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Biology

खमीर Luminometric और Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

TRPV4 का अध्ययन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों के पूरक हैं, दो तरीकों से वर्णित हैं: अपने mechanosensitivity हाइपो आसमाटिक चुनौती पर ट्रांसजेनिक खमीर में सीए 2 + aequorin luminometry द्वारा अध्ययन किया जा सकता है. यह भी TRPV4 शाही सेना में जांच की जा सकती है पर सेल या excised मोड में दबाना पूरे सेल दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना या पैच द्वारा Xenopus oocytes इंजेक्शन.

Abstract

TRPV4 (क्षणिक रिसेप्टर क्षमता, vanilloid परिवार, प्रकार 4) व्यापक रूप से कशेरुकी ऊतकों में व्यक्त किया जाता है और यांत्रिक बलों द्वारा सहित कई उत्तेजनाओं, द्वारा सक्रिय है. कुछ TRPV4 उत्परिवर्तन मानव में जटिल वंशानुगत हड्डी या neuronal विकृतियों का कारण. जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती TRPV4 transgenes सामान्यतः सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की और Fura-2 fluorometry द्वारा और इलेक्ट्रोड से जांच कर रहे हैं. Mechanosensitivity और रोगों की आणविक अड्डों के तंत्र के संदर्भ में, वर्तमान साहित्य भ्रामक और विवादास्पद है. मौजूदा तरीकों के पूरक हैं, हम TRPV4 की आणविक संपत्तियों की जांच के लिए दो अतिरिक्त विधियों का वर्णन. (1) चूहा TRPV4 और एक aequorin transgene नवोदित खमीर में तब्दील कर रहे हैं. Transformant आबादी का एक hypo-osmtic झटका TRPV4 चैनल के माध्यम से जारी होने के कारण सीए 2 + साथ aequorin के संयोजन के लिए एक luminometric संकेत पैदावार. यहाँ TRPV4 अपने सामान्य स्तनधारी साथी प्रोटीन से अलग हैऔर अपनी ही mechanosensitivity का पता चलता है. (2) TRPV4 की क्रेना Xenopus oocytes में इंजेक्ट किया जाता है. ऊष्मायन के लिए एक उपयुक्त अवधि के बाद, macroscopic TRPV4 वर्तमान में एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप के साथ जांच की है. oocyte स्नान से निष्क्रिय osmoticum के हटाने पर मौजूदा वृद्धि mechanosensitivity का संकेत है. oocytes से microAmpere (10 -6 ए -4 10) धाराओं साफ quantifications और अधिक आत्मविश्वास आकलन उपज संवर्धित कोशिकाओं से nanoAmpere subnano से (10 -10 ए -9 से 10 तक) की धाराओं से ज्यादा बड़े होते हैं. व्यक्तिगत चैनल प्रोटीन की गतिविधियों को दर्शाती सूक्ष्म धाराओं भी सीधे पर सेल या excised मोड में, एक पैच दबाना के तहत पंजीकृत किया जा सकता है. एक ही oocyte बेहतर डेटा प्रतिकृति की अनुमति, कई पैच नमूने प्रदान करता है. पैच को लागू suctions सीधे mechanosensitivity का आकलन करने के लिए TRPV4 सक्रिय कर सकते हैं. इन तरीकों में भी टीआरपी चैनलों के अन्य प्रकार के अध्ययन में उपयोगी होना चाहिए.

Introduction

टीआरपी (क्षणिक रिसेप्टर क्षमता) का संवेदी कार्यों 1,2 कि सेवा कटियन चैनलों के सात subfamilies शामिल. स्तनधारियों, TRPV में, टीआरपी की vanilloid उपपरिवार, छह किस्मों की है. TRPV4 (प्रकार 4) गर्मी के लिए 3,4 जवाब है, कुछ रसायनों, आसमाटिक सूजन, या कतरनी तनाव. TRPV4 जीन बार बार उम्मीदवार जीन और / या 5-8 क्लोनिंग अभिव्यक्ति से अलग किया गया था. बाद विधि हाइपो-परासारिता लिए जीन उत्पाद की प्रतिक्रिया का पीछा किया. TRPV4 कई भिन्न प्रकार की कोशिकाओं 3,4 के विकास, फिजियोलॉजी, या विकृति में लगभग सभी अंगों और कार्यों में व्यक्त किया है.

हड़ताली परिधीय न्यूरोपैथी और / या कंकाल dysplasias (कंकाल विकास में असामान्यताएं) 9-11, जिससे> 50 मानव autosomal प्रमुख TRPV4 म्यूटेशनों हैं. कंकाल dysplasias लेकर कर हल्के brachyomia प्रकार 3 (टाइप -3 बौनापन), spondylometaphyseal dysplasia Kozlowski प्रकार, seve करने सेdysplasias फिर से, कुछ नवजात या भ्रूण मृत्यु के कारण. तंत्र के सभी शिष्टाचार संभव प्रतीत हालांकि, कोई भी विविधता, जटिलता, परिवर्तनशीलता, और इन रोगों 4 के कभार overlaps बताते हैं.

अन्य टीआरपी चैनलों 1 की तरह, TRPV4 एक tetramer है. चूहे या मानव TRPV4 में, प्रत्येक सबयूनिट 871 अवशेषों के शामिल है. इसका केंद्रीय तत्व छह transmembrane संभावना वोल्टेज gated कश्मीर + चैनलों के समान तरीके में व्यवस्थित कर रहे हैं जो एक हेलिक्स (S1-S6), है. वहाँ, S4 को S1 एक परिधीय डोमेन फार्म और S5 और S6 पारगमन ताकना डोमेन के रूप में. S5 और TRPV4 की S6 के बीच संभवतः कटियन फ़िल्टर बनाने के लिए एकाग्र जिनमें से चार अनुक्रम LDLFKLTIGMGDL इसके बाद एक छोटी ताकना हेलिक्स है. 470 अवशेषों एन टर्मिनल cytoplasmic खंड प्रोटीन या छोटे ligands बाध्य करने के लिए जाना जाता है 6 ankyrin दोहराता है, शामिल हैं. सी टर्मिनल 152 अवशेषों cytoplasmic खंड ओ.टी. कि बाँध अन्य संभावित स्थलों के बीच एक calmodulin बाध्यकारी अनुक्रम शामिलउसके तत्वों 3.

TRPV4 अनिवार्य रूप से anions 1 शामिल नहीं है कि एक कटियन चैनल है. अपनी शारीरिक समारोह सीए 2 + बाढ़ उत्तेजनाओं transduce के लिए है, यह एक पी सीए द्विसंयोजक पक्ष भी एक Eisenman चतुर्थ पारगम्यता अनुक्रम के साथ अन्य फैटायनों के लिए पारगम्य है: पी ना ~ 7 12. एकल चैनल प्रवाहकत्त्व ~ 90 ps जावक और ~ 40 ps आवक 6,13,14 पर rectifies. Heterologously व्यक्त (नीचे) वर्तमान हाइपो आसमाटिक सूजन, कतरनी तनाव, या गर्मी में 15 से सक्रिय किया जा सकता है. यह भी पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड 16,17 और सिंथेटिक phorbal एस्टर 18 4αPDD से सक्रिय है. वर्तमान में, दोनों उच्च throughput, छोटे आणविक स्क्रीन द्वारा की खोज की, 10 -9 -8 से 10 एम 20 में प्रभावी, सबसे शक्तिशाली एगोनिस्ट GSK1016790A 19 है और प्रतिपक्षी GSK2193874 है.

TRPV4 अनुसंधान के दो प्रमुख क्षेत्रों भ्रमित रहते हैं: (1) TRPV4 काफी हद तक इसके mechanosensitivity के लिए अध्ययन कर रहा है के रूप में भी, अपनी आणविक आधार विवादास्पद है. एक मॉडल, hypo-परासारिता किसी भी तरह एक epoxygenase द्वारा एसिड (EET) epoxyeicosatrienoic में बदल जाती है जो पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड (PUFA) arachidonic एसिड (एए), निर्माण करने के लिए phospholipase A2 (PLA2) सक्रिय हो जाता है, और EET के बंधन TRPV4 16 सक्रिय है वर्णन करता है 17. फिर भी, TRPV4 ही सीधे एक सरल व्याख्या उपलब्ध कराने, झिल्ली खिंचाव 14 (नीचे) के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है. (2) TRPV4 उत्परिवर्ती विकृतियों bewildering रहे हैं. फाउंडेशन, एक रोगों के झड़ने, कमी, या चैनल गतिविधियों की वृद्धि की वजह से कर रहे हैं कि क्या पता की जरूरत है. यहां भी, साहित्य स्पष्ट से दूर है. कई कंकाल-dysplasia alleles उच्च गतिविधियों की सूचना मिली है, जबकि (लाभ के समारोह, GOF) 4,21, कई गतिविधियों (नुकसान के समारोह, LOF) 10,22 कम कर दिया है की सूचना मिली. 14 alleles की एक व्यवस्थित अध्ययन करने के लिए उन्हें मिल गयासभी GOF जा म्यूटेशन (नीचे) 23. TRPV4 समारोह का एक पूरा नुकसान के बावजूद केवल मामूली दोष के साथ व्यवहार्य या उपजाऊ हैं जो पीटकर माउस,,, - कुछ LOFs दावा है कि TRPV4-/ के phenotype खंडन करने के लिए लगता है.

इन विवादों का एक हिस्सा पद्धति मूल है. प्रयोगशालाओं विभिन्न तरीकों, या एक विधि के संस्करण का उपयोग करें, और अलग पहचानने मानकों को रोजगार. सबसे अधिक, TRPV4 transiently (HEK, चो, हेला) और एगोनिस्ट या hypotonic उत्तेजना पर आंतरिक [2 Ca +] की वृद्धि सीए 2 + संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक, Fura-2 के साथ पंजीकृत है सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त किया है. इस fluorometric परख पर अधिक निर्भरता 1 आलोचना की गई है. विभिन्न आबादी में अभिव्यक्ति के स्तर, उसमें वितरण, साथ ही प्रभावी डाई एकाग्रता, नियंत्रित और दस्तावेज की जरूरत है. अधिक विश्वसनीय प्रत्यक्ष electrophysiological परीक्षाओं है. यहां तक ​​कि इस के रूप में commonlY अभ्यास, समस्याओं के बिना भी नहीं है. व्यक्तिगत संवर्धित कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हैं, क्योंकि पूरे सेल धाराओं बड़े बदलाव है. धाराओं छोटे हैं, क्योंकि इसके अलावा, विश्वसनीय आंकड़े अक्सर व्यावहारिक नहीं बड़े नमूना आकार, पर भरोसा करना होगा. पैच दबाना परीक्षाओं शायद ही कभी प्रदर्शन किया गया है. कुछ ऐसे रिकॉर्डिंग 16,17 सांख्यिकीय मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण बनाने कि गतिविधि फटने के समूहों को दिखाने के.

बेहतर आणविक mechanosensitivity समझते हैं, हम TRPV4 की जांच के लिए दो अतिरिक्त सिस्टम विकसित किया है. (1) दूर अपने सामान्य स्तनधारी भागीदारों से TRPV4 को अलग करने के लिए, हम खमीर 24 नवोदित में चूहे TRPV4 व्यक्त की है. इस evolutionarily दूर संदर्भ में TRPV4 के कार्यात्मक अभिव्यक्ति यह अभी भी अपने सामान्य भागीदारों बिना आसमाटिक बल का जवाब सकता था. खमीर ऐसे ए.ए. या EET रूप में कोई PUFAs बनाता है, और इसके जीनोम, इस expre कोई PLA2 या epoxygenase जीन है क्योंकिssion भी TRPV4 बल भावना के लिए के लिए वे आवश्यक नहीं कर रहे हैं कि पता चलता है. आणविक जीव विज्ञान के अनुसार सबसे अधिक उत्तरदायी eukaryotes में TRPV4 होने का भी कुशल आगे या रिवर्स आनुवंशिक जोड़तोड़ 25 की अनुमति देता है. (2) TRPV4 की गहराई biophysical विश्लेषण के लिए, हम Xenopus oocytes में TRPV4 व्यक्त किया. ना (10 -10 10 -9 ए) धाराओं के उप ना निकलेगा जो सभ्य कोशिकाओं के विपरीत, एक oocyte μA के (10 -6 -4 10 ए) में धाराओं को व्यक्त करता है. शोर पर बहुत बड़ा संकेत बेहतर मात्रा का ठहराव और अधिक विश्वास तुलना की अनुमति देता है. TRPV4, इसलिए व्यक्त की, यह भी एक पैच दबाना का उपयोग व्यक्तिगत अणुओं के रूप में जांच की जा सकती. एक एकल oocyte फिर मात्रा का ठहराव अधिक विश्वसनीय बनाने, दोहराया पैच नमूने की अनुमति देता है. इस तरह के अध्ययन TRPV4 चैनल ही सीधे झिल्ली खिंचाव बल 14 से सक्रिय किया जा सकता है कि दिखाया. विश्लेषण भी 14 प्रतिनिधि कंकाल-dysplasia alleles के सभी लाभ के समारोह म्यूटेशनों हैं कि पता चला है. इसके अलावा, degrइस विधान सीए 2 + रिसाव की ई कंकाल रोगों 23 की गंभीरता समानताएं.

क्योंकि उनके नवीनता और उपयोगिता की, इन दोनों तरीकों की विस्तृत प्रक्रियाओं TRPV4 या इसी तरह के चैनलों पर भविष्य के अनुसंधान में अनुकरण अनुमति देने के लिए यहां इकट्ठा कर रहे हैं.

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Protocol

1. खमीर Luminometry तरीके

Saccharomyces cerevisiae के तनाव BYYT का प्रयोग करें. यह BY4741 (माता, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4) की एक yvc1-tok1 व्युत्पन्न है. Batiza एट अल. 26 और Loukin एट अल. 24 में वर्णित के रूप में, लियू चयन aequorin व्यक्त प्लाज्मिड pEVP1/Aeq और ura चयन चूहे TRPV4 व्यक्त प्लाज्मिड p416GPDV4 साथ कोशिकाओं को बदलने प्लाज्मिड निर्माण और परिवर्तन 27 का प्रयोग मानक तरीकों . खमीर तनाव और plasmids अनुरोध पर उपलब्ध हैं.

  1. रात भर 1M sorbitol के साथ पूरक लियू-ura-"DCD" छोड़ने वालों मध्यम 28 (CMD-लियू-ura मध्यम 29 की एक सल्फेट समाप्त संस्करण), में एक 30 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन में बाद लघुगणक चरण के लिए खमीर कोशिकाओं की संस्कृति 2 मिलीलीटर . Luciferi के 2 माइक्रोन के साथ पूरक ताजा माध्यम से 1.8 मिलीलीटर में इन संस्कृतियों के 200 μl टीका लगानाn coelenterazine. झटकों के बिना एक और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में हो जाना.
  2. संस्कृति की परासारिता (नीचे) (आमतौर पर 1,400 mOsm) और अन्य समाधान एक वाष्प दबाव osmometer का उपयोग कर उपाय.
  3. विभाज्य 20 एक ट्यूब luminometer के लिए एक 12 मिमी luminometer ट्यूब में ताजा संस्कृति के μl.
  4. Hypotonic सदमे के लिए, वांछित सदमे की डिग्री के आधार पर 25 मिमी NaEGTA (पीएच 7.2) या नाम (पीएच 7.2) और 500-100 मिमी NaCl, (1,200-400 mOsm की कुल परासारिता) युक्त, एक समाधान के 200 μl जोड़ें. लगातार पहले luminescence पर नजर रखने और कम से कम 120 सेकंड आसमाटिक downshock के बाद, केवल संक्षिप्त कमजोर पड़ने आपरेशन से बाधित. रिश्तेदार luminescence इकाइयों (RUL) के रूप में एक डेस्कटॉप कंप्यूटर पर luminometer उत्पादन रजिस्टर.

नहीं ट्रांसजेनिक TRPV4 के अध्ययन के लिए हालांकि, हम खमीर उपभेदों की एक बड़ी संख्या की प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक स्वचालित प्रणाली में ऊपर प्रोटोकॉल का एक संस्करण का इस्तेमाल किया है. अध्ययन ओच हाइपो-30 या एक microplate luminometer का उपयोग खमीर deletome (4906 खमीर एकल जीन deletants का संग्रह) का hyperosmotic 31 उत्तेजनाओं को और इसी सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण प्रतिक्रियाओं सफल रहा है.

2. और 3. Oocyte इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी तरीके

इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी बुनियादी तरीकों में 32 का उपयोग करता है. पीसीआर जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती TRPV4 उच्च निष्ठा PfuUtra पोलीमर्स का उपयोग और pGH19 33 में एकीकृत का खुला पढ़ने फ्रेम बढ़ाना. इस Xenopus β ग्लोबिन जीन और एक T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर के बहाव के 5 और 3 'UTRs के बीच ओआरएफ का एक सटीक प्रविष्टि जरूरत पर जोर देता. 3 'UTR के बहाव और एक में इन विट्रो T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया में टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल निर्माण linearize. मानक आणविक जैविक तकनीक 34 का प्रयोग करें.

एक्स से चरण वी छठी oocytes का प्रयोग करें laevis. पशुपालन, आंशिक ovariectoमेरे, defolliculation, और पीतक लिफाफा हटाने मानक प्रक्रियाओं 32,33,35 का पालन करें. एक ड्रमंड Nanoinject द्वितीय स्वत microinjector का उपयोग oocyte प्रति क्रेना समाधान के 2-40 एनजी इंजेक्षन. ~ प्रयोगों के प्रत्येक सेट के लिए 30 oocytes इंजेक्षन. TRPV4-क्रेना इंजेक्शन के बाद, gentamicin (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ ND96 माध्यम में oocytes सेते और 1 माइक्रोन दयाता 14 लाल.

2. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप

  1. व्यक्तिगत रूप से एक विंदुक खींचने के साथ सटीक डिस्पोजेबल 100 μl micropipettes से borosilicate ग्लास रिकॉर्डिंग pipettes खींचो.
  2. वोल्टेज मापने और वर्तमान इंजेक्शन पिपेट इलेक्ट्रोड दोनों खींचो ~ 1 माइक्रोन व्यास की एक टिप एपर्चर है करने के लिए खींच रहे हैं.
  3. 2 एम KCl साथ बैकफ़िल इलेक्ट्रोड 0.1-0.2 mΩ प्रतिरोध में जिसके परिणामस्वरूप. एक साथ एक वी.जी. 2Ax100 आभासी जमीन स्नान क्लैंप के साथ, एक Digidata 1440 digitizer के माध्यम से एक GeneClamp 500 एम्पलीफायर इंटरफ़ेस से जुड़े हैं जो HS2A headstages, पर उन्हें माउंट. मोल pClamp10 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा.
  4. 20X बढ़ाई साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर घुड़सवार एक गढ़े प्लास्टिक कक्ष में 1 मिलीलीटर स्नान में परीक्षण किया जा oocyte रखें. स्नान समाधान आभासी पर आधारित एक 3 एम KCl अगर पुल और करीब oocyte के लिए रखा जाता है और एक वी.जी.-2A आभासी जमीन मंच से जुड़ा एक क्लोरीनयुक्त चांदी के तार से है.
  5. समाधान इनलेट और आउटलेट के रूप में प्लास्टिक tubings साथ निरंतर छिड़काव के लिए कक्ष का निर्माण. इनलेट ट्यूबिंग छह 50 मिलीलीटर सिरिंज के गोले, एक अलग समाधान के साथ भरा प्रत्येक के एक कई गुना है जो एक गढ़े छिड़काव प्रणाली से जुड़ा है कनेक्ट. किसी विशेष समाधान के गुरुत्व फ़ीड दरें नियंत्रित किया जाता है के लिए ~ 2-3 tubings पर "उबकना" रैंप clamps का उपयोग मिलीग्राम / मिनट.
  6. Micromanipulators पर उनके headstages साथ दोनों इलेक्ट्रोड माउंट. Micromanipulation द्वारा oocyte के इलेक्ट्रोड पेनेट्रेशन प्रदर्शन करना.

3. सीधी Mechanosensitivity के पैच दबाना परीक्षा

"> पिपेट तैयारी, GΩ सील गठन, और ऑन सेल या excised मोड के गठन सहित पैच दबाना की बुनियादी तरीकों Hamill में उन एट अल. 36 और क्ोन 32 हैं.

  1. 98 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, और 10 मिमी + K-HEPES, 7.2 पीएच के साथ नोक पर एक ~ 1 माइक्रोन व्यास खोलने (बुलबुला संख्या 5-6) के साथ borosilicate ग्लास pipettes भरें.
  2. यह भी एक दबाव नापने का यंत्र के लिए, एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक प्लास्टिक टयूबिंग के माध्यम से और एक टी संयुक्त के माध्यम से पैच दबाना पिपेट देते हैं. इलेक्ट्रोड और दबाव नापने का यंत्र outputs दोनों को संभालने के लिए एक कंप्यूटर का उपयोग करें. 10 kHz पर डेटा प्राप्त है, और फिर विश्लेषण के लिए 1 kHz पर एक आठ ध्रुव बेसल फिल्टर के माध्यम से वापस खेलते हैं.
  3. विभिन्न पैच बार बार एक ही oocyte से excised किया जा सकता है. इस अभ्यास TRPV4 के आणविक गतिविधि की परीक्षा में अधिक कुशल और विश्वसनीय बनाता है.

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Representative Results

एक ठेठ luminometry प्रयोग में, 400-1,200 mOsm नीचे hypotonic झटके से एक सीमा 1,400 mOsm में संस्कृति के 20 μl के लिए अलग कम परासारिता के सदमे समाधान के 200 μl जोड़कर हासिल की है. खमीर कोशिकाओं खाली p416GPDV4 प्लाज्मिड या आयन फिल्टर में एक उत्परिवर्तन (चित्रा 1) 24 के साथ TRPV4 जीन होता है कि एक साथ बदल: प्रयोगात्मक की RLU दो नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में है जब TRPV4 गतिविधि स्पष्ट है.

एक ठेठ दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना प्रयोग में, oocytes शुरू में (मिमी) से युक्त बह isotonic स्नान समाधान में स्नान कर रहे 66 KMeSO 4, 1.8 बीए (मेसो 4) 2, 5 + K-HEPES, (पीएच 7.2) और 100 sorbitol. शिखर धाराओं -20 एम वी हर 10 सेकंड के एक होल्डिंग क्षमता से 20 एमवी के लिए 100 मिसे परीक्षण दालों के अंत में मूल्यांकन कर रहे हैं. Hypotonic प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना प्रवाह sorbitol कमी एक ऐसी ही समाधान करने के लिए बदल गया है. टी उसकी hypotonic प्रतिक्रिया sorbitol की वापसी पर प्रतिवर्ती के साथ ही टीआरपी चैनल अवरोधक दयाता लाल (2A चित्रा) द्वारा blockable है.

पैच और पिपेट भरने समाधान स्नान समाधान एक ही (98 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, और 10 मिमी + K-HEPES, 7.2 पीएच) कर रहे हैं यानी एक ठेठ पैच दबाना प्रयोग में, सममित समाधान, प्रयोग किया जाता है. इधर, एक चूहे TRPV4 अभिव्यक्ति oocyte से excised अंदर बाहर पैच 50 एम वी पर आयोजित किया जाता है. चूषण की दलहन सिरिंज से उत्पन्न कर रहे हैं. संक्षिप्त suctions, अवधि में मिसे के सैकड़ों, oocyte झिल्ली 37 और heterologously व्यक्त TRPV4 (चित्रा 2 बी) का 14 ~ 90 ps एकात्मक प्रवाहकत्त्व के लिए ~ 40 ps एकात्मक प्रवाहकत्त्व मूल निवासी प्रकाश में लाना, एमएम एचजी की दसियों पर लागू होता है.

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चित्रा 1. चूहा TRPV4 hypotonic झटका करने के लिए खमीर जवाब में व्यक्त किया. (ए) प्रयोगात्मक विधियों दिखा आरेख. (बी) एक 750 mOsm hypotonic झटका (तीर सिर) TRPV4 transformants में (सापेक्ष luminescence इकाइयों, RLU में) एक बड़े luminescence वृद्धि हो सके, लेकिन नहीं एक खाली प्लाज्मिड, या प्लाज्मिड के transformants में अपने आयन फिल्टर (M680K) hypotonic सदमे और शिखर प्रतिक्रिया के बीच. (सी) एक खुराक प्रतिक्रिया संबंध में एक परिवर्तन के साथ एक TRPV4 असर (+ एसडी मतलब n = 3). 2.4 x 10 6 कोशिकाओं प्रत्येक 24 से माप. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. TRPV4 गतिविधि के electrophysiological परीक्षाओं heterologously Xenopus oocytes व्यक्त किया. एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप के साथ जांच की hypotonic उत्तेजनाओं को (ए) पूरे oocyte macroscopic वर्तमान हिमायती हैं. जंगली प्रकार TRPV4 के बहुत उच्च स्तर व्यक्त एक oocyte से शिखर धाराओं को हटाने के जवाब में (इनसेट) (-20 से 20 एमवी हर 10 सेकंड के लिए) 100 मिसे वोल्टेज कदम पर (5 दिनों क्रेना के 40 एनजी के इंजेक्शन के बाद) 250 mOsm स्नान समाधान (खुला सलाखों) और 3 माइक्रोन दयाता लाल (; भरा बार RUR) के अलावा से 100 मिमी sorbitol की. स्पष्ट isotonic समाधान या चैनल अवरोधक (RUR) के अलावा की वापसी पर hypotonic उत्तेजनाओं और इसके घटने पर दोहराया चोटी वर्तमान बढ़ जाती हैं. (बी) के एक पैच दबाना तहत देखा झिल्ली खिंचाव से जंगली प्रकार TRPV4 की सीधी सक्रियण. Acti दिखा एक TRPV4-expreesssing oocyte से excised एक पैच, से औसत गुणवत्ता के कच्चे निशान का नमूना60 mmHg सक्शन (कम ट्रेस) से छुपा 50 एम वी पर आयोजित एक excised अंदर बाहर पैच के लिए आवेदन किया. ऊपरवाला ट्रेस बंद (सी) के बीच एकात्मक वर्तमान संक्रमण को दिखाने के लिए एक तेजी से समय के आधार पर प्रदर्शित और दो ​​खुली स्तर (ओ 1 और ओ 2) 14. है बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

परिचय में कहा गया है, आमतौर पर TRPV4 कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों कभी कभी विसंगतियों और विवादों में हुई. यहाँ वर्णित विधियों में से दो सेट कुछ लाभ प्रदान करते हैं और मौजूदा तरीकों पूरक कर सकते हैं. हम TRPV4 पर ही पढ़ाई का वर्णन करते हुए तरीके के रूप में अच्छी तरह से अन्य आयन चैनल का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

1. खमीर Luminometry तरीके

नवोदित खमीर लिपिड रचना 30 को प्रभावित करने वाले परिवर्तन से अवगत है कि हाइपो आसमाटिक सदमे से एक देशी सीए 2 + बाढ़ प्रतिक्रिया है. यह संकेत बाहरी EGTA साथ मिटाया जा सकता है. इस chelator, हालांकि, चैनल एक आंतरिक झिल्ली में व्यक्त की है कि यह दर्शाता है, heterologously व्यक्त TRPV4 24 से संकेत मिटा नहीं है, सबसे अधिक संभावना सीए 2 + आसमाटिक पर cytoplasm में जारी की है, जिसमें से जालिका, की है कि झटका. Heterologously व्यक्त की आवागमनचैनलों खमीर में अध्ययन नहीं किया गया. इस विधि के अन्य टीआरपी चैनलों या अन्य ख्यात mechanosensitive चैनलों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जाना चाहिए, केलेशन परीक्षण बाहर ले जाने के लिए और देशी प्रणाली की उपस्थिति मन में वहन किया जाना जरूरी है.

2A. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप

पैच दबाना प्रयोग के विपरीत, दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना प्रयोग पीतक लिफाफा को हटाने से पहले, अक्षत oocyte पर किया जाता है. सूक्ष्म परीक्षण और क्षमता दोनों मान प्लाज्मा झिल्ली समान रूप से गोलाकार नहीं है लेकिन उच्च पीतक लिफाफा के अपेक्षाकृत स्थिर क्षेत्र के नीचे invaginated है कि संकेत मिलता है. इस प्रकार, hyponicity के कारण यांत्रिक तनाव का विस्तार एक गोलाकार प्लाज्मा झिल्ली की बस एक isotropic मुद्रास्फीति तनाव नहीं है. दूर वीं में स्थापित cytoplasmic लगाव से बाधा पीतक लिफाफा और / या खिलाफ झिल्ली के दबाव से तनाव की संभावना परिणामवृद्धि की आसमाटिक दबाव के ई चेहरा.

TRPV4 की अभिव्यक्ति है, और संभावना कुछ अन्य चैनलों, शायद कारण सीए 2 + रिसाव के लिए, oocyte को विषाक्त है. यह लगातार चैनल ब्लॉकर, दयाता लाल की मौजूदगी में TRPV4-क्रेना इंजेक्शन के बाद oocyte सेते हैं इसलिए महत्वपूर्ण है. TRPV4 अभिव्यक्ति की डिग्री प्रयोगात्मक नियंत्रण में पूरी तरह नहीं है, जो परिवर्तनशीलता से पता चलता है. "लाभ के समारोह" उत्परिवर्ती TRPV4 चैनलों, महत्वपूर्ण सहज उद्घाटन चलता है कि उन व्यवस्थित पहले इंजेक्शन के बाद उनके जंगली प्रकार के समकक्ष 23 से व्यक्त कर रहे हैं.

2 बी. पैच दबाना

Xenopus oocyte आवक दिशा में rectifies जो एक देशी mechanosensitive चैनल, (~ 50 ps आवक, ~ 10 ps जावक) व्यक्त करता है. एक अध्ययन में यह TRPC1 37 की अभिव्यक्ति है कि पता चलता है. यह लगातार व्यक्त देशी चैनल TRPV4, hetero के लिए एक अंशांकन प्रदान करता हैजिनमें से logous अभिव्यक्ति हमेशा सफलतापूर्वक पैच में नहीं देखा जा सकता है.

TRPV4 का सामना करने की संभावना आम तौर पर 3-4 दिनों क्रेना इंजेक्शन के बाद, ऊष्मायन की एक लंबी अवधि के बाद oocytes में अधिक हो जाता है. आगे बढ़ने के लिए एक कारगर तरीका पहले oocyte उसी से नमूना पैच लेने से पहले पीतक लिफाफा दूर करने के लिए आगे बढ़ना है तो सहज TRPV4 macroscopic वर्तमान व्यक्त, और है, यकीन है कि दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना प्रयोग (ऊपर) प्रदर्शन करने के लिए है oocyte. TRPV4 गतिविधियों पर कब्जा करने की संभावना भी बड़ा तंग करती है (बुलबुला संख्या 6-7) के साथ pipets पर घुड़सवार "macropatches", का उपयोग बढ़ाया जा सकता है. इन pipettes 32 चमकाने आग GΩ मुहर प्राप्त करने में सहायक हो रहा है. सील गठन के बाद, excised पैच, एक बहुत ही उच्च प्रतिरोध दिखा सकते हैं बहुत कम आमतौर पर जैविक झिल्ली के साथ जुड़े शोर, और कोई देशी चैनल गतिविधि. में यह सबसे अधिक संभावनाएक डबल झिल्ली गठन dicates. एक संक्षिप्त हवा जोखिम, क्षणिक micromanipulation द्वारा meniscus ऊपर पिपेट उठाने के द्वारा आमतौर पर अवांछित अतिरिक्त परत को तोड़ सकता है. वैकल्पिक रूप से, बाहरी परत धीरे स्नान में निलंबित कठोर सिलिकॉन मुहर का एक धागा खिलाफ पिपेट बोर छू द्वारा हटाया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एंड्रिया Kremsreiter धन्यवाद देना चाहूंगा. मैडिसन - हमारी प्रयोगशाला में काम एनआईएच GM096088 और विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के विलास ट्रस्ट द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 82 Eukaryota आर्किया जीवाणु जीवन विज्ञान (सामान्य) Mechanosensation आयन चैनल लिपिड पैच दबाना, खमीर luminometry बल संवेदन वोल्टेज दबाना TRPV4 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
खमीर Luminometric और<em&gt; Xenopus</emTRPV4 की आण्विक Mechanosensitivity के&gt; Oocyte Electrophysiological परीक्षा
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Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

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