Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gjær Luminometric og Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

For å komplettere brukte metodene for å studere TRPV4 tallet, er to metoder beskrevet: Its mechanosensitivity kan studeres av Ca 2 +-aequorin luminometry i transgen gjær ved hypo-osmotisk utfordring. Det kan også undersøkes i TRPV4-RNA injisert Xenopus oocytter ved hel-celle-to-elektrodespenningsklemme eller lapp klemmes fast i on-celle eller skåret ut-modus.

Abstract

TRPV4 (Transient Receptor potensialer, vanilloid familie, type 4) er mye uttrykt i virveldyr vev og aktiveres av flere stimuli, inkludert ved mekaniske krefter. Visse TRPV4 mutasjoner føre komplekse arvelig bein eller nevronale patologier i menneskelig. Vill-type eller mutert TRPV4 transgener er vanligvis uttrykt i dyrkede pattedyrceller og undersøkt av Fura-2 fluorometri, og ved elektroder. I form av mekanismen av mechanosensitivity og de molekylære baser av sykdommer, er dagens litteratur forvirrende og kontroversielt. For å komplettere eksisterende metoder, beskriver vi ytterligere to metoder for å undersøke de molekylære egenskaper TRPV4. (1) Rat TRPV4 og en aequorin transgenet blir forvandlet til spirende gjær. En hypo-osmtic sjokk av transform befolkningen gir en luminometric signal på grunn av kombinasjonen av aequorin med Ca 2 +, sluppet gjennom TRPV4 kanal. Her TRPV4 er isolert fra sin vanlige pattedyrpartnerproteinerog avslører sin egen mechanosensitivity. (2) cRNA av TRPV4 injiseres i Xenopus oocytter. Etter en egnet inkubasjonsperiode blir den makroskopiske TRPV4 strøm undersøkt med en to-elektrodespenningsklemme. Den nåværende økningen ved fjerning av inert osmoticum fra eggcelle bad er et tegn på mechanosensitivity. De microampere (10 -6 til 10 -4 A) strømmer fra ubefruktede egg er mye større enn de subnano-til nanoAmpere (10 -10 til 10 -9 A) strømmer fra dyrkede celler, noe som gir klarere kvantifisering og mer trygg vurderinger. Mikroskopiske strømmer reflekterer aktivitetene til individuelle kanalproteiner kan også bli direkte registrert under en patch clamp, i on-celle eller fjernet modus. Det samme eggcelle gir flere patch prøver, slik at bedre data replikering. Innsugingsdeler brukes på patcher kan aktivere TRPV4 å vurdere mechanosensitivity direkte. Disse metoder skal også være anvendbare i studiet av andre typer av TRP-kanaler.

Introduction

Trps (transient receptor potensialer) omfatter syv underfamilier av sjonskanaler som tjener sensoriske funksjoner 1,2. I pattedyr, TRPV, den vanilloid underfamilie av trps, har seks varianter. TRPV4 (type 4) 3,4 reagerer på varme, visse kjemikalier, osmotisk hevelse, eller skjærspenning. Den TRPV4 genet ble gjentatte ganger isolert av kandidat-gen og / eller uttrykk kloning 5-8. Den sistnevnte metode fulgt genproduktet respons på hypo-osmolaritet. TRPV4 er uttrykt i nesten alle organer og funksjoner i utvikling, fysiologi, eller patologi av mange ulike celletyper 3,4.

Slående er> 50 menneske autosomal dominant TRPV4 mutasjoner, forårsaker perifere nevropatier og / eller skjelett dysplasier (unormalt i utviklingen av skjelettet) 9-11. Skjelett dysplasiene variere fra mild brachyomia type 3 (type-tre dverger), spondylometaphyseal dysplasi Kozlowski type, til Severe dysplasier, noen forårsaker neonatal eller embryonale død. Selv om alle oppførsel av mekanismene synes mulig, forklarer ingen av mangfold, kompleksitet, variasjon, og sporadiske overlappinger av disse sykdommene fire.

Som andre TRP kanaler 1, er TRPV4 en tetramer. I rotte-eller human TRPV4 blir hver underenhet besto av 871 rester. Den sentrale element er seks transmembrane en helikser (S1-S6), som sannsynligvis anordnet på en måte lik den spenningsstyrte K +-kanaler. Der S1 til S4 danne en perifer domenet og S5 og S6 danne gjennomtrengelighet pore domenet. Mellom S5 og S6 i TRPV4 er en kort pore helix, etterfulgt av sekvensen LDLFKLTIGMGDL, fire av hvilke formodentlig konvergerer for å danne kation-filter. Den 470-residuum N-terminalt cytoplasmatisk segment inneholder 6 Ankyrin gjentas, kjent for å binde proteiner eller små ligander. Den C-terminale 152-resten cytoplasmisk segmentet omfatter en kalmodulin-bindende sekvens blant andre mulige områder som binder othennes elementer tre.

TRPV4 er et kation kanal som i hovedsak utelukker anioner en. Mens dets fysiologiske funksjon er å transduce stimuli til Ca 2 + innstrømning, er det også gjennomtrengelig for andre kationer med en Eisenman IV permeabilitet sekvens, favoriserer divalent ved et P Ca: P Na ~ 7 12. Single-kanals konduktans utbedrer på ~ 90 pS utover og ~ 40 pS innover 6,13,14. , Heterologt uttrykt strøm (nedenfor) kan aktiveres ved hypo-osmotiske hevelse, skjærspenning, eller varme 15.. Det blir også aktivert av flerumettede fettsyrer 16,17 og det syntetiske phorbal ester 4αPDD 18.. I dag er den mest potente agonist GSK1016790A 19 og antagonist er GSK2193874, effektiv i 10 -9 til 10 -8 M 20, begge oppdaget av høy gjennomstrømning, små-molekylære skjermen.

To sentrale områder av TRPV4 forskning forbli forvirrende: (1) Selv som TRPV4 er i stor grad undersøkt for sin mechanosensitivity, er den molekylære basis kontroversielt. En modell beskriver hypo-osmolaritet eller annen måte aktiverer fosfolipase A2 (PLA2) for å frembringe den polyumettede fettsyren (PUFA) arakidonsyre (AA), som omdannes til epoxyeicosatrienoic syre (EET) av en epoxygenase, og bindingen av EET aktiverer TRPV4 16, 17. Likevel TRPV4 i seg selv har vist seg å reagere direkte for å strekke membranen 14 (nedenfor), som gir en enklere forklaring. (2) De TRPV4 mutant patologi er forvirrende. På fundamentet, må man vite hvorvidt sykdommer er på grunn av tap, reduksjon eller økning av kanal aktiviteter. Selv her, er litteraturen langt fra klart. Mens flere skjelett-dysplasi alleler ble rapportert å ha høyere aktivitet, (gain-of-funksjon, GOF) 4,21, flere ble rapportert å ha redusert aktivitet (tap-av-funksjon, LOF) 10,22. En systematisk undersøkelse av 14 alleler fant dem tilalle bli GOF mutasjoner (nedenfor) 23. Påstanden om at noen er Lofs synes å motsi fenotype av trpV4-/ - knockout mus, som er levedyktig eller fruktbare, med bare mindre feil, til tross for et fullstendig tap av TRPV4 funksjon.

En del av disse kontroversene har metodisk opprinnelse. Laboratorier bruker ulike metoder, eller varianter av én metode, og bruke forskjellige dommer standarder. Mest vanlig er TRPV4 forbigående uttrykt i dyrkede pattedyrceller (HEK, CHO, HeLa) og fremveksten av interne [Ca 2 +] på agonist eller hypoton stimulering er registrert med Ca 2 +-sensitive fluorescerende fargestoff, Fura-2. Den over-avhengighet av denne fluorometrisk analysen har blitt kritisert en. Uttrykket nivå i forskjellige populasjoner, fordeling i denne, så vel som den effektive fargestoff konsentrasjon, må kontrolleres og dokumentert. Mer pålitelig er den direkte elektrofysiologiske undersøkelser. Selv dette, som commonly praktiseres, er heller ikke uten problemer. På grunn av at ekspresjonsnivåene i individuelle dyrkede celler er vanskelig å kontrollere, hel-celle-strømmer har store variasjoner. Videre, fordi strømmen er liten, vil pålitelig statistikk nødt til å stole på store utvalgsstørrelser, ofte ikke praktisk. Patch-clamp undersøkelser har sjelden blitt utført. Noen slike opptak viser klynger av aktivitets bursts som gjør statistisk evaluering utfordrende 16,17.

For bedre å forstå den molekylære mechanosensitivity, har vi utviklet ytterligere to systemer for å undersøke TRPV4. (1) For å isolere TRPV4 bort fra sin vanlige pattedyr partnere, har vi uttrykt rotte TRPV4 i spirende gjær 24. Funksjonell uttrykk for TRPV4 i dette evolusjonært fjernt sammenheng viste at det fortsatt kunne svare på saltkraft uten sine vanlige partnere. Fordi gjær gir ingen flerumettede fettsyrer som AA eller EET, og dens genom har ingen PLA2 eller epoxygenase gener, dette EXPREssion viser også at de ikke er pålagt for TRPV4 å oppfatte kraft. Å ha TRPV4 i de molekylære biologisk mest mottagelig eukaryoter kan også effektiv fremtids eller reverse-genetiske manipulasjoner 25. (2) For dybde biofysiske analyser av TRPV4, uttrykte vi TRPV4 i Xenopus oocytter. I motsetning dyrkede celler, som gir sub-nA til Na (10 -10 til 10 -9 A) strømninger, uttrykker en eggcelle strømninger i μA-tallet (10 -6 til 10 -4 A). Mye større signal over støy gir bedre kvantifisering og mer trygg sammenligning. TRPV4, så uttrykt, kan også bli undersøkt som individuelle molekyler ved hjelp av en patch clamp. En enkelt eggcelle tillater gjentatt patch prøvetaking, igjen gjør kvantifisering mer pålitelig. Slike studier har vist at TRPV4 kanalen i seg selv direkte kan aktiveres ved membran strekk kraft 14.. Analyser viste også at 14 representative skjelett-dysplasi alleler er alle gain-of-funksjon mutasjoner. Videre dgree av dette konstituerende Ca 2 + lekkasje paralleller alvorlighetsgraden av skjelettsykdommer 23.

På grunn av sin nyhet og nytte, er de detaljerte prosedyrer for disse to metodene samlet her for å tillate gjennomkjøringer i fremtidig forskning på TRPV4 eller lignende kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Gjær Luminometry Metoder

Bruk belastning BYYT av Saccharomyces cerevisiae. Det er en yvc1-tok1-derivat av BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transform celler med Leu-valgbar aequorin-uttrykke plasmid pEVP1/Aeq og ura-valgbar rotte-TRPV4-uttrykke plasmid p416GPDV4, som beskrevet i Batiza et al. 26 og Loukin et al. 24 Bruk standard metoder for plasmid konstruksjon og transformasjon 27 . Gjærstamme og plasmider er tilgjengelig på forespørsel.

  1. Kultur 2 ml av gjærceller over natten til post-logaritmisk fase i en 30 ° C shaker i leu-ura-"DCD" dropout medium 28 (en sulfat-utarmet variant av CMD-leu-ura medium 29), supplert med 1M sorbitol . Inokuler 200 pl av disse kulturer i 1,8 ml friskt medium supplert med 2 mM av LUCIFERIn coelenterazine. Dyrk i mørke ved romtemperatur i ytterligere 24 timer uten rysting.
  2. Måle osmolariteten av kulturen (typisk 1400 mOsM), og andre løsninger (nedenfor) under anvendelse av en damptrykk osmometer.
  3. Delmengde 20 ul av frisk kultur i en 12 mm luminometer rør for et enkelt rør luminometer.
  4. For hypotonisk sjokk, tilsett 200 pl av en løsning inneholdende 25 mM NaEGTA (pH 7,2) eller navn (pH 7,2), og 500 til 100 mM NaCl, (total osmolaritet på 1,200-400 mOsM), avhengig av graden av sjokk ønsket. Kontinuerlig overvåke luminescens før og minst 120 sek etter at det osmotiske downshock, kun avbrutt av den korte fortynning operasjonen. Registrere luminometer utgang på en stasjonær datamaskin som relative luminescens enheter (Rul).

Selv om ikke for studier av transgene TRPV4 har vi benyttet en variant av ovennevnte protokoll i et automatisert system for å undersøke responsen fra et stort antall gjærstammer. Study of svarene på hypo-30 eller Hyperosmotic 31 stimuli av gjær deletome (innsamling av 4906 gjær single-genet deletants) ved hjelp av en mikroplate luminometer og analysert med tilhørende programvare har vært vellykket.

2. og 3.. Oocytten Electrophysiology Metoder

Elektro bruker grunnleggende metoder 32. PCR forsterke den åpne leserammen av vill-type eller mutant TRPV4 bruker high-fidelity PfuUtra polymerase og integrert i pGH19 33. Dette medfører en nøyaktig innsetting av ORF mellom de 5 'og 3' UTRs av Xenopus β-globin-genet og nedstrøms for en T7 RNA-polymerase-promoter. Linearisere konstruksjonen nedstrøms for 3'-UTR og anvendes som maler i en in vitro-T7 RNA-polymerase-reaksjon. Bruk standard molekylærbiologiske teknikker 34.

Bruk scene V-VI ubefruktede egg fra X. laevis. Husdyrhold, delvis ovariectomin, defolliculation, og vitelline konvolutt fjerning følge standard prosedyrer 32,33,35. Injisere 2-40 ng av cRNA løsning per eggcelle ved hjelp av en Drummond Nanoinject II automatisk microinjector. Injiser ~ 30 oocytter for hvert sett av eksperimenter. Etter TRPV4-cRNA-injeksjon, inkuber oocyttene i ND96 medium med gentamicin (100 ug / ml) og 1 pM ruthenium rød 14.

2. To elektrode Spenning Clamp

  1. Trekk borsilikatglass opptaks pipetter fra presisjon engangs 100 mL mikropipettene individuelt med en pipette avtrekker.
  2. Trekk både spenning-måling og nåværende-injisering pipette elektroder er trukket til å ha et tips blenderåpning på ~ 1 mikrometer i diameter.
  3. Omfyllingsmasse elektroder med to M KCl resulterer i 0,1-0,2 mΩ motstand. Montere dem på HS2A headstages, som sammen med en VG-2Ax100 virtuell-jordet bad klemme, er koblet til en GeneClamp 500 forsterker grensesnitt gjennom en Digidata 1440 digitizer. Acquire data ved hjelp pClamp10 programvare.
  4. Plasser eggcelle å bli testet i en 1 ml bad i en fabrikkert plastkammer montert på scenen av en dissekere mikroskop med 20X forstørrelse. Badekaret løsning er virtual-jordet ved en 3 M KCl agar bro og en klorert sølvtråd plasseres i nærheten av eggcelle og koblet til en VG-2A virtuelle bakken scenen.
  5. Konstruer kammeret for kontinuerlig perfusjon med plastslanger som løsning og utløp. Koble innløpsrøret er koblet til en fabrikkert perfusjon system, som er en manifold med seks 50 ml sprøyte skall, hvert fylt med en annen løsning. Gravitasjonsmatingshastigheter av en bestemt løsning reguleres til ~ 2-3 ml / min ved bruk av "Keck" haleklemmene på slangene.
  6. Monter begge elektrodene med sine headstages på micromanipulators. Utfør elektrode gjennomføringer av eggcelle ved micromanipulation.

Tre. Patch Clamp Undersøkelse av Direct Mechanosensitivity

"> De grunnleggende metoder for patch clamp inkludert pipette forberedelse, GΩ-segl formasjon, og dannelse av on-celle eller skåret modusene er de i Hamill et al. 36 og Conn 32.

  1. Fyll borsilikatglass pipetter med en ~ 1 mikrometer diameter åpning på tuppen (bubble nummer 5-6) med 98 mM KCl, 1 mM MgCl2, og 10 mM K +-HEPES, pH 7,2.
  2. Fest patch clamp pipette gjennom et plastrør til en 5 ml sprøyte og gjennom en T-skjøt, også for et manometer. Bruk en datamaskin til å håndtere både elektroden og manometer utganger. Skaffe data på 10 kHz, og deretter spille gjennom en åtte-polet Bessel filter ved 1 kHz for analyse.
  3. Forskjellige plaster kan fjernes fra samme eggcelle gjentatte ganger. Denne praksisen gjør undersøkelsen av TRPV4 molekylære aktiviteten mer effektiv og pålitelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I et typisk eksperiment luminometry, er et område på 400-1,200 mOsm hypotoniske ned støt oppnås ved å tilsette 200 ul av støt løsninger av forskjellige lav osmolaritet til 20 pl av kulturen ved 1 400 mOsM. Den TRPV4 aktivitet er tydelig når RLU av den eksperimentelle blir sammenlignet med to negative kontroller: gjærcelle transformert med tom p416GPDV4 plasmid eller en som inneholder TRPV4 genet med en mutasjon ved ione filteret (figur 1) 24.

I et typisk to-elektrodespenningsklemme eksperiment, blir oocyttene først badet i en strømmende isotonisk bad oppløsning inneholdende (i mM) 66 KMeSO 4, 1,8 Ba (meso 4) 2, 5 K +-HEPES, (pH 7,2), og 100 sorbitol. Toppstrømmer vurderes på slutten av 100 msek testimpulsene til 20 mV fra et holdingselskap potensial på -20 mV hver 10 sek. For å fremkalle hypotoniske responser strømmen endres til en tilsvarende løsning som mangler sorbitol. T hans hypoton respons er reversibel ved retur av sorbitol samt block av TRP-kanal blokker ruthenium rød (Figur 2A).

I en typisk patch-clamp eksperiment, er symmetrisk løsning som brukes, dvs. oppløsningen bade plasteret og pipette-fylling løsning er de samme (98 mM KCl, 1 mM MgCl2, og 10 mM K +-HEPES, pH 7,2). Her er innsiden ut patch fjernet fra en rotte-TRPV4 uttrykk eggcelle holdt på 50 mV. Pulser av sug genereres fra sprøyten. Korte innsugingsdeler, hundrevis av millisekunder varighet, anvendt på titalls mm Hg, framprovosere ~ 40 pS enhetlig konduktans innfødt til eggcelle membran 37 og ~ 90 pS enhetlig ledningsevne av heterologt uttrykt TRPV4 (figur 2B) 14.

les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Rat TRPV4 uttrykt i gjær reagerer på hypoton sjokk. (A) Et diagram som viser de eksperimentelle metoder. (B) A 750 mOsM hypotonisk sjokk (piler) utløser et stort luminescens økning (i relative luminescens heter, RLU) i TRPV4 transformanter, men ikke i transformanter av et tomt plasmid, eller plasmid bærer en TRPV4 med en mutasjon i sitt ion filter (M680K). (C) En dose-respons-forhold mellom hypotonisk sjokk og maksimal respons (middel + SD, n = 3). Målinger fra 2,4 x 10 6 celler hver 24. Klikk her for å se større bilde .

0px "/>
Figur 2. Elektrofysiologiske undersøkelser av TRPV4 aktivitet, heterologt uttrykt Xenopus oocytter. (A) Hele-eggcelle makroskopiske-aktuelle reaksjoner på hypotoniske stimuli undersøkt med en to-elektrode spenning klemme. Toppstrømmer fra en oocytt som uttrykker svært høye nivåer av vill-type TRPV4 (5 dager etter injeksjon av 40 ng av cRNA) ved 100 msek spennings trinn (-20 til 20 mV hver 10 sek) (innfelt) som reaksjon på fjerningen med 100 mM sorbitol fra 250 mOsM badoppløsningen (åpne søyler) og tilsetning av 3 uM ruthenium rødt (RUR; fylt bar). Tydelig er de gjentatte topp-strømmen øker ved hypotoniske stimuli og dets avtar ved returen til isotonisk oppløsning, eller tilsetningen av kanalblokker (RUR). (B) direkte aktivering av villtype TRPV4 av membranen strekke sett under en patch clamp. En prøve av rå spor av gjennomsnittlig kvalitet fra en patch fjernet fra en TRPV4-expreesssing eggcelle, viser aktivisjon med 60 mmHg suge (nedre spor) anvendt på en excised inside-out patch holdt på 50 mV. Den øverste spor vises på en raskere tid base for å vise den enhetlige gjeldende overgangen mellom lukkede (C) og to åpne nivåer (O 1 og O 2) 14. Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nevnt i innledningen, metodene som vanligvis brukes til å studere TRPV4 funksjoner noen ganger ført til uoverensstemmelser og kontroverser. De to settene med metodene som beskrives her har noen fordeler, og kan utfylle eksisterende metoder. Mens vi beskrive bare de studier på TRPV4, kan metodene bli utvidet for å studere andre ionekanaler også.

En. Gjær Luminometry Metoder

Spirende gjær har en innfødt Ca 2 +-tilstrømningen respons på hypo-osmotisk sjokk som er sensibilisert med mutasjoner som påvirker lipid sammensetning 30. Dette signalet kan bli slettet med ekstern EGTA. Dette chelator, imidlertid ikke fjerne signalet fra heterologt uttrykt TRPV4 24, noe som indikerer at kanalen er uttrykt i en indre membran, som mest sannsynlig at i det endoplasmatiske retikulum, hvorfra Ca 2 + er sluppet inn i cytoplasma på det osmotiske støt. Trafikk av heterologt uttryktkanaler har ikke blitt studert i gjær. Dersom denne metoden bli utvidet til studiet av andre TRP kanaler eller andre putative mechanosensitive kanaler, må chelatering test som skal utføres, og tilstedeværelsen av den opprinnelige systemet tas i betraktning.

2A. To-elektrode Spenning Clamp

I motsetning til patch-clamp eksperiment, er de to-elektrodespenningsklemme eksperiment utført på intakte oocyte, før fjerning av vitelline konvolutten. Både mikroskopisk undersøkelse og kapasitetsverdier indikerer at plasmamembranen er ikke jevnt sfærisk, men er høy invaginated under relativt uelastisk sfære av vitelline konvolutten. Således er den mekaniske påkjenninger forårsaket av hyponicity ikke bare en isotrop inflationary spenning av en utvidet sfærisk plasma membran. Stresssannsynlige resultat av pressing av membranen mot den begrensende vitelline konvolutt-og / eller bort fra den etablerte cytoplasmisk vedlegg i the ansiktet av økt osmotisk trykk.

Expression of TRPV4, og sannsynligvis enkelte andre kanaler, er giftig for eggcelle, antagelig på grunn av Ca 2 + lekkasje. Det er derfor viktig å kontinuerlig inkuber oocyte etter TRPV4-cRNA-injeksjon i nærvær av kanalblokker, ruthenium red. Graden av TRPV4 uttrykk viser variasjonen, som ikke er helt under eksperimentell kontroll. "Gain-av-funksjon" mutant TRPV4 kanaler, de som viser betydelig spontan åpning, er systematisk uttrykt tidligere etter injeksjon enn deres villtype motstykke 23.

2B. Patch Clamp

Xenopus eggcelle uttrykker en innfødt mechanosensitive kanal, som korrigerer i den innover retning (~ 50 pS innover, ~ 10 pS utover). En studie antyder at det er uttrykk for TRPC1 37. Dette stadig uttrykt innfødte kanal gir en kalibrering for TRPV4, heteroautologe ekspresjon av disse kan ikke alltid være vellykket observert i plastre.

Den sannsynligheten for å treffe TRPV4 en tendens til å være høyere i oocytter etter en lengre periode med inkubering, vanligvis 3-4 dager etter injeksjonen cRNA. En effektiv måte å gå er å først utføre to-elektrode-voltage-clamp eksperiment (over), noe som gjør at eggcelle uttrykker den spontane TRPV4 makroskopisk strøm, og deretter fortsette å fjerne vitelline konvolutten før du tar prøven patcher fra samme eggcelle. Sannsynligheten for å fange TRPV4 aktiviteter kan også bli forbedret ved hjelp av "macropatches", montert på pipets med større boringer (boble nummer 6-7). Brann polering disse pipetter 32 ser ut til å være nyttig for å oppnå den GΩ segl. Etter forseglingen formasjonen, kan det utskårende plasteret viser en meget høy motstand, meget lite støy som vanligvis forbindes med biologiske membraner, og ingen native-kanal aktivitet. Dette mest sannsynlig idicates en dobbel-membran formasjon. En kort luft eksponering, ved forbigående å løfte pipetten over menisken ved micromanipulation kan vanligvis bryte den uønskede ekstra lag. Alternativt kan det ytre lag fjernes ved forsiktig berøring pipetten boringen mot en tråd av herdet silikonpakning suspendert i badet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Andrea Kremsreiter for utmerket teknisk assistanse. Arbeid i vårt laboratorium er støttet av NIH GM096088 og Vilas stoler ved University of Wisconsin - Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
  2. Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
  3. Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
  4. Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
  5. Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
  6. Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
  7. Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
  8. Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
  9. Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
  10. Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
  11. Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
  12. Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
  13. Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
  14. Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
  15. Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
  16. Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
  17. Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
  18. Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
  19. Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
  20. Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  21. Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
  22. Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
  23. Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
  24. Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
  25. Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
  26. Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
  27. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  28. Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  29. Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
  30. Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
  31. Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  32. Conn, P. M. Methods in Enzymology. 294, Academic Press. (1999).
  33. Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).
  34. Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
  35. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
  36. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  37. Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).

Tags

Grunnleggende Protocol Eukaryota Archaea Bakterier miljø-og biovitenskap (General) Mechanosensation Ionekanaler lipider patch clamp, gjær luminometry kraft sensing spenning klemme TRPV4 elektrofysiologi
Gjær Luminometric og<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytten Elektro Undersøkelser av Molecular Mechanosensitivity av TRPV4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter