Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Luminometric الخميرة و Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

لاستكمال الأساليب المستخدمة شيوعا لدراسة TRPV4، ويتم وصف طريقتين: mechanosensitivity ويمكن لها أن تدرسها كا 2 + luminometry-aequorin في الخميرة المعدلة وراثيا على التحدي للفراش لا تسبب الاسموزي. فإنه يمكن أيضا أن تدرس في TRPV4-RNA حقن البويضات القيطم من قبل خلية كاملة يومين الجهد الكهربائي المشبك المشبك أو التصحيح في خلية أو في وضع رفعه.

Abstract

وأعرب عن TRPV4 (عابر مستقبلات الإمكانيات، والأسرة vanilloid، نوع 4) على نطاق واسع في أنسجة الفقاريات ويتم تفعيلها من خلال العديد من المحفزات، بما في ذلك القوات الميكانيكية. الطفرات TRPV4 معينة يسبب العظام وراثية معقدة أو الأمراض العصبية في الإنسان. وأعرب البرية من نوع أو متحولة الجينات المحورة TRPV4 عادة في خلايا الثدييات مثقف وفحصها من قبل FURA-2 قياس التألق والأقطاب الكهربائية. من حيث آلية mechanosensitivity والأسس الجزيئية للأمراض، والأدب الحالي هو مربكة ومثيرة للجدل. لاستكمال الأساليب القائمة، ونحن تصف طريقتين إضافية لدراسة الخصائص الجزيئية للTRPV4. (1) يتم تحويلها الجرذ TRPV4 والتحوير aequorin في مهدها الخميرة. صدمة للفراش لا تسبب osmtic من السكان المحولة تعطي إشارة luminometric بسبب مزيج من aequorin مع كا 2 +، الذي صدر من خلال قناة TRPV4. هنا يتم عزل TRPV4 من البروتينات شريك الثدييات المعتادةويكشف mechanosensitivity الخاصة. (2) يتم حقن كرنا من TRPV4 في البويضات القيطم. بعد فترة مناسبة من الحضانة، يتم فحص TRPV4 الحالية العيانية مع الجهد المشبك يومين القطب. الارتفاع الحالي على إزالة osmoticum خاملة من الحمام البويضة يدل على mechanosensitivity. ومكرو أمبير (10 -6 إلى 10 -4 أ) التيارات من البويضات تكون أكبر بكثير من subnano إلى nanoAmpere (10 -10 إلى 10 -9 A) التيارات من الخلايا المستزرعة، مما أسفر عن quantifications أكثر وضوحا وأكثر ثقة المقررة. ويمكن أيضا أن التيارات المجهرية التي تعكس أنشطة البروتينات قناة الفردية تكون مسجلة مباشرة تحت المشبك التصحيح، في على خلايا أو وضع رفعه. يوفر نفس البويضة عينات التصحيح متعددة، مما يسمح نسخ البيانات على نحو أفضل. يمكن تطبيقها على الشحوم بقع تفعيل TRPV4 لتقييم mechanosensitivity مباشرة. ينبغي أيضا أن تكون هذه الأساليب مفيدة في دراسة أنواع أخرى من القنوات TRP.

Introduction

تضم الحزب الراديكالي عبر الوطني (إمكانات مستقبلات عابرة) سبعة تحت العوائل من القنوات الموجبة التي تخدم الوظائف الحسية 1،2. في الثدييات، TRPV، فصيلة vanilloid من الحزب الراديكالي عبر الوطني، لديه ستة أصناف. TRPV4 (نوع 4) 3،4 يستجيب للحرارة وبعض المواد الكيميائية، وتورم التناضحي، أو إجهاد القص. تم عزل الجين TRPV4 مرارا وتكرارا من قبل مرشح الجينات و / أو التعبير استنساخ 5-8. يتبع الأسلوب الأخير استجابة الجين المنتج لقصور الأسمولية. وأعرب عن TRPV4 في ما يقرب من جميع الأجهزة وظائف في تطوير وظائف الأعضاء، علم الأمراض أو من العديد من أنواع الخلايا المختلفة 3،4.

لفتا هي> 50 جسمية الإنسان الطفرات TRPV4 المهيمنة، مما تسبب اعتلال الأعصاب الطرفية و / أو خلل التنسج العظمي (تشوهات في الهيكل العظمي التنمية) 9-11. خلل التنسج العظمي تتراوح بين معتدلة نوع brachyomia 3 (نوع 3 التقزم) وخلل التنسج spondylometaphyseal نوع كوزلوفسكي، لسفإعادة خلل التنسج، مما تسبب في بعض وفيات الولدان أو الجنينية. على الرغم من جميع الخلق من الآليات يبدو ممكنا، لا شيء يفسر التنوع والتعقيد، وتقلب، والتداخل في بعض الأحيان من هذه الأمراض 4.

مثل القنوات الأخرى TRP 1، TRPV4 هو tetramer. في الفئران أو TRPV4 الإنسان، يتكون كل الوحيدات من 871 المخلفات. العنصر المركزي هو الغشاء ستة من اللوالب (S1-S6)، والتي من المرجح رتبت بطريقة مشابهة لK + قنوات الجهد بوابات. هناك، S1 إلى S4 تشكيل المجال الطرفية وS5 S6 وتشكل المجال تخلل المسام. S5 S6 بين وTRPV4 من هو الحلزون المسام قصيرة تليها LDLFKLTIGMGDL تسلسل، أربعة منها تتلاقى يفترض أن يشكل مرشح الموجبة. و470-بقايا الجزء حشوية N-محطة يحتوي على 6 يكرر ankyrin، والمعروف أن ربط البروتينات أو بروابط صغيرة. ويشمل الجزء حشوية 152-C-بقايا محطة تسلسل ملزمة كالمودولين بين المواقع المحتملة الأخرى التي تربط التمديدعناصر لها 3.

TRPV4 هي قناة الموجبة التي تستثني أساسا الأنيونات 1. بينما وظيفتها الفسيولوجية هو تنبيغ المحفزات لكا 2 + تدفق، بل هو أيضا قابلة للاختراق لالكاتيونات الأخرى مع تسلسل نفاذية آيزنمان الرابع، لصالح ثنائي التكافؤ في كاليفورنيا P: P نا ~ 7 12. يصحح على قناة واحدة تصرف في ~ 90 ~ PS الخارج والداخل 40 PS 6،13،14. أعرب Heterologously الحالية (أدناه) يمكن تفعيلها من خلال الاسموزي للفراش لا تسبب تورم، وإجهاد القص، أو الدفء 15. يتم تنشيط أيضا من قبل الأحماض الدهنية غير المشبعة و16،17 استر phorbal الاصطناعية 4αPDD 18. في الوقت الحاضر، وناهض هو أقوى GSK1016790A 19 وخصم هو GSK2193874 وفعالة في 10 -9 إلى 10 -8 M 20، وكلاهما اكتشف بواسطة الإنتاجية العالية، وشاشة صغيرة الجزيئية.

يظل مجالين رئيسيين للبحوث TRPV4 مربكة: (1) وحتى يتم دراسة TRPV4 إلى حد كبير عن mechanosensitivity لها، أساسها الجزيئي أمر مثير للجدل. يصف نموذج واحد قصور الأسمولية ينشط بطريقة أو بأخرى فسفوليباز A2 (PLA2) لإنتاج حمض غير مشبع الدهنية (بوفا) حمض الأراكيدونيك (AA)، والتي يتم تحويلها إلى حمض epoxyeicosatrienoic (EET) من قبل epoxygenase، وربط EET ينشط TRPV4 16، 17. بعد، وقد تبين TRPV4 نفسها للرد مباشرة على غشاء تمتد 14 (أدناه)، وتوفير أبسط تفسير. (2) وأمراض متحولة TRPV4 محيرة. في الأساس، ويحتاج المرء إلى معرفة ما إذا كانت الأمراض هي نتيجة لفقدان أو تخفيض، أو زيادة أنشطة القناة. حتى هنا، فإن الأدب هو أبعد ما يكون عن الوضوح. في حين تم الإبلاغ عن عدة الأليلات الهيكل العظمي، خلل التنسج لديك أنشطة العالي، (مكاسب من وظيفة، GOF) 4،21، تم الإبلاغ عن عدة أن ينخفض ​​الأنشطة (الخسارة من وظيفة، LOF) 10،22. دراسة منهجية ل14 الأليلات جدت لها أنجميع الطفرات أن صندوق القناص (أدناه) 23. الادعاء بأن بعضها LOFs يبدو أن تتعارض مع النمط الظاهري من trpV4 / - خروج المغلوب الماوس، والتي هي قابلة للحياة أو الخصبة، مع عيوب طفيفة فقط، على الرغم من خسارة كاملة من وظيفة TRPV4.

وهناك جزء من هذه الخلافات وأصله المنهجية. مختبرات استخدام أساليب مختلفة، أو أنواع من أسلوب واحد، وتوظيف معايير التحكيم المختلفة. الأكثر شيوعا، وأعرب عن TRPV4 عابر في خلايا الثدييات مثقف (كلوة الجنين البشري، شو، هيلا) مسجلة وصعود الداخلية [كا 2 +] على ناهض أو التحفيز ناقص التوتر مع كا 2 صبغة الفلورسنت الحساسة لل+، FURA-2. وقد انتقد الاعتماد المفرط على هذا الاختبار فلوروميتريك 1. مستوى التعبير في مختلف قطاعات السكان، والتوزيع فيه، فضلا عن تركيز الصبغة فعالة، يجب أن يكون للرقابة وتوثيقها. هو أكثر موثوقية الامتحانات الكهربية مباشرة. حتى هذا، كما commonlذ يمارس، هو أيضا لا يخلو من المشاكل. لأن مستويات التعبير في الخلايا المستزرعة الفردية هي من الصعب السيطرة عليها، والتيارات خلية كاملة لديها اختلافات كبيرة. أبعد من ذلك، لأن التيارات الصغيرة، وسوف إحصاءات موثوقة أن تعتمد على عينات كبيرة الحجم، غالبا ما تكون غير عملية. ونادرا ما أجريت فحوصات التصحيح، المشبك. تظهر بعض هذه التسجيلات مجموعات من رشقات نارية النشاط التي تجعل التقييم الإحصائية تحديا 16،17.

إلى فهم أفضل للmechanosensitivity الجزيئية، قمنا بتطوير نظامين إضافية لدراسة TRPV4. (1) لعزل TRPV4 بعيدا عن شركائها الثدييات المعتادة، أبدينا TRPV4 الفئران في مهدها الخميرة 24. أظهرت التعبير الوظيفي للTRPV4 في هذا السياق بعيدة تطويريا أنه لا يزال من الممكن الرد على القوة الاسموزي دون شركائها المعتادة. لأن الخميرة لا تقدم أي PUFAs مثل AA أو EET، والجينوم لا يوجد لديه PLA2 أو epoxygenase الجينات، وهذا expreيظهر ssion أيضا أن لا حاجة لها للTRPV4 لاستشعار القوة. وجود TRPV4 في حقيقيات النوى الجزيئية البيولوجية الأكثر قابلية يسمح أيضا التلاعب فعالة إلى الأمام أو عكس الوراثية 25. (2) لفي عمق التحليلات الفيزيائية الحيوية من TRPV4، عبرنا عن TRPV4 في البويضات القيطم. على عكس الخلايا المستزرعة، والتي تسفر الفرعية غ لنا (10 -10 إلى 10 -9 A) التيارات، بويضة عن التيارات في لأمبير (10 -6 إلى 10 -4 A). إشارة أكبر بكثير على الضوضاء يسمح أفضل الكمي والمقارنة أكثر ثقة. TRPV4، لذلك أعرب، ويمكن أيضا أن تدرس كما الجزيئات الفردية باستخدام المشبك التصحيح. A بويضة واحدة يسمح أخذ العينات التصحيح المتكررة، مرة أخرى مما يجعل الكمي أكثر موثوقية. وأظهرت هذه الدراسات أن TRPV4 قناة نفسها يمكن تفعيلها مباشرة بالقوة تمتد غشاء 14. وأظهرت التحاليل أيضا أن 14 ممثل الأليلات الهيكل العظمي، خلل التنسج كلها مكاسب من وظيفة الطفرات. علاوة على ذلك، degrه ه من هذا التسرب + التأسيسية كا 2 يوازي شدة الأمراض الهيكل العظمي 23.

لأن الجدة وجدواها، ويتم تجميع الإجراءات التفصيلية من هاتين الطريقتين هنا للسماح مكررات في البحوث المستقبلية على TRPV4 أو قنوات مماثلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. طرق Luminometry الخميرة

استخدام سلالة BYYT من خميرة الخباز. بل هو yvc1-tok1 المشتقة من BY4741 (ماتا، ura3D0، his3D1، leu2D0، lys2D0، yvc1 :: HIS3، tok1 :: kanMX4). تحويل الخلايا مع، معربا عن البلازميد aequorin pEVP1/Aeq-ليو اختيار والجرذان، معربا عن البلازميد TRPV4-أورا اختيار p416GPDV4، كما هو موضح في Batiza آخرون 26 و Loukin آخرون 24 استخدام الأساليب القياسية للبناء البلازميد والتحول 27 . تتوفر سلالة الخميرة والبلازميدات عند الطلب.

  1. الثقافة 2 مل من خلايا الخميرة بين عشية وضحاها لمرحلة ما بعد وغاريتمي في شاكر 30 ° C-ليو في أورا "DCD" التسرب المتوسطة 28 (البديل المنضب من كبريتات المتوسطة CMD-ليو-أورا 29)، على أن تستكمل مع 1M السوربيتول . تطعيم 200 ميكرولتر من هذه الثقافات إلى 1.8 مل من المتوسط ​​الطازجة تستكمل مع 2 ميكرومتر من luciferiن coelenterazine. تنمو في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أخرى دون أن تهتز.
  2. قياس الأسمولية للثقافة (عادة في الميلي أسمول 1،400) وغيرها من الحلول (أدناه) باستخدام مقياس التناضح ضغط البخار.
  3. قسامة 20 ميكرولتر من ثقافة جديدة في 12 ملم أنبوب luminometer لأنبوب luminometer واحد.
  4. للصدمة ناقص التوتر، إضافة 200 ميكرولتر من الحل، التي تحتوي على 25 ملي NaEGTA (الرقم الهيدروجيني 7.2) أو أسماء (الرقم الهيدروجيني 7.2) و500-100 مم كلوريد الصوديوم، (الأسمولية مجموعه 1،200-400 الميلي أسمول) تبعا لدرجة الصدمة المرجوة. باستمرار رصد التلألؤ وقبل لا يقل عن 120 ثانية بعد downshock ناضح، توقف إلا عن طريق عملية التخفيف وجيزة. سجل الناتج luminometer على جهاز كمبيوتر سطح المكتب وحدات التلألؤ النسبي (RUL).

وإن لم يكن لدراسة TRPV4 المعدلة وراثيا، وقد استخدمنا البديل من بروتوكول أعلاه في نظام آلي لفحص ردود عدد كبير من سلالات الخميرة. س الدراسةو كانت الردود على قصور 30 أو 31 مفرط التناضح المحفزات من deletome الخميرة (جمع 4،906 الخميرة deletants أحادية الجينات) باستخدام luminometer صفيحة ميكروسكوبية وتحليلها مع برنامج المناظرة ناجحة.

2. و3. بويضة الكهربية طرق

يستخدم أساليب الكهربية الأساسية 32. PCR تضخيم إطار القراءة المفتوح البرية من نوع أو متحولة TRPV4 باستخدام عالية الدقة PfuUtra البلمرة ودمجها في pGH19 33. هذا ينطوي على الإدراج دقيقة من ORF بين 5 'و 3' UTRs من القيطم-β غلوبين الجينات والمصب من T7 RNA-البلمرة المروج. خطي بناء المصب UTR 3 'وتستخدم القوالب في في المختبر T7 RNA تفاعل البلمرة. استخدام التقنيات الجزيئية البيولوجية معيار 34.

استخدام البويضات مرحلة V-VI من اكس. المورق. تربية الحيوانات، ovariecto جزئيةبلدي، وإزالة المغلف defolliculation، والمحي اتباع إجراءات موحدة 32،33،35. حقن 2-40 نانوغرام من كرنا حل لكل بويضة باستخدام microinjector التلقائي دروموند Nanoinject الثاني. حقن البويضات ~ 30 لكل مجموعة من التجارب. بعد الحقن TRPV4-كرنا، واحتضان البويضات في المتوسط ​​ND96 مع الجنتاميسين (100 ميكروغرام / مل) و 1 ميكرومتر الروثينيوم أحمر 14.

2. اثنين من الجهد الكهربائي المشبك

  1. سحب البورسليكات ماصات تسجيل الزجاج من الدقة المتاح بال micropipettes 100 ميكرولتر بشكل فردي مع مجتذب ماصة.
  2. سحب كلا الجهد القياس وأقطاب ماصة حقن الحالي يتم سحبها أن يكون لها فتحة غيض من ~ 1 ميكرون القطر.
  3. أقطاب الردم مع 2 M بوكل مما أدى إلى 0.1-0.2 mΩ المقاومة. جبل لهم على headstages HS2A، الذي جنبا إلى جنب مع VG-2Ax100 الظاهري الارض المشبك حمام ترتبط، إلى واجهة مكبر للصوت 500 GeneClamp من خلال Digidata 1440 التحويل الرقمي. كسب بيانات باستخدام برنامج pClamp10.
  4. وضع البويضة التي سيتم اختبارها في حمام 1 مل في غرفة البلاستيك ملفقة التي شنت على مرحلة مجهر تشريح مع التكبير 20X. الحل هو حمام الظاهري على الارض عن طريق جسر أجار 3 M بوكل وسلك الفضة المكلورة وضعت على مقربة من البويضة ومتصلة VG-2A المرحلة الأرض الظاهري.
  5. بناء غرفة لنضح المستمر مع الأنابيب البلاستيكية ومدخل ومخرج الحل. الاتصال يتم توصيل أنابيب مدخل إلى نظام نضح ملفقة، وهي متعددة من ست قذائف 50 مل حقنة، كل مليئة حلا مختلفا. يتم التحكم معدلات التغذية خطورة أي حل معين ل~ 2-3 مل / دقيقة باستخدام "كيك" المشابك منحدر على الأنابيب.
  6. جبل كل من الأقطاب الكهربائية مع headstages على micromanipulators. تنفيذ الاختراقات الكهربائي من البويضة بواسطة المجهرية.

3. المشبك التصحيح فحص المباشر Mechanosensitivity

"> الطرق الأساسية للالمشبك التصحيح بما في ذلك إعداد ماصة، وتشكيل GΩ ختم، وعلى تشكيل خلية أو وسائط رفعه هي تلك هاميل وآخرون 36 وكون 32.

  1. ملء الماصات الزجاج البورسليكات مع فتحة قطرها 1 ميكرومتر ~ في الطرف (فقاعة عدد 5-6) مع 98 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، و 10 ملي K +-HEPES، ودرجة الحموضة 7.2.
  2. إرفاق ماصة المشبك التصحيح من خلال أنابيب بلاستيكية لحقنة 5 مل و من خلال T-المشتركة، أيضا إلى مقياس ضغط الدم. استخدام الكمبيوتر للتعامل مع كل من القطب والمخرجات مقياس ضغط الدم. الحصول على البيانات في 10 كيلوهرتز، ومن ثم لعب مرة أخرى من خلال تصفية ثماني قطب بسل في 1 كيلو هرتز لتحليلها.
  3. بقع مختلفة يمكن رفعه من نفس البويضة مرارا وتكرارا. هذه الممارسة تجعل من فحص النشاط الجزيئي TRPV4 أكثر كفاءة وموثوق بها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في تجربة نموذجية luminometry، ويتحقق مجموعة من 400-1،200 الميلي أسمول الصدمات ناقص التوتر إلى أسفل من خلال إضافة 200 ميكرولتر من الحلول صدمة مختلفة الأسمولية المنخفضة إلى 20 ميكرولتر من الثقافة في 1،400 الميلي أسمول. النشاط TRPV4 هو واضح عند مقارنة RLU من التجريبية إلى أن اثنين من الضوابط السلبية: تحويل خلايا الخميرة مع البلازميد فارغة p416GPDV4 أو واحد الذي يحتوي على الجينات TRPV4 مع طفرة في تصفية ايون (الشكل 1) 24.

في يومين القطب التجربة الجهد المشبك نموذجي، واستحم البويضات في البداية في حل حمام متساوي التوتر المتدفقة التي تحتوي على (مم) 66 KMeSO 4، 1.8 با (الوسطى 4) 2، 5 K +-HEPES، (الرقم الهيدروجيني 7.2) و 100 السوربيتول. يتم تقييم التيارات الذروة في نهاية 100 ميللي ثانية إلى نبضات اختبار +20 بالسيارات من المحتمل عقد -20 بالسيارات كل 10 ثانية. يتم تغيير إلى الحصول على ردود ناقص التوتر تدفق إلى حل مماثل تفتقر السوربيتول. T رده ناقص التوتر هو عكسها لدى عودته من السوربيتول وكذلك blockable من قبل TRP-حاصرات قنوات الروثينيوم الحمراء (الشكل 2A).

في تجربة التصحيح، المشبك نموذجية، يتم استخدام محلول متماثل، أي الحل الاستحمام التصحيح والحل ملء ماصة هي نفسها (98 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، و 10 ملي K +-HEPES، ودرجة الحموضة 7.2). هنا، ويقام التصحيح من الداخل إلى الخارج رفعه من الجرذان TRPV4 التعبير البويضة في +50 بالسيارات. تتولد نبضات من الشفط من الحقنة. الشحوم وجيزة، ومئات من مللي ثانية في المدة، وتطبق على عشرات ملم زئبق، انتزاع ~ 40 PS تصرف أحادي الأم لغشاء البويضة 37 و~ 90 PS تصرف أحادي من TRPV4 أعرب heterologously (الشكل 2B) 14.

les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل 1. أعرب الفئران TRPV4 في الخميرة الاستجابة للصدمات ناقص التوتر. (أ) رسم تخطيطي يبين الطرق التجريبية. (B) صدمة ناقص التوتر 750 الميلي أسمول (رؤساء السهم) يتسبب في زيادة كبيرة التلألؤ (في وحدات التلألؤ النسبية، RLU) في transformants TRPV4، ولكن ليس في transformants من البلازميد فارغة، أو البلازميد تحمل TRPV4 مع طفرة في تصفية أيون لها (M680K) (C) والعلاقة بين الجرعة والاستجابة صدمة ناقص التوتر واستجابة الذروة (يعني + SD، ن = 3). قياسات من 2.4 × 10 6 خلايا كل 24. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

0PX "/>
الشكل 2. الامتحانات الكهربية من النشاط TRPV4 أعرب heterologously البويضات القيطم. (A) ردود الجامع البويضة العيانية الحالية للمؤثرات ناقص التوتر درست مع الجهد المشبك يومين القطب. التيارات الذروة من بويضة معربا عن مستويات عالية جدا من النوع البري TRPV4 (بعد 5 أيام من الحقن 40 نانوغرام من كرنا) على 100 الخطوات الجهد ميللي ثانية (من -20 إلى +20 بالسيارات كل 10 ثانية) (الشكل) ردا على إزالة 100 ملي من محلول السوربيتول 250 حمام الميلي أسمول (الحانات مفتوحة) وإضافة 3 ميكرومتر الروثينيوم الحمراء (RUR؛ شغل شريط). واضح هي زيادات الذروة الحالية المتكررة على المحفزات ناقص التوتر وانخفاض لها على العودة إلى حل متساوي التوتر أو إضافة مانع قناة (RUR). (B) التنشيط المباشر للمن النوع البري TRPV4 عن طريق تمتد غشاء ينظر تحت المشبك التصحيح. عينة من آثار الخام من متوسط ​​الجودة من التصحيح رفعه من بويضة-expreesssing TRPV4، والتي تبين موارد الوراثية الحيوانيةالأصناف البلدية بنسبة 60 ملم زئبقي شفط (أقل التتبع) تطبيقها على التصحيح رفعه من الداخل إلى الخارج الذي عقد في +50 بالسيارات. يتم عرض التتبع العلوي في قاعدة أسرع وقت لإظهار الانتقالية الحالية وحدوي بين مغلق (C) ومستويين المفتوحة (O 1 وO 2) 14. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما جاء في المقدمة، الطرق المستخدمة شيوعا لدراسة وظائف TRPV4 أدى في بعض الأحيان في التناقضات والخلافات. مجموعتين من الأساليب المذكورة هنا توفر بعض المزايا ويمكن أن تكمل الطرق القائمة. في حين وصفنا فقط على الدراسات TRPV4، ويجوز تمديد الطرق لدراسة قنوات الأيونات الأخرى كذلك.

1. طرق Luminometry الخميرة

مهدها الخميرة لديه الأم كا 2 +-استجابة لتدفق صدمة للفراش لا تسبب الاسموزي الذي توعيتهم عن طريق الطفرات التي تؤثر على تكوين الدهون 30. يمكن أن تمحى هذه الإشارة مع EGTA الخارجية. هذا خالب، ومع ذلك، لا يمحو الإشارة من TRPV4 أعرب heterologously 24، مشيرا إلى أن يتم التعبير عن قناة في الغشاء الداخلي، وعلى الأرجح أن من الشبكة الإندوبلازمية، والتي من الكالسيوم يتم تحريرها 2 + الى السيتوبلازم على ناضح صدمة. حركة أعرب heterologouslyلم يدرس القنوات في الخميرة. ينبغي أن تمتد هذه الطريقة لدراسة قنوات TRP أخرى أو قنوات mechanosensitive المفترضة أخرى، يحتاج اختبار عملية إزالة معدن ثقيل التي يتعين الاضطلاع بها وتتحمل وجود نظام أصلي في الاعتبار.

2A. يومين القطب الجهد المشبك

خلافا للتجربة التصحيح، المشبك، ويتم يومين القطب التجربة الجهد المشبك خارجا على بويضة سليمة، قبل إزالة المغلف المحي. كلا الفحص المجهري والقيم القدرة تشير إلى أن غشاء البلازما ليست كروية بشكل موحد ولكن invaginated عالية تحت المجال غير مرن نسبيا من المغلف المحي. وبالتالي، فإن الضغط الميكانيكي الناجم عن hyponicity ليس مجرد التوتر التضخمية الخواص من غشاء البلازما كروية الموسعة. نتائج الإجهاد المحتمل من إلحاحا من الغشاء المغلف ضد تقييدا ​​المحي و / أو بعيدا عن التعلق حشوية أنشئت في اله مواجهة زيادة الضغط الاسموزي.

التعبير عن TRPV4، ويحتمل بعض القنوات الأخرى، هي سامة بالنسبة للبويضة، ويفترض بسبب كا 2 + التسرب. ولذلك فمن المهم لاحتضان البويضة بشكل مستمر بعد TRPV4-كرنا حقن في وجود قناة مانع، الروثينيوم الحمراء. درجة TRPV4 التعبير يظهر التباين، والتي ليست تماما تحت السيطرة التجريبية. قنوات TRPV4 متحولة، وتلك التي تظهر افتتاح عفوية كبيرة، يتم التعبير عن "الكسب من وظيفة" منهجي في وقت سابق من بعد الحقن الخاصة بهم من نوع البرية نظيره 23.

2B. المشبك التصحيح

القيطم البويضة عن قناة الأم mechanosensitive، الذي يصحح في الاتجاه الداخل (~ 50 PS الداخل، ~ 10 PS الخارج). وتشير إحدى الدراسات أنه هو تعبير عن TRPC1 37. تقدم هذه القناة الأم أعرب باستمرار المعايرة لTRPV4، ومغايرالتعبير logous التي قد لا تكون دائما احظ بنجاح في بقع.

احتمال مواجهة TRPV4 يميل إلى أن يكون أعلى في البويضات بعد فترة أطول من الحضانة، عادة بعد 3-4 أيام حقن كرنا. وسيلة فعالة للمضي قدما هو لأداء أول تجربة يومين الكهربائي ذات الجهد المشبك (أعلاه)، والتأكد من أن البويضة يتم التعبير عن TRPV4 الحالية العيانية عفوية، ومن ثم المضي قدما لإزالة المغلف المحي قبل اتخاذ بقع عينة من نفس البويضة. ويمكن أيضا أن تعزز احتمال التقاط الأنشطة TRPV4 باستخدام "macropatches"، التي شنت على المملون pipets مع أكبر (فقاعة عدد 6-7). يبدو النار تلميع هذه الماصات 32 أن تكون مفيدة في تحقيق ختم GΩ. بعد تشكيل الختم، التصحيح رفعه قد تظهر مقاومة عالية جدا، والضوضاء القليل جدا ترتبط عادة مع الأغشية البيولوجية، وأي نشاط قناة الأم. هذا على الأرجح فيdicates تشكيل غشاء مزدوج. والتعرض للهواء وجيزة، من خلال رفع عابر ماصة فوق الغضروف المفصلي من قبل المجهرية يمكن عادة كسر طبقة إضافية غير مرغوب فيها. بدلا من ذلك، يمكن إزالة الطبقة الخارجية عن طريق لمس بلطف تتحمل ماصة ضد خيط من تصلب ختم سيليكون معلقة في الحمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نود أن نشكر اندريا Kremsreiter للحصول على مساعدة فنية ممتازة. ويدعم عمل في مختبرنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM096088 وفيلاس الثقة من جامعة ويسكونسن - ماديسون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
  2. Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
  3. Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
  4. Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
  5. Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
  6. Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
  7. Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
  8. Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
  9. Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
  10. Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
  11. Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
  12. Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
  13. Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
  14. Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
  15. Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
  16. Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
  17. Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
  18. Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
  19. Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
  20. Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  21. Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
  22. Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
  23. Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
  24. Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
  25. Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
  26. Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
  27. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  28. Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  29. Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
  30. Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
  31. Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  32. Conn, P. M. Methods in Enzymology. 294, Academic Press. (1999).
  33. Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).
  34. Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
  35. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
  36. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  37. Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).

Tags

بروتوكول الأساسية، العدد 82، Eukaryota، الأركيا، البكتيريا، العلوم الحياتية (العامة)، Mechanosensation، وقنوات ايون، الدهون، المشبك التصحيح،
Luminometric الخميرة و<em&gt; القيطم</em&gt; سيت الكهربية الامتحانات من Mechanosensitivity الجزيئي للTRPV4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter