartnere. Fordi gær giver ingen PUFA såsom AA eller EET, og dens genom har ingen PLA2 eller epoxygenase gener, dette EXPREssion viser også, at de ikke er påkrævet for TRPV4 at fornemme kraft. Under TRPV4 i de molekylære biologisk mest medgørlige eukaryoter også tillader effektiv frem-eller tilbage-genetiske manipulationer 25. (2) For dybtgående biofysiske analyser af TRPV4 udtrykte vi TRPV4 i Xenopus oocytter. I modsætning til dyrkede celler, der giver sub-Na Na (10 -10 til 10 -9 A) strømme, en oocyt udtrykker strømninger i uA s (10 -6 til 10 -4 A). Meget større signal over støj giver en bedre kvantificering og mere sikker sammenligning. TRPV4, så udtrykte, kan også undersøges som enkelte molekyler ved hjælp af en patch clamp. En enkelt oocyt tillader gentagne patch prøveudtagning, igen gør kvantificering mere pålidelige. Sådanne undersøgelser har vist, at TRPV4 selve kanalen direkte kan aktiveres ved membran stræk kraft 14. Analyser viste også, at 14 repræsentative skelet-dysplasi alleler er alle gain-of-funktion mutationer. Endvidere graderee af denne konstitutive Ca 2 + lækage paralleller sværhedsgraden af skelet sygdomme 23.

På grund af deres nyhedsværdi og nytte er de detaljerede procedurer for disse to metoder er samlet her for at give gentagelser i fremtidige forskning på TRPV4 eller lignende kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Gær luminometri Metoder

Brug stamme BYYT af Saccharomyces cerevisiae. Det er en yvc1-tok1-derivat af BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformere celler med Leu-valgbar aequorin-udtrykkende plasmid pEVP1/Aeq og ura vælges rotte-TRPV4-udtrykkende plasmid p416GPDV4, som beskrevet i Batiza et al. 26. og Loukin et al. 24. bruge standard metoder til plasmid bygning og ombygning 27 . Gærstamme og plasmider er tilgængelige efter anmodning.

  1. Kultur 2 ml gærceller natten til post-logaritmisk fase i en 30 ° C-rysteapparat i leu-ura-"DCD" dropout medium 28 (et sulfat-udtømte variant af CMD-Leu-ura medium 29), suppleret med 1 M sorbitol . Podes 200 pi af disse kulturer i 1,8 ml frisk medium suppleret med 2 pM af luciferin coelenterazin. Vokse i mørke ved stuetemperatur i yderligere 24 timer uden rystning.
  2. Mål osmolariteten af ​​kulturen (typisk ved 1.400 mOsM) og andre opløsninger (under) ved anvendelse af et damptryk osmometer.
  3. Afmål 20 pi af frisk kultur i en 12 mm luminometerrør for et enkelt rør luminometer.
  4. For hypotonisk shock, tilsættes 200 pi af en opløsning indeholdende 25 mM NaEGTA (pH 7,2) eller navne (pH 7,2) og 500 til 100 mM NaCI, (samlet osmolaritet på 1,200-400 mOsM) afhængigt af graden af ​​chok ønskes. Løbende overvåge luminescens før og mindst 120 sek efter den osmotiske downshock, kun afbrudt af den korte fortynding. Registrer luminometer output på en stationær computer som relative luminescens enheder (RUL).

Selv om det ikke for studiet af transgene TRPV4 har vi anvendt en variant af den ovennævnte protokol i et automatiseret system til at undersøge svarene fra en lang række gærstammer. Undersøgelse of svarene på hypo-30 eller hyperosmotiske 31 stimuli af gær deletome (indsamling af 4.906 gær enkelt gen deletants) ved hjælp af en mikroplade luminometer og analyseres med tilsvarende software har været en succes.

2. og 3. Oocyte Elektrofysiologiske Metoder

Elektrofysiologi bruger grundlæggende metoder 32. PCR amplifikation af den åbne læseramme af vildtype eller mutant TRPV4 hjælp af high-fidelity PfuUtra polymerase og integreret i pGH19 33. Dette medfører en præcis indsættelse af ORF mellem de 5'-og 3'-UTR'er af Xenopus β-globin-genet og nedstrøms for en T7-RNA-polymerase-promotoren. Linearisere konstruktionen nedstrøms for 3'-UTR og anvendt som templates i en in vitro-T7-RNA-polymerase-reaktion. Brug standard molekylærbiologiske teknikker 34.

Brugsfasen V-VI oocytter fra X. laevis. Dyrehold, delvis ovariectomin, defolliculation og vitelline fjernelse kuvert følge standardprocedurer 32,33,35. Injicer 2-40 ng cRNA opløsning pr oocyt ved hjælp af en Drummond Nanoinject II automatisk mikroinjektor. Injicer ~ 30 oocytter for hvert sæt forsøg. Efter TRPV4-cRNA injektion inkuberes oocytterne i ND96-medium med gentamicin (100 ug / ml) og 1 uM ruthenium rød 14.

2. To Elektrodespænding Clamp

  1. Træk borosilikatglas optagelse pipetter fra præcision engangs 100 ul mikropipetter individuelt med en pipette aftrækker.
  2. Træk både spænding-måling og nuværende indsprøjtning pipette elektroder er trukket for at have et tip blænde på ~ 1 mM diameter.
  3. Opfyldning elektroder med 2 M KCI resulterer i 0,1-0,2 MOhm modstand. Monter dem på HS2A headstages, som sammen med en VG-2Ax100 virtuel jordet bad klemme, er tilsluttet en GeneClamp 500 forstærker grænseflade via en Digidata 1440 digitizer. Anskaf data ved hjælp af pClamp10 software.
  4. Placer oocyt, der skal testes i en 1 ml bad i en opdigtet plastkammer monteret på scenen af ​​et dissektionsmikroskop med 20X forstørrelse. Badopløsningen er virtuelle jordforbindelse med en 3 M KCI-agar bridge og et chloreret sølvtråd placeret tæt oocytten og forbundet med et VG-2A virtuel jord fase.
  5. Konstruer kammeret for kontinuerlig perfusion med plastrør som løsning indløb og udløb. Tilslut indløbsrøret er forbundet til en fabrikeret perfusion system, som er en manifold på seks 50 ml sprøjte skaller, hver fyldt med en anden løsning. Gravity tilspændinger af en bestemt løsning styres til ~ 2-3 ml / min ved hjælp af "Keck" ramp klemmer på slangerne.
  6. Monter begge elektroder med deres headstages på mikromanipulatorer. Udfør elektrode gennemføringer i ægget ved mikromanipulering.

3. Patch Clamp Undersøgelse af Direct Mechanosensitivity

"> De grundlæggende metoder til patch clamp herunder pipette forberedelse, GQ forsegling dannelse og dannelse af den celle eller udskårne tilstande er dem, Hamill et al. 36 og Conn 32.

  1. Fyld borosilicat pipetter med ~ 1 um diameter åbning ved spidsen (bubble nummer 5-6) med 98 mM KCI, 1 mM MgCl2 og 10 mM K +-HEPES, pH 7,2.
  2. Fastgør patch clamp pipette gennem et plastrør til en 5 ml sprøjte og via en T-samling, også til et manometer. Brug en computer til at håndtere både elektroden og manometervaesker udgange. Anskaf data på 10 kHz, og afspil derefter gennem en otte-polet Bessel-filter ved 1 kHz til analyse.
  3. Forskellige pletter kan udskæres fra den samme oocyt gentagne gange. Denne praksis gør undersøgelsen af ​​TRPV4 molekylære aktivitet mere effektiv og pålidelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I et typisk luminometri eksperiment, er en række 400-1,200 mosm hypotoniske ned stød opnås ved at tilsætte 200 pi chok opløsninger af forskellig lav osmolaritet til 20 ul kultur på 1.400 mOsM. Den TRPV4 aktivitet er tydelig, når RLU den eksperimentelle sammenlignes med to negative kontroller: gærceller transformeret med tom p416GPDV4 plasmid eller en, der indeholder TRPV4 genet med en mutation ved ion (Figur 1) 24.

I et typisk to-elektrode spænding-clamp eksperiment oocytterne oprindeligt badet i en strømmende isotonisk badopløsning indeholdende (i mM) 66 KMeSO 4, 1,8 Ba (meso 4) 2, 5 K +-HEPES (pH 7,2), og 100 sorbitol. Spidsstrømme vurderes ved udgangen af ​​100 ms Testimpulser +20 mV fra en bedrift potentiale -20 mV hver 10 sek. At fremkalde hypotonisk reaktioner flow ændres til en lignende løsning mangler sorbitol. T hans hypotonisk reaktion er reversibel ved returnering af sorbitol samt spærres af TRP-kanal blokker ruthenium rød (figur 2A).

I en typisk patch-clamp eksperiment er symmetrisk opløsning anvendes, dvs opløsningen badning plasteret og pipetten fyldning opløsning er de samme (98 mM KCI, 1 mM MgCl2 og 10 mM K +-HEPES, pH 7,2). Her er inside-out patch udskåret fra en rotte-TRPV4 udtryk oocyt afholdt på +50 mV. Impulser af suge genereres fra sprøjten. Korte sugerør, hundreder af millisekunder i varighed, anvendt på snesevis af mm Hg, fremkalde ~ 40 pS enhedsstat ledningsevne indfødte til oocyt membran 37 og ~ 90 pS enhedsstat ledningsevne af det heterologt udtrykte TRPV4 (figur 2B) 14..

les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Rotte TRPV4 udtrykt i gær reagere på hypotonisk chok. (A) Et diagram, der viser de eksperimentelle metoder. (B) 750 mOsM hypotonisk chok (pilespidser) udløser en stor luminescens forøgelse (i relative luminescens enheder, RLU) i TRPV4 transformanter, men ikke i transformanter af et tomt plasmid eller et plasmid bærer en TRPV4 med en mutation i sin ion filter (M680K). (C) En dosis-respons-relation mellem hypotonisk chok og den maksimale respons (gennemsnit + SD, n = 3). Målinger fra 2,4 x 10 6 celler hver 24. Klik her for at se større billede .

0px "/>
Figur 2. Elektrofysiologiske undersøgelser af TRPV4 aktivitet heterologt udtrykte Xenopus oocytter. (A) Hele-oocyt makroskopiske-strøm reaktioner på hypotone stimuli undersøgt med en to-elektrode spænding klemme. Spidsstrøm fra en oocyt, der udtrykker meget høje niveauer af vildtype-TRPV4 (5 dage efter injektion af 40 ng cRNA) ved 100 msek spænding trin (fra -20 til +20 mV hvert 10. sekund) (indsat) som respons på fjernelse 100 mM sorbitol fra 250 mOsM badopløsningen (åbne søjler), og tilsætning af 3 uM ruthenium-rød (RUR; fyldt bar). Tydeligt er de gentagne peak-strøm stiger upon hypotone stimuli og dens falder efter tilbagevenden til isotonisk opløsning eller tilføjelse af kanalen blokker (RUR). (B) Direkte aktivering af vildtype TRPV4 ved membran stretch ses under en patch clamp. En prøve af rå spor af gennemsnitlige kvalitet fra en patch skåret ud af en TRPV4-expreesssing oocyt, viser aktivation med 60 mmHg sugning (lavere trace) anvendt på en udskåret inside-out patch afholdt på +50 mV. Den øverste spor vises på en hurtigere tid base for at vise enhedsstat aktuelle overgangen mellem lukket (C) og to åbne niveauer (O 1 og O 2) 14. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som anført i indledningen, de metoder, der almindeligvis anvendes til at studere TRPV4 funktioner til tider resulteret i uoverensstemmelser og kontroverser. De to sæt af metoder, der beskrives her tilbyde nogle fordele, og kan supplere de eksisterende metoder. Mens vi beskriver kun de undersøgelser om TRPV4 kan de metoder udvides til at studere andre ionkanaler samt.

1.. Gær luminometri Metoder

Spirende gær har en indfødt Ca 2 +-tilstrømning respons på hypo-osmotisk chok, der er sensibiliseret af mutationer, der påvirker lipid sammensætning 30. Dette signal kan slettes med ekstern EGTA. Denne chelator imidlertid sletter ikke signalet fra heterologt udtrykt TRPV4 24, der angiver, at kanalen er udtrykt i en indre membran, mest sandsynligt, at i det endoplasmatiske retikulum, hvorfra Ca2 + frigives til cytoplasmaet af den osmotiske stød. Trafik af heterologt udtryktkanaler er ikke blevet undersøgt i gær. Denne metode bør udvides til studiet af andre TRP kanaler eller andre formodede mekanosensitive kanaler, der skal udføres, og tilstedeværelsen af ​​det oprindelige system erindres kelation test.

2A. To-elektrode Voltage Clamp

I modsætning til patch-clamp-forsøg, er de to elektroder spænding-clamp eksperiment udført på intakte oocyt, inden fjernelsen af ​​vitelline konvolutten. Både mikroskopisk undersøgelse og kapacitetsmæssige værdier indikerer, at plasmamembranen er ikke ensartet kugleformet men høj sammentrækningsorgan under relativt uelastisk sfære vitelline kuvert. Således mekanisk stress forårsaget af hyponicity er ikke blot en isotrop inflatorisk spænding en udvidet sfærisk plasmamembranen. Stress sandsynlige resultater fra presning af membranen mod begrænsende vitelline kuverten og / eller væk fra den etablerede cytoplasmatisk vedhæftet fil i the ansigt forøget osmotisk tryk.

Ekspression af TRPV4, og sandsynligvis nogle andre kanaler, er toksisk for oocyt, formodentlig på grund af Ca 2 + lækage. Det er derfor vigtigt løbende at udruge ægget efter TRPV4-cRNA injektion i tilstedeværelse af kanalen blocker, ruthenium rød. Graden af ​​TRPV4 udtryk viser variation, hvilket ikke er helt under eksperimentel kontrol. "Gain-of-funktionen" mutant TRPV4 kanaler, dem, der viser en betydelig spontan åbning, systematisk udtrykkes tidligere efter injektion end deres vildtype-modstykke 23.

2B. Patch Clamp

Xenopus oocyt udtrykker en indfødt mekanosensitive kanal, som afhjælper i indadgående retning (~ 50 pS indad, ~ 10 pS udad). En undersøgelse tyder på, at det er udtryk for TRPC1 37. Denne konstant udtrykkes native kanal giver en kalibrering for TRPV4, den heterologous udtryk, som måske ikke altid med held observeret i patches.

Sandsynligheden for at støde på TRPV4 tendens til at være højere i oocytter efter en længere inkubationstid, typisk 3-4 dage efter cRNA-injektion. En effektiv måde at gå frem er at først udføre to-elektrode-spænding-clamp eksperiment (ovenfor), og sørg for, at ægget udtrykker den spontane TRPV4 makroskopiske strøm, og derefter gå videre til at fjerne vitelline konvolut, før du tager prøven patches fra den samme oocyt. Sandsynligheden for at fange TRPV4 aktiviteter kan også forbedres ved hjælp af "macropatches", monteret på pipetter med større boringer (boble nummer 6-7). Fire polering disse pipetter 32 synes at være nyttige i at nå GQ segl. Efter forseglingen dannelse, kan udskæres plasteret udviser en meget høj modstand, meget lidt støj normalt forbundet med biologiske membraner, og ingen native kanalaktivitet. Det mest sandsynlige idicates en dobbelt-membran formation. En kort luft eksponering, kan ved forbigående løfte pipetten over menisken ved mikromanipulering normalt bryde uønskede ekstra lag. Alternativt kan det ydre lag fjernes ved forsigtigt at røre pipetten boring mod en tråd af hærdet silikonepakning suspenderes i badet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Andrea Kremsreiter for fremragende teknisk bistand. Arbejde i vores laboratorium er støttet af NIH GM096088 og Vilas Trust fra University of Wisconsin - Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
  2. Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
  3. Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
  4. Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
  5. Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
  6. Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
  7. Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
  8. Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
  9. Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
  10. Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
  11. Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
  12. Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
  13. Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
  14. Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
  15. Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
  16. Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
  17. Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
  18. Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
  19. Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
  20. Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  21. Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
  22. Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
  23. Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
  24. Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
  25. Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
  26. Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
  27. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  28. Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  29. Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
  30. Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
  31. Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  32. Conn, P. M. Methods in Enzymology. 294, Academic Press. (1999).
  33. Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).
  34. Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
  35. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
  36. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  37. Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).

Tags

Basic-protokollen Eukaryota Archaea bakterier Life Sciences (General) Mechanosensation Ionkanaler lipider patch clamp, gær luminometri force sensing spænding klemme TRPV4 elektrofysiologi
Gær luminometriske og<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte elektrofysiologiske Undersøgelser af Molekylær Mechanosensitivity af TRPV4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter