Summary
يوضح هذا الإجراء في الجسم الحي بالقرب من الأشعة تحت الحمراء التصوير مضان من أنشطة إعادة عرض الكولاجين في الفئران وكذلك فيفو السابقين تلطيخ من الكولاجين في أقسام الأنسجة باستخدام قفص الكولاجين الببتيدات المحاكاة التي يمكن أن تكون تسببت الصورة لهجن مع فروع الكولاجين التشويه والتحريف.
Abstract
الكولاجين هو عنصر هيكلية رئيسية من المصفوفة خارج الخلية التي تدعم تشكيل الأنسجة والصيانة. على الرغم من أن إعادة عرض الكولاجين هو جزء لا يتجزأ من تجديد الأنسجة الطبيعية، وتشارك كمية زائدة من النشاط إعادة عرض في الأورام، والتهاب المفاصل، والعديد من الحالات المرضية الأخرى. خلال إعادة عرض الكولاجين، تعطل بنية حلزونية ثلاثية من جزيئات الكولاجين بواسطة البروتياز في البيئة خارج الخلية. بالإضافة إلى ذلك، الكولاجين الموجودة في العديد من عينات الأنسجة النسيجية والتشويه والتحريف جزئيا عمليات التثبيت والحفظ. لذا، يمكن لهذه الخيوط الكولاجين التشويه والتحريف خدمة أهداف اعتبارا للتصوير البيولوجية. وضعنا سابقا في قفص الببتيد الكولاجين المحاكاة (CMP) التي يمكن أن تكون لهجن مع فروع الكولاجين التشويه والتحريف من خلال تشكيل بنية حلزونية ثلاثية، والتي هي فريدة من نوعها لالكولاجين أثار الصورة. الأهداف العامة من هذا الإجراء هي ط) لصورة خيوط الكولاجين التشويه والتحريف صesulting من أنشطة إعادة طبيعية في الجسم الحي، والثاني) لتصور الكولاجين في الجسم الحي السابقين أقسام الأنسجة باستخدام CMPS قفص أثار الصورة. لتحقيق التهجين فعالة وناجحة في الجسم الحي وخارج الحي والتصوير، وCMPS قفص fluorescently المسمى إما مباشرة قبل الحقن في الوريد تنشيط الصورة، أو يتم تفعيلها مباشرة على أقسام الأنسجة. يتم تصوير العادي remolding الكولاجين الهيكل العظمي في الفئران والكولاجين عارية في الماوس مسبوقة أقسام الأنسجة القرنية في هذا الإجراء. طريقة التصوير التي تعتمد على تقنية التهجين CMP-الكولاجين المقدمة هنا يمكن أن يؤدي إلى فهم أعمق لعملية إعادة عرض الأنسجة، وكذلك السماح تطوير وسائل التشخيص الجديدة لأمراض المرتبطة الكولاجين عالية النشاط التجديد.
Introduction
الكولاجين، البروتين الأكثر وفرة في الثدييات، ويلعب دورا حاسما في التنمية الأنسجة وتجديدها من خلال دعم انتشار وتمايز الخلايا. بينما الكولاجين الليفية (مثل النوع الأول والثاني)، في الأنسجة الضامة تعطي القوة الميكانيكية للأنسجة، والكولاجين، مثل شبكة (النوع الرابع) تشكل سقالة الأساسية من الغشاء القاعدي حيث تعلق الخلايا والأنسجة تشكيل المنظمة. إعادة عرض الكولاجين تشمل كلا تدهور الكولاجين (بواسطة البروتياز) والتوليف (التي يروج لها عوامل النمو). على الرغم من أن إعادة عرض الكولاجين، على سبيل المثال في العظام، هو جزء من عملية طبيعية تجديد الأنسجة، وإعادة النشاط الزائد، أو وقوعه في أماكن غير طبيعية، ويشير عادة التئام الجروح استجابة لإصابة أو الحالات المرضية المزمنة مثل السرطان وهشاشة العظام والتهاب المفاصل، و التليف 1-4. القدرة على مباشرة الكولاجين الصورة فيخضع لعمليات المجراة يمكن أن يؤدي إلى فهم التقدمايون من هذه الأمراض، وكذلك التشخيص والعلاجات الجديدة. على سبيل المثال، يمكن تصوير حي تقديم معلومات عن شدة وموقع من الأمراض، ويمكن أن تستخدم أيضا لتقييم فعالية وكلاء علاجية جديدة. طبقت Multiphoton مسح بالليزر المجهري والجيل الثاني التوافقي لالكولاجين الصورة ييفي لرصد خارج الخلية مصفوفة إعادة عرض في الورم في الفئران الحية 5. ولكن، هذا الأسلوب يتطلب الحيوانات لتركيبها مع شفافة غرف الظهرية ثنية الجلد، والذي هو إجراء الغازية. والتصوير المباشر وموسع الكولاجين إعادة الاستفادة من التحقيق الذي يستهدف على وجه التحديد الكولاجين فيخضع لعمليات. هذا التحقيق من الصعب إعداد لأنها تحتاج للتمييز بين إعادة عرض الكولاجين من الكولاجين سليمة وناضجة، والتي هي وفرة في الأنسجة الطبيعية 6.
يرصد الكولاجين تتكون من بنية البروتين نادرة للغاية يسمى الحلزون الثلاثي، الذي هوالمشقوق بواسطة البروتياز مثل مصفوفة metalloproteinases (MMP) خلال إعادة عرض الكولاجين. شظايا الكولاجين المشقوق تفقد بنية حلزونية ثلاثية وتصبح فروع تكشفت (الجيلاتين)، والتي يتم هضمها مزيدا من البروتياز غير محدد 1. وقد اكتشف مؤخرا أن الببتيد الكولاجين المحاكاة (CMP) الذي لديه الميل إلى أضعاف في بنية حلزونية ثلاثية يمكن أن تستهدف على وجه التحديد فروع الكولاجين التي تنفصل عن حالته حلزونية ثلاثية إما عن طريق الحرارة أو عن طريق تمسخ تدهور الأنزيمية 1،7. الربط هو مدفوعة أساسا عن طريق الثلاثي الحلزون التهجين بين CMPS أحادى وفروع الكولاجين التشويه والتحريف. لأن CMPS تجميع الذاتي في اللوالب الثلاثي homotrimeric في درجة حرارة الغرفة مع القوة الدافعة قليلا عن التهجين الكولاجين، وهو CMP قفص [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4، وتسمى NB (GPO) 9، O: الهيدروكسي برولين]، وقد وضعت ، والذي يحتوي على الصورة nitrobenzyl-شطورةمجموعة (NB) تعلق على الجلايسين المركزية للالببتيد. مجموعة قفص NB sterically يمنع CMP من للطي في الحلزون الثلاثي، ومع ذلك، إزالة مجموعة القفص بواسطة الأشعة فوق البنفسجية على الفور بتشغيل لطي حلزونية ثلاثية والكولاجين التهجين 1. عندما يتم تسليم CMPS أحادى المسمى مع قرب الأشعة تحت الحمراء (الجرد) fluorophores منتظم لنموذج الفئران، فإنها يمكن أن تستهدف على وجه التحديد والسماح في مجال التصوير المجراة من التشويه والتحريف الكولاجين في الأنسجة تمر العادي (على سبيل المثال في العظام والغضاريف) والمرضية (على سبيل المثال في الأورام) إعادة عرض 1 .
ويمكن أيضا CMPS fluorescently المسمى استخدامها لتصوير الكولاجين في أقسام الأنسجة النسيجية. في دراسة نسيجية، وغالبا ما يتم الاحتفاظ الأنسجة تحصد التثبيت للحفاظ على المكونات الخلوية والأنسجة التشكل الشاملة من التدهور. إجراءات التثبيت، والتي تشمل الحرارة، والعلاج مع المذيبات العضوية والكيميائية عبر ينكينز الكواشف (مثل امتصاص العرق)، تفسد بنية حلزونية ثلاثية الكولاجين 8. هذا تمسخ يولد مواقع لCMP التهجين. وقد تبين أن CMPS fluorescently المسمى يمكن ربط خصيصا لالكولاجين في أقسام الأنسجة الثابتة (مثل الجلد والقرنية، والعظام) أكثر فعالية من الأضداد المضادة للالكولاجين، مما سمح بتحديد السهل ظروف مرضية في أنسجة الكبد متليفة 9. اجتماع الأطراف تستهدف التشويه والتحريف التي تحتوي على الكولاجين فروع تسلسل الأحماض الأمينية من زخارف حلزونية الثلاثي، وهو أمر شائع في كل أنواع الكولاجين. لذا CMP يمكن اعتباره واسعة الطيف وكيل الكولاجين تلطيخ. هنا، نقدم إجراءات تجريبية مفصلة لط) التصوير فروع الكولاجين في الجسم الحي والتشويه والتحريف ب) تصور الكولاجين في الجسم الحي السابقين أقسام الأنسجة باستخدام CMPS قفص fluorescently المسمى. العلامة الجرد الوطني، IR680، كان مترافق إلى CMP قفص للتصوير الحي، حين إلىتم استخدام البريد carboxyfluorescein (CF) في أنسجة العمل تلطيخ لتوافقه مع المجاهر مضان القياسية. ويركز هذا البروتوكول على تطبيق التصوير من CMPS ما يتعلق منها إعادة عرض الكولاجين. طرق CMP التوليف يمكن العثور عليها في التقارير السابقة 1،7،9-15. في هذا التقرير والفيديو، وقد تم اختيار الهيكل العظمي الأنسجة التصوير في الفئران العادية وأقسام الأنسجة القرنية من الماوس لغرض التظاهر، ولكن الأساليب المقدمة هنا يمكن تطبيقها بسهولة إلى العديد من الأمراض البيولوجية التي تنطوي على نماذج وإعادة عرض الكولاجين (مثل الأورام، والتئام الجروح)، و كذلك أي عينة الأنسجة تقريبا مسبوقة يحتوي الكولاجين.
Protocol
أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا للوائح لجنة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز.
1. بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الإسفار التصوير من الهيكل العظمي الكولاجين إعادة عرض في الجسم الحي
- الصور تفعيل CMP والذيل حقن الوريد في قفص
- إعداد 110 ميكرولتر من الحل في قفص CMP لكل الماوس (20-30 غرام من الوزن الماوس): 100 ميكرولتر من حل لالجرعات، مع حسم إضافي 10 ميكرولتر سادة لاحتمال خسارة أثناء النقل والحقن. مزيج 11 ميكرولتر من IR680-Ahx-NB (GPO) 9 محلول المخزون (400 ميكرومتر) مع 11 ميكرولتر من 100 ميكرومتر السيستين في حل برنامج تلفزيوني العقيمة، ثم يصبح العدد الإجمالي إلى 110 ميكرولتر حجم المخزن المؤقت مع برنامج تلفزيوني 1X. الحل النهائي الببتيد يحتوي على 4 نانومول من IR680-Ahx-NB (GPO) 9 و 1 نانومول من السيستين في 100 ميكرولتر من الحل برنامج تلفزيوني 1X.
- ببطء withdraث الحل الببتيد إلى الأنسولين حقنة 0.5 مل مع برميل شفافة ومقياس صغير (28-30 G) إبرة، وبعناية إزالة فقاعات الهواء. تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية للسماح للمصباح في عملية الاحماء لمدة 2-5 دقيقة.
- وضع حقنة تحتوي على الببتيد مباشرة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر،> 25 ميغاواط / سم 2) لمدة 5 دقائق للسماح الصور التنشيط.
- وفي الوقت نفسه، ضع الماوس في كابح تحت مصباح ساخنة؛ تسمية الفأر مع علامة دائمة على الذيل أو أساليب تحديد الهوية الأخرى مثل علامة الأذن أو أخمص القدمين الوشم، وتطهير الذيل مع الكحول 70٪.
- مباشرة بعد التنشيط للأشعة فوق البنفسجية، وضخ 100 ميكرولتر من تنشيط للأشعة فوق البنفسجية IR680-Ahx-NB (GPO) 9 الحل في الوريد الذيل، وتفضيلي في الجزء الخلفي من الذيل. ضع الماوس مرة أخرى إلى القفص بعد الحقن.
- NIR التصوير مضان من الكولاجين النشاط إعادة عرض
- مجموعةلوحة سخان السرير التصوير من تصوير الدافع إلى 37 درجة مئوية باستخدام بيرل دفعة 2.0 البرمجيات.
- وضع الماوس عارية أو حلق في غرفة التخدير تحريض تحتوي على 2٪ isoflurane والأكسجين في. تحقق من عمق التخدير بواسطة طائرة قلة الحركة أثناء التعامل مع الفأرة وخلال رصد وتيرة التنفس (~ 1/sec).
- بعد تخدير الماوس، فتح درج بيرل تصوير، ووضع الحيوان على السرير التصوير. بسرعة إزالة مخروط الأنف المكونات، وحرك كمامة الماوس، داخل مخروط الأنف للحفاظ على الماوس تحت التخدير (بنسبة 2٪ isoflurane والأكسجين في تسليمها في 2 لتر / دقيقة عن طريق مخروط الأنف) أثناء عملية التصوير. مرة واحدة على الماوس في مكان، أغلق الدرج.
- عندما يشير الصك "جاهزة" على لوحة البرمجيات صورة، انقر فوق "700 قناة"، "الضوء الأبيض" و "85 ميكرون" صناديق تليها "الزر الحصول على صورة". الجرد الوطني (الإثارة 685 نانومتر، 720 نانومتر الانبعاثات) لوبعد ذلك يتم أخذ صور د الضوء الأبيض باستخدام التركيز التلقائي والتعرض.
- عند اكتمال التسجيل، فتح درج، وتحويل الماوس، والحصول على صور من زاوية أخرى. يمكن وضع الماوس مع جبهتها (بطني) والظهر (الظهرية) أو الجانبين التي تواجه الكاميرا. شرائط ضيقة من الشريط يمكن استخدامها كأدوات لتقييد الحرية لتمتد أطرافه للحصول على أفضل عرض من المنطقة ذات الاهتمام (مثل القفص الصدري والكاحلين والمعصمين و).
- والوقت المناسب لمراقبة امتصاص العظمي من IR680-CMP ما بين 24-96 ساعة بعد الحقن (HPI)، استنادا إلى الجرعة (~ 4 نانومول / الماوس). للحصول على صور عالية الدقة، التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق بينما بعد 72 HPI، وإزالة الجلد (والشعر) باستخدام ملقط الجراحة ومقص، وصورة من قبل الجرد الوطني مضان كما هو موضح أعلاه.
- تحليل الصور مضان الجرد الوطني المكتسبة.
2. التصور من الكولاجين في الجسم الحي السابقينأقسام الأنسجة؛ 0
- إعداد المواد
- إعداد 1 مل من 10٪ (ث / ت) حل جيش صرب البوسنة في الماء منزوع الأيونات. ذوبان الجليد 1 مل من مصل الماعز في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. قطع بضع قطع من parafilm في حجم ما يقرب من 2 سم x 5 سم.
- تحضير 10 مل من حجب العازلة عن طريق خلط 500 ميكرولتر من مصل الماعز، 1 مل من برنامج تلفزيوني 10X و 8.5 مل من الماء منزوع الأيونات. إعداد 5 مل من العازلة CMP التخفيف عن طريق تمييع 50 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) BSA مع 4.45 مل من الماء منزوع الأيونات و 500 ميكرولتر 10X PBS.
- تمييع الحلول الأسهم من المسمى carboxyfluorescein قفص CMP، CF NB (GPO) 9 (480 ميكرومتر)، إلى 5 ميكرومتر باستخدام العازلة تخفيف CMP. الأمثل تركيز CMP يختلف 2،5 حتي 30 ميكرومتر، وهذا يتوقف على نوع من الأنسجة وطبيعة عينات الأنسجة. ينصح حجم 100 ميكرولتر لتلطيخ واحد الأنسجة قسم الشريحة. تخزين CMP solut صيغتالأيونات في الظلام.
- السماح للشرائح الأنسجة القرنية الماوس تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. احتضان الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X العازلة لمدة 5 دقائق. تم مسبوقة أنسجة القرنية الماوس المستخدمة في هذه التظاهرة مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني الحل لمدة 1 ساعة، cryopreserved في الأنسجة تيك أكتوبر المتوسطة، cryosectioned إلى 8 سمك ميكرون، والتي شنت على الشرائح الزجاجية المشحونة.
- تلوين الأنسجة والتصوير
- وضع الشرائح في غرفة ترطيب. إلى كل شريحة، وتطبيق 0.5 مل من عرقلة الحل واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الحل حظر بواسطة النشاف الشرائح على منشفة ورقية.
- تطبيق ما يقرب من 100 ميكرولتر من CF NB (GPO) 9 حلول لتغطية أقسام الأنسجة من كل شريحة. احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة للسماح الحل CMP لتتخلل الأنسجة.
- تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية. عندما ارتفعت درجة حرارة المصباح تصل، فضح الأنسجة CMP المغطاة حد ذاتهctions لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 6 دقائق (365 نانومتر، ~ 8 ميغاواط / سم 2) لdeprotect في CMPS في قفص. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وتغطي أقسام الأنسجة من كل شريحة مع قطعة من parafilm لمنع جفاف. وضع الشرائح في غرفة ترطيب واحتضان لهم في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
- إعداد التخفيف 1:3،000 من حل دابي في برنامج تلفزيوني 1X. بعد تلطيخ CMP، وإزالة بلطف Parafilm مع ملقط، وصمة عار على الشرائح على منشفة ورقية لإزالة الحل CMP الزائدة. تطبيق ما يقرب من 100 ميكرولتر من الحلول دابي المخفف إلى كل شريحة الأنسجة واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد تلطيخ، تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X العازلة في جرة تلطيخ لمدة 5 دقائق. كرر هذه 3X في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة ليغسل وكلاء تلطيخ غير منضم.
- إضافة قطرة من تصاعد المتوسطة على قسم الأنسجة وتغطية ذلك مع زلة غطاء زجاجي مع تجنب احتباس فقاعات الهواء. وضع الشرائح في علبة من الورق المقوى شريحة لحمايتها من الضوء.
- الصورة فروع الكولاجين (قناة FITC) ونوى الخلايا (قناة دابي) في الشرائح الأنسجة باستخدام المجهر مضان.
Representative Results
ويبين الشكل 1 نتيجة نموذجية لكيفية توزع IR680-Ahx (GPO) أثار الصورة 9 في SKH1 صحية الإناث الماوس عارية بعد الحقن آخر 24-96 ساعة. فإنه يدل على تراكم CMP الواضح في الهيكل العظمي بعد 24 HPI، وعند هذه النقطة أكثر من الببتيدات غير منضم تم تطهيرها إلى حد كبير. عملية CMP التهجين مع فروع إعادة عرض الكولاجين يبدو بطيئا نسبيا، وخصوصا في المقابل إلى غيرها من تحقيقات التصوير الببتيد (مثل RGD 16). هذا على الأرجح هو بسبب معدل لطي بطء الحلزون الثلاثي الكولاجين 17،18. ومع ذلك، مرة واحدة المهجنة، وفروع CMP ملزمة بقوة إلى الأنسجة كولاجيني، كما يعتبر الحد من إشارة طفيفة فقط بعد 24 HPI (الشكل 1). في 96 HPI، الصورة الجرد الوطني مضان من الفأرة بعد إزالة الجلد يدل بوضوح على امتصاص العظمي من IR680-Ahx (GPO) 9 في العمود الفقري والأضلاع، وكذلك داخل الركبتين والكاحلين والمعصمين، والفك السفلي السفلي (الشكل 2A).
في فيفو السابقين الأنسجة تلطيخ، أثار الصورة fluorescently المسمى-CMPS قفص هجن خصيصا لفروع الكولاجين التشويه والتحريف في أقسام الأنسجة. في الشكل 3، CMP تلطيخ يكشف بوضوح غرامة الألياف الكولاجين موازية في سدى القرنية، والذي يدل على استخدامه كعامل تلطيخ محددة الكولاجين.
الشكل 1. المسلسل الصور مضان الجرد الوطني للماوس عارية تدار عن طريق الوريد مع الصورة decaged IR680-Ahx (GPO) 9 تظهر امتصاص الهيكل العظمي على مدى أربعة أيام. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. الصور مضان الجرد الوطني من الفئران التي تديرها مع الصورة decaged IR680-Ahx (GPO) 9 (A)، في قفص IR680-Ahx-NB (GPO) 9 دون التعرض للأشعة فوق البنفسجية (B)، prefolded الثلاثي حلزونية [IR680-Ahx (GPO ) 9] 3 (C)، أو فصل الحرارة واحدة حبلا IR680-Ahx (GPO) 9 (D) في 96 HPI بعد إزالة الجلد. استهداف الهيكل العظمي من قبل CMP لا يمكن إلا أن الملاحظ في A و D. وترد إشارات مضان الجرد الوطني في نطاق قوس قزح. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. الميكروسكوب مضان من شارك الماوسقسم الأنسجة rneal مسبوقة في امتصاص العرق، وملطخة دابي وأثار الصورة CF (GPO) 9 باستخدام بروتوكول 2، وعرض سدى كولاجيني كثيفة (الملون بواسطة CMP، باللون الأخضر) وكذلك ظهارة البطانة الخلوية و(الملون بواسطة دابي، في الزرقاء () شريط مقياس: 100 ميكرون).
Discussion
كما يمكن أن يرى في هذا البروتوكول، وتسليم CMP واضح وصريح منذ الأشعة فوق البنفسجية تفعيل CMPS قفص هو خطوة إضافية فقط إلى ذيل المشتركة بروتوكولات حقن الوريد 19. والمفتاح هو لحقن تحقيقات الببتيد في دولة واحدة حبلا uncaged ومتبدل الاستقرار. مجموعة قفص يمنع CMP من التجميع الذاتي وملزمة لالكولاجين (الشكل 2B) حتى تتم إزالته بواسطة الأشعة فوق البنفسجية وعند هذه النقطة يبدأ اجتماع الأطراف إلى أضعاف في الحلزون الثلاثي. يحتوي على صياغة حقن السيستين، والتي يمكن أن تتفاعل بسرعة مع المجموعة قفص المشقوق خلال أشعة فوق البنفسجية لتقليل سمية. وقد تم اختبار الفئران عديدة مع سلالات مختلفة (على سبيل المثال SKH-1 و DR-1) باستخدام هذه الصيغة، ونحن لم يكشف أي عيوب الصحة السلوكية أو غيرها في هذه الفئران تصل إلى ستة أشهر. إذا لم الحقن مباشرة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، فإن CMPS أضعاف في اللوالب الثلاثي homotrimeric، التي ليس لها القدرة على التهجينويبين الشكل 2C حالة متطرفة حيث قبل الحقن وCMPS تم تجميعها بالكامل في اللوالب ثلاثة أضعاف بحلول وقت التأخير الطويل (> 2 أيام). للتحايل على هذه المشكلة، ينبغي إعداد الحل CMP في تركيز منخفض نسبيا (على سبيل المثال ~ 40 ميكرومتر)، وحقنها في الفئران مباشرة بعد الأشعة فوق البنفسجية decaging. بسبب الحلزون الثلاثي المعدل البطيء للطي من CMPS في ظروف المخففة (نصف وقت طوي ثانية:> 50 دقيقة) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية قصيرة والوقت الحقن (5 ~ 7 دقائق الكل)، فإن معظم CMPS تدخل إلى مجرى الدم في واحد حبلا النموذج عند ويتبع هذا البروتوكول. ومن المتوقع أن تظل كما خيوط واحد مرة واحدة حقن، CMPS، كما يتم تقليل تركيز من قبل عامل من 20 في بركة الدم، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في معدل اعادة 18. إذا تأخر حقن (على سبيل المثال بسبب التعامل مع الحيوانات) ويشتبه طوي ثانية homotrimeric، الببتيدات تجميعها جزئيا يمكن تنشيطها عن طريق التسخين إلى أعلى من 7076؛ C ليفرق بين CMPS لفروع واحدة، تليها التبريد السريع والحقن. على الرغم من أن أقل ملاءمة، مثل CMPS-فصل الحرارة أيضا تظهر نتائج في الجسم الحي تستهدف (الشكل 2D) المتوقع.
في هذه المظاهرة، واستخدمت الفئران عارية عن قوائم الجرد الوطنية التصوير مضان لتصل إلى 50٪ من إشارة الجرد الوطني يمكن حظره من قبل الشعر. عند العمل مع نماذج الماوس الشعر (وخصوصا منها مع الشعر الأسود)، ونحن نوصي حلق الماوس في المنطقة ذات الاهتمام قبل التصوير باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية أو مزيل الشعر. في الشكل 1، وهناك إشارات إيجابية كاذبة من منطقة البطن الحيوان، والذي كان سببه لصناعة السيارات في مضان من الكلوروفيل في النظام الغذائي للحيوانات. إشارات خلفية مثل هذه يمكن ان تخفض بشكل كبير عن طريق التحول الماوس لحمية تنقية ما يقرب من 4 أيام قبل التصوير. كما رأينا في أرقام 1 و 2A، هناك امتصاصات CMP قوي في زيادة ونقصان الذيله. لذا، لتجنب الآثار الناتجة عن الكمال حقن الوريد الذيل، نوصي طريق الحقن في الجزء الخلفي من الذيل بحيث لا يتم القبض موقع الحقن في الصورة مضان.
اجتماع الأطراف المسمى تمكن استهداف والتصوير من مواقع محددة من الكولاجين في الجسم الحي إعادة التي يصعب الكشف باستخدام طرق أخرى. على سبيل المثال، الدم والبول المقايسات مقرها ELISA-حساسة للالمشقوق شظايا الكولاجين telopeptide، ولكن الأسلوب لا يمكن توطين مصدر دوران الكولاجين، لأنه يستهدف مستضدات للذوبان. وصفت القيود الرئيسية للفي الجسم الحي باستخدام تقنية التصوير الجرد الوطني CMPS هي العمق من الاختراق التوهين والتبريد بواسطة الداني تجميع خلايا الدم الحمراء الهيموجلوبين كما هو فاكهه تقضي الذاتية لل680/710 نانومتر الأصباغ الجرد الوطني. وتشمل التطبيقات المستقبلية من CMP في الجسم الحي التصوير SPECT أو PET التصوير باستخدام CMPS المسمى مع النويدات المشعة التي ينبعث منها أشعة غاما مباشرة أو بوزيترون مع EMItters، للتشخيص من الحالات المرضية التي تنطوي على إعادة تشكيل الكولاجين (مثل هشاشة العظام والتهاب المفاصل وتصلب الشرايين، والتليف). وهذه النظير CMP المسمى الراديو القضاء على القيود المفروضة على فقدان إشارة بسبب عمق الأنسجة وجود خلايا الدم الحمراء المجمعة، وسوف تسمح القياسات الكمية من الأنسجة المريضة. يمكن بالإضافة إلى ذلك، ووقت التصوير في وقت متأخر نسبيا (مثلا 48-96 HPI) الناتجة عن إزالة بطيئة ملزمة وCMPS تجعل من الصعب لمتابعة التغيرات السريعة في إعادة عرض الكولاجين. ويمكن التغلب على مثل هذا التقييد عن طريق زيادة هندسة حركية ملزمة وتقارب من وكلاء التصوير CMP. منذ CMP بربط الكولاجين التشويه والتحريف التي لديها بنية قليلا، والتصوير الكولاجين مقرها CMP-مكملة للجيل الثاني متناسق المجهري التي لا يمكن إلا صورة ألياف الكولاجين 5.
عندما تلطيخ أقسام الأنسجة مع fluorescently المسمى CMPS، وجدنا أنه من المفيد لاحتضانعينات في حلول الببتيد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية في 4 درجات مئوية، لأنه سهل التهجين حلزونية ثلاثية في درجة حرارة أقل 1،20. ووجد أيضا أن تخبط الشرائح العازلة في برنامج تلفزيوني جديد في جرة تلطيخ هي الطريقة الأكثر فعالية ليغسل CMPS غير منضم، والتي تعمل على نحو أفضل بكثير من مجرد pipetting لغسل مخازن على العينات. التهجين CMP-الكولاجين حبلا غير محددة للغاية وقوية، وبالتالي بروتوكول تلطيخ بسيطة المعروضة في هذا الفيديو يمكن تعديلها بسهولة لcostaining المؤشرات الحيوية إضافية، وتحديد الكولاجين المتدهورة في أقسام الأنسجة غير المثبتة. هذا هو بديل فعالة ومريحة لاستخدام الأجسام المضادة للالكولاجين الكولاجين للكشف عن ليفي في عينات نسيجية مختلفة.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر جيلبرت الأخضر للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من NIAMS / المعاهد الوطنية للصحة (R01-AR060484) وزارة الدفاع (W81XWH-12-1-0555) منحت لSMY، والمعاهد الوطنية للصحة من (CA92871 U24 U54 وCA151838) منحت لمجان
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1. |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12. |
| Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
| Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
| Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
| DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
| Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
| Syringes | BD | 329461 | |
| UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
| Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
| Surgical forceps and scissors | |||
| EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
| 20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
| Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
References
- Li, Y., et al. Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).
- Perentes, J. Y., et al. et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).
- Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe. Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).
- Wang, A. Y., et al. Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity. Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).
- Bächinger, H. P., Morris, N. P. Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography. Matrix. 10, 331-338 (1990).
- Li, Y., et al. Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides. Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).
- Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions. Biopolymers. 95, 94-104 (2011).
- Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides. Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).
- Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides. J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).
- Wang, A. Y., et al. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis. Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).
- Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).
- Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds. Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).
- van Hagen, P. M., et al. Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy. Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).
- Boudko, S., et al. Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).
- Ackerman, M. S., et al. Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides. J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Brodsky, B., Persikov, A. V. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).
