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Biology

Luminométricos levadura y Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

Para complementar los métodos comúnmente utilizados para el estudio de TRPV4, dos métodos se describen: Su mechanosensitivity puede ser estudiado por Ca 2 +-luminometría aecuorina en la levadura transgénica a partir del desafío hipo-osmótica. También puede ser examinado en TRPV4-ARN inyectado ovocitos de Xenopus por células enteras de fijación de voltaje de dos electrodos o parche abrazadera en en-célula o el modo extirpado.

Abstract

TRPV4 (Transient Receptor Potenciales familia vanilloid, tipo 4) es ampliamente expresado en tejidos de vertebrados y se activa por varios estímulos, incluyendo por fuerzas mecánicas. Ciertas mutaciones causan TRPV4 ósea hereditaria compleja o patologías neuronales en humanos. De tipo salvaje o mutante TRPV4 los transgenes se expresan comúnmente en células de mamífero cultivadas y se examinaron por Fura-2 fluorometría y por los electrodos. En cuanto al mecanismo de mechanosensitivity y las bases moleculares de las enfermedades, la literatura actual es confuso y controvertido. Para complementar métodos existentes, se describen dos métodos adicionales para examinar las propiedades moleculares de TRPV4. (1) Rata TRPV4 y un transgén aecuorina se transforman en levadura en ciernes. Un choque hipo osmtic de la población transformante produce una señal luminométrica debido a la combinación de aecuorina con Ca 2 +, lanzado a través del canal TRPV4. Aquí TRPV4 está aislado de sus proteínas asociadas mamíferos habitualesy revela su propio mechanosensitivity. (2) ARNc de TRPV4 se inyectó en oocitos de Xenopus. Después de un período de incubación adecuado, la corriente TRPV4 macroscópica se examinó con una pinza de voltaje de dos electrodos. El aumento de la intensidad después de la retirada de osmoticum inerte del baño de los ovocitos es indicativa de mechanosensitivity. Los microamperios (10 -6 a 10 -4 C) Las corrientes de ovocitos son mucho más grandes que las subnano a nanoamperio (10 -10 a 10 -9 C) Las corrientes de células cultivadas, produciendo cuantificaciones más claras y las evaluaciones de más confianza. Corrientes microscópicas que reflejan las actividades de proteínas de los canales individuales también pueden ser directamente registrados bajo una grapa de parche, en el de las células o el modo extirpado. Lo mismo oocito ofrece varias muestras de parches, lo que permite la replicación de mejores datos. Succiones aplicadas a los parches pueden activar TRPV4 evaluar directamente mechanosensitivity. Estos métodos también deben ser útiles en el estudio de otros tipos de canales TRP.

Introduction

TRP (potencial de receptor transitorio) comprenden siete subfamilias de canales de cationes que sirven funciones sensoriales 1,2. En los mamíferos, TRPV, la subfamilia vanilloid de TRP, tiene seis variedades. TRPV4 (tipo 4) 3,4 responde al calor, ciertos productos químicos, hinchazón osmótica, o esfuerzo de corte. El gen TRPV4 se aisló repetidamente por el candidato-gen y / o clonación de expresión 5-8. El último método siguió la respuesta del producto génico a la hipo-osmolaridad. TRPV4 se expresa en casi todos los órganos y funciones en el desarrollo, fisiología, o patología de muchos tipos de células dispares 3,4.

Llama la atención son las mutaciones TRPV4 autosómicos dominantes humana> 50, provocando neuropatías periféricas y / o displasias esqueléticas (anormalidades en el desarrollo del esqueleto) 9-11. Oscilan Las displasias esqueléticas de leves tipo brachyomia 3 (tipo-3 enanismo), displasia espondilometafisaria tipo Kozlowski, a Severe displasias, algunas causando la muerte neonatal o embrionario. Aunque parecen posibles toda clase de mecanismos, ninguno explica la diversidad, la complejidad, variabilidad y superposiciones ocasionales de estas enfermedades 4.

Al igual que otros canales TRP 1, TRPV4 es un tetrámero. En rata o TRPV4 humana, cada subunidad está constituida por 871 residuos. Su elemento central es el de seis hélices transmembrana (S1-S6), lo que probablemente se disponen de una manera similar a canales de K + dependientes de voltaje. Hay, S1 a S4 formar un dominio periférica y la S5 y S6 forman el dominio de poro de permeación. Entre S5 y S6 de TRPV4 es una hélice de poro corto seguido por la secuencia de LDLFKLTIGMGDL, cuatro de los cuales presumiblemente convergen para formar el filtro de cationes. El segmento citoplasmático N-terminal de 470 residuos contiene 6 repeticiones de anquirina, conocidos por unirse a proteínas o ligandos pequeños. El segmento citoplásmico 152-residuo C-terminal incluye una secuencia de unión a calmodulina-entre otros sitios posibles que se unen OTsus elementos 3.

TRPV4 es un canal catiónico que excluye esencialmente aniones 1. Aunque su función fisiológica es para transducir estímulos a Ca 2 + afluencia, que también es permeable a otros cationes con una secuencia de permeabilidad Eisenman IV, favoreciendo divalente a un Ca P: P Na ~ 7 12. Conductancia de un canal rectifica a ~ 90 pS hacia afuera y hacia adentro ~ 40 pS 6,13,14. Heteróloga expresada actual (abajo) se puede activar por hipo-osmótica hinchazón, tensión de corte o calor 15. También es activado por los ácidos grasos poliinsaturados 16,17 y el éster de forbol sintética 4αPDD 18. En la actualidad, el agonista más potente es GSK1016790A 19 y antagonista es GSK2193874, eficaz en 10 -9 a 10 -8 M 20, ambas descubiertas por el alto rendimiento, la pequeña pantalla-molecular.

Dos áreas clave de la investigación TRPV4 permanecen confusos: (1) A pesar de que TRPV4 es estudiado en gran medida por su mechanosensitivity, su base molecular es controversial. Un modelo describe hipo-osmolaridad de alguna manera activa la fosfolipasa A2 (PLA2) para producir el ácido graso poliinsaturado (PUFA) de ácido araquidónico (AA), que se convierte en ácido epoxieicosatrienoicos (EET) por una epoxigenasa, y la unión de EET activa TRPV4 16, 17. Sin embargo, sí TRPV4 se ha demostrado que responden directamente a estiramiento de la membrana 14 (a continuación), que proporciona una explicación más simple. (2) Las patologías mutantes TRPV4 son desconcertantes. En la base, es necesario saber si las enfermedades se deben a la pérdida, la reducción o el aumento de las actividades de canal. Incluso en este caso, la literatura está lejos de ser clara. Aunque se reportaron múltiples alelos esquelético-displasia tener actividades más altas, (ganancia de función, GOF) 4,21, varios se informó que han reducido las actividades (pérdida de la función, LOF) 10,22. Un estudio sistemático de 14 alelos que los ha encontradotodas las mutaciones se GOF (continuación) 23. La afirmación de que algunos son LOF parece contradecir el fenotipo de TRPV4-/ - ratón knockout, que son viables o fértiles, con sólo pequeños defectos, a pesar de una pérdida completa de la función TRPV4.

Una parte de estas controversias tiene origen metodológico. Los laboratorios usan diferentes métodos, o variantes de un método, y emplean diferentes normas de juzgamiento. Por lo general, TRPV4 se expresa transitoriamente en células de mamífero en cultivo (HEK, CHO, HeLa) y el surgimiento de interior [Ca 2 +] sobre agonista o estimulación hipotónica está registrada con el colorante fluorescente sensible a Ca + 2, Fura-2. El exceso de confianza en este ensayo fluorométrico ha sido criticada 1. El nivel de expresión en diferentes poblaciones, necesita ser controlado y documentado la distribución en el mismo, así como la concentración de colorante eficaz,. Más fiable es los exámenes electrofisiológicos directos. Incluso esto, como commonly practica, también no está exenta de problemas. Debido a que los niveles de expresión en células cultivadas individuales son difíciles de controlar, las corrientes de células enteras tienen grandes variaciones. Además, puesto que las corrientes son pequeñas, las estadísticas fiables tendrán que depender de muestras de gran tamaño, a menudo no es práctico. Rara vez se han realizado los exámenes Patch-clamp. Algunas de estas grabaciones muestran racimos de estallidos de actividad que componen la evaluación estadística desafiante 16,17.

Para comprender mejor el mechanosensitivity molecular, se han desarrollado dos sistemas adicionales para examinar TRPV4. (1) Para aislar TRPV4 lejos de sus socios de mamíferos habituales, hemos expresado TRPV4 rata en ciernes de levadura 24. La expresión funcional de TRPV4 en este contexto evolutivamente distantes mostró que aún podría responder a la fuerza osmótica sin sus socios habituales. Debido a que la levadura no hace PUFAs como AA o EET, y su genoma no tiene genes PLA2 o epoxigenasa, esta expression también muestra que no se requieren para TRPV4 para detectar la fuerza. Tener TRPV4 en los eucariotas biológicamente más susceptibles moleculares también permite la manipulación eficiente de avanzar-o revertir-genéticos 25. (2) Para los análisis biofísicos en profundidad de TRPV4, expresamos TRPV4 en ovocitos de Xenopus. A diferencia de las células cultivadas, que producen sub-nA a nA (10 -10 a 10 -9 A) corrientes, un oocito expresa corrientes en μA de (10 -6 a 10 -4 A). Señal mucho más grande sobre el ruido permite una mejor cuantificación y la comparación con más confianza. TRPV4, así expresado, también se puede examinar como moléculas individuales utilizando un patch clamp. Un único ovocito permite el muestreo de parches repetido, de nuevo haciendo una cuantificación más fiable. Estos estudios mostraron que la propia canal TRPV4 directamente puede ser activado por fuerza de estiramiento de la membrana 14. Los análisis también mostraron que 14 alelos representativos esquelético-displasia son todas las mutaciones con ganancia de función. Además, el degree de este constitutiva Ca 2 + fugas es paralelo a la gravedad de las enfermedades esqueléticas 23.

Debido a su novedad y utilidad, los procedimientos detallados de estos dos métodos se ensamblan aquí para permitir repeticiones en futuras investigaciones sobre TRPV4 o canales similares.

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Protocol

1. Métodos luminometría Levadura

Utilice cepa BYYT de Saccharomyces cerevisiae. Es un yvc1-tok1-derivado de BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformar las células con los plásmidos pEVP1/Aeq Aequorina que expresan-Leu seleccionable y la rata TRPV4-expresión de plásmido-ura seleccionable p416GPDV4, como se describe en Batiza et al. 26 y Loukin et al. 24 Use métodos estándar de la construcción del plásmido y la transformación 27 . La cepa de levadura y plásmidos están disponibles bajo petición.

  1. Cultura 2 ml de células de levadura durante toda la noche a fase de post-logarítmica en un agitador 30 ° C en Leu-URA-"DCD" medio de abandono 28 (una variante sulfato-empobrecido del medio de CMD-Leu-ura 29), suplementado con sorbitol 1M . Inocular 200 l de estos cultivos en 1,8 ml de medio fresco suplementado con 2 mM de la Luciferin coelenterazina. Crecer en la oscuridad a temperatura ambiente durante otras 24 horas sin agitación.
  2. Medir la osmolaridad de la cultura (típicamente a 1400 mOsM) y otras soluciones (a continuación) utilizando un osmómetro de presión de vapor.
  3. Alícuota de 20 l de cultivo fresco en un tubo luminómetro 12 mm para un solo tubo luminómetro.
  4. Para el choque hipotónico, añadir 200 l de una solución, que contiene 25 mM de NaEGTA (pH 7,2) o nombres (pH 7,2) y NaCl 500-100 mM, (osmolaridad total de 1,200-400 mOsM) dependiendo del grado de descarga deseada. Monitorear continuamente la luminiscencia antes y por lo menos 120 segundos después de la downshock osmótica, sólo interrumpido por la breve operación de dilución. Registro de salida luminómetro en un ordenador de escritorio como unidades relativas de luminiscencia (RUL).

Aunque no para el estudio de TRPV4 transgénico, hemos utilizado una variante del protocolo anterior en un sistema automatizado para examinar las respuestas de un gran número de cepas de levadura. Estudio of las respuestas a la hipo-30 o hiperosmóticos 31 estímulos del deletome levadura (la colección de 4906 de la levadura deletants de un solo gen) utilizando un luminómetro de microplacas y analizadas con el software correspondiente ha sido un éxito.

2. y 3. Métodos de ovocitos Electrofisiología

Electrofisiología utiliza métodos básicos 32. PCR amplificar el marco de lectura abierta de tipo salvaje o mutante TRPV4 utilizando alta fidelidad PfuUtra polimerasa e integrado en pGH19 33. Esto implica una inserción precisa de la ORF entre los 5 'y 3' UTRs de el gen β-globina de Xenopus y aguas abajo de un promotor de la ARN-polimerasa de T7. Linealizar el constructo de aguas abajo de la UTR 3 'y utilizado como plantillas en una reacción in vitro de la polimerasa de ARN de T7 en. Utilizar técnicas de biología molecular estándar 34.

Utilice ovocitos V-VI de la etapa de X. laevis. La cría de animales, ovariecto parcialmi, la eliminación del sobre defolliculation y vitelina siga los procedimientos estándar 32,33,35. Inyectar 2-40 ng de ARNc por oocito solución usando un microinyector automática Drummond Nanoinject II. Inyectar ~ 30 ovocitos por cada conjunto de experimentos. Después de la inyección de ARNc de TRPV4-, incubar los ovocitos en el medio ND96 con gentamicina (100 mg / ml) y 1 M rojo de rutenio 14.

2. Dos Electrodo abrazadera de voltaje

  1. Tire de borosilicato pipetas de registro de vidrio de precisión desechables Micropipetas 100 l individualmente con un extractor de pipeta.
  2. Tire tanto voltaje de medición y electrodos de pipeta corrientes inyección se tiran a tener una abertura punta de ~ 1 m de diámetro.
  3. Electrodos de reposición con 2 M KCl resultante en 0,1-0,2 resistencia mΩ. Montarlos en Headstages HS2A, que junto con una abrazadera de baño virtual con conexión a tierra VG-2Ax100, están conectados a una interfaz GeneClamp 500 amplificador a través de un digitalizador Digidata 1440. Adquirir datos utilizando el software pClamp10.
  4. Coloque el ovocito para ser probado en un baño de 1 ml en una cámara de plástico fabricada montada en el escenario de un microscopio de disección con 20 aumentos. La solución del baño es virtual a tierra por un puente de agar 3 M KCl y un cable de plata clorada colocado cerca del ovocito y conectado a una etapa de tierra virtual VG-2A.
  5. Construir la cámara para la perfusión continua con tubos de plástico como de entrada y salida de solución. Conectar el tubo de entrada está conectado a un sistema de perfusión fabricada, que es un múltiple de seis conchas 50 ml de jeringa, cada uno lleno con una solución diferente. Tipos de alimentación por gravedad de cualquier solución particular se controla para ~ 2-3 ml / min utilizando "Keck" abrazaderas de rampa en los tubos.
  6. Montar los dos electrodos con sus Headstages sobre micromanipuladores. Realice las penetraciones de electrodo del ovocito por micromanipulación.

3. Patch Clamp Examen de directo mecanosensibilidad

"> Los métodos básicos de patch clamp incluyendo la preparación de la pipeta, la formación GΩ-sello, y formación de en-célula o modos extirpados son aquellos en los Hamill et al. 36 y Conn 32.

  1. Llenar pipetas de vidrio de borosilicato con una abertura ~ 1 m de diámetro en la punta (número de burbujas 5-6) con 98 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, y 10 mM de K +-HEPES, pH 7,2.
  2. Coloque la pipeta de pinzamiento zonal a través de un tubo de plástico a una jeringa de 5 ml y por medio de una junta en T, también a un manómetro. Utilice un ordenador para manejar tanto el electrodo y las salidas de manómetro. Adquirir datos a 10 kHz, y luego jugar de nuevo a través de un filtro de ocho polos Bessel a 1 kHz para el análisis.
  3. Diferentes parches pueden ser extirpados de la misma ovocito repetidamente. Esta práctica hace que el análisis de la actividad molecular de TRPV4 más eficiente y confiable.

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Representative Results

En un experimento típico luminometría, una gama de 400-1,200 mOsM choques hipotónicas abajo se logra mediante la adición de 200 l de soluciones de choque de diferente osmolaridad baja a 20 l de cultivo a 1.400 mOsM. La actividad TRPV4 es evidente cuando el RLU de la experimental se comparó con la de dos controles negativos: células de levadura transformadas con el plásmido p416GPDV4 vacía o una que contiene el gen TRPV4 con una mutación en el filtro de iones (Figura 1) 24.

En un típico experimento de dos electrodos de fijación de voltaje, los oocitos se bañan inicialmente en un baño de solución isotónica que fluye que contiene (en mM) 66 KMeSO 4, 1.8 Ba (meso 4) 2, 5 K +-HEPES (pH 7,2) y 100 de sorbitol. Corrientes de pico son evaluados al final de pulsos de prueba 100 ms a 20 mV desde un potencial de mantenimiento de -20 mV cada 10 seg. Para provocar respuestas hipotónicas flujo se cambia a una solución similar que carece de sorbitol. T su respuesta hipotónica es reversible al regreso de sorbitol, así como bloqueable por el PRT-canal rojo de rutenio bloqueador (Figura 2A).

En un típico experimento de patch-clamp, se utiliza solución simétrica, es decir, la solución de baño el parche y la solución de la pipeta de llenado son el mismo (98 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, y 10 mM de K +-HEPES, pH 7,2). En este caso, el parche de dentro a fuera extirpado de una expresión de ovocitos de ratas TRPV4 se llevó a cabo en 50 mV. Los pulsos de succión se generan a partir de la jeringa. Succiones breves, cientos de milisegundos de duración, aplicado a decenas de mm Hg, suscitar el ~ 40 pS conductancia unitaria nativa de la membrana del ovocito y el 37 ~ 90 pS conductancia unitaria del TRPV4 heteróloga expresada (Figura 2B) 14.

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Figura 1. Rata TRPV4 expresada en la levadura responden al choque hipotónico. (A) Un diagrama que muestra los métodos experimentales. (B) Un choque hipotónico 750 mOsM (cabezas de flecha) provoca un aumento de la luminiscencia grande (en unidades relativas de luminiscencia, RLU) en transformantes TRPV4, pero no en los transformantes de un plásmido vacío, o plásmido teniendo un TRPV4 con una mutación en su filtro de iones (M680K). (C) Una relación dosis-respuesta entre choque hipotónico y la respuesta del pico (media + SD, n = 3). Las mediciones de 2,4 x 10 6 células cada 24. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 2. Exámenes electrofisiológicos de la actividad TRPV4 expresan heteróloga oocitos de Xenopus. (A) respuestas macroscópicas corriente enteros ovocito a estímulos hipotónicos examinados con una fijación de voltaje de dos electrodos. Corrientes de pico de un ovocito que expresan niveles muy altos de tipo salvaje TRPV4 (5 días después de la inyección de 40 ng de ARNc) a pasos de voltaje de 100 ms (-20 a 20 mV cada 10 segundos) (recuadro) en respuesta a la eliminación de sorbitol 100 mM de la solución de 250 baño mOsM (barras blancas) y la adición de 3 rutenio rojo M (RUR; lleno bar). Evidente son los repetidos aumentos de pico actuales sobre estímulos hipotónicos y sus disminuciones sobre el regreso a la solución isotónica o la adición del bloqueante de los canales (RUR). (B) la activación directa de los de tipo salvaje TRPV4 por el estiramiento de la membrana se observan con un patch clamp. Una muestra de restos crudos de calidad media de un parche extirpados de un ovocito TRPV4-expreesssing, mostrando activación por succión 60 mmHg (trazo inferior) aplicado a un parche extirpado de dentro a fuera celebrado en 50 mV. La traza superior se visualiza en una base de tiempo más rápido para mostrar la actual transición entre unitaria cerrada (C) y dos niveles abiertos (O 1 y O 2) 14. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Discussion

Como se dijo en la introducción, los métodos comúnmente utilizados para estudiar las funciones TRPV4 veces resultaron en inconsistencias y controversias. Los dos conjuntos de métodos descritos aquí ofrecen algunas ventajas y pueden complementar los métodos existentes. Mientras describimos sólo los estudios sobre TRPV4, los métodos pueden ser extendidos para estudiar otros canales iónicos también.

1. Métodos luminometría Levadura

Levadura en ciernes tiene una Ca 2 +-afluencia respuesta nativa de choque hipo osmótico que está sensibilizada por las mutaciones que afectan a la composición de lípidos 30. Esta señal se puede borrar con EGTA externo. Este quelante, sin embargo, no borrar la señal de la TRPV4 heteróloga expresada 24, lo que indica que el canal se expresa en una membrana interna, más probable es la del retículo endoplasmático, desde el que el Ca 2 + se libera en el citoplasma de la osmótica shock. Tráfico de manera heteróloga expresadacanales no se ha estudiado en la levadura. En caso de que este método puede ampliar el estudio de otros canales TRP u otros canales mechanosensitive putativo, la prueba de quelación necesita ser llevado a cabo y la presencia del sistema nativo que tener en cuenta.

2A. De dos electrodos abrazadera de voltaje

A diferencia del experimento de patch-clamp, la de dos electrodos experimento de fijación de voltaje se lleva a cabo en oocitos intactos, antes de la eliminación de la envoltura vitelina. Tanto el examen microscópico y valores de capacidad indican que la membrana de plasma no es uniformemente esférica pero se invagina alta por debajo de la esfera relativamente inelástica de la envoltura vitelina. De este modo, la tensión mecánica causada por hyponicity no es simplemente una tensión inflacionaria isotrópica de una membrana plasmática esférica ampliado. Los probables de estrés resultados del prensado de la membrana contra la envoltura vitelina de restricción y / o lejos de la unión citoplásmica establecido en the frente al aumento de la presión osmótica.

Expresión de TRPV4, y probablemente algunos otros canales, es tóxico para el ovocito, presumiblemente debido a Ca 2 + fugas. Es por lo tanto importante para incubar continuamente el ovocito después de la inyección de ARNc de TRPV4-en la presencia del bloqueador de los canales, rojo de rutenio. El grado de expresión TRPV4 muestra la variabilidad, que no está completamente bajo control experimental. Canales TRPV4 mutantes, los que muestran apertura espontánea significativa, se expresan de manera sistemática "ganancia de función" anteriormente después de la inyección que su homólogo de tipo salvaje 23.

2B. Patch Clamp

Xenopus ovocitos expresa un canal nativo mechanosensitive, que rectifica en el sentido hacia el interior (~ 50 pS hacia adentro, ~ 10 pS hacia afuera). Un estudio sugiere que es la expresión de TRPC1 37. Este canal nativo expresado constantemente ofrece una calibración para TRPV4, la heteroexpresión logous de los cuales no siempre se observa con éxito en los parches.

La probabilidad de encontrar TRPV4 tiende a ser mayor en ovocitos después de un período de incubación más largo, típicamente 3-4 días después de la inyección de ARNc. Una forma eficiente de proceder es realizar primero el experimento de dos electrodos-de fijación de voltaje (arriba), asegurándose de que el ovocito está expresando la TRPV4 corriente macroscópica espontánea y, a continuación, proceder a eliminar el sobre vitelina antes de tomar los parches de muestra de la misma ovocito. La probabilidad de capturar las actividades TRPV4 también se puede mejorar usando "macropatches", montados en pipetas con orificios más grandes (número de burbujas 6-7). Fuego pulir estas pipetas 32 ​​parece ser útil para lograr el sello GΩ. Después de la formación del sello, el parche extirpado puede mostrar una resistencia muy alta, muy poco ruido por lo general asociados con las membranas biológicas, y ninguna actividad del canal natal. Esto es más probable endica una formación de doble membrana. Una breve exposición al aire, por la elevación transitoria de la pipeta por encima del menisco por micromanipulación generalmente puede romper la capa adicional no deseado. Alternativamente, la capa externa se puede quitar tocando suavemente el orificio de la pipeta contra un hilo de junta de silicona endurecido suspendida en el baño.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Andrea Kremsreiter por su excelente asistencia técnica. El trabajo en nuestro laboratorio es apoyado por el NIH GM096088 y el Vilas Confianza de la Universidad de Wisconsin - Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Luminométricos levadura y<em&gt; Xenopus</em&gt; ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4
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Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

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