Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

विकृत कोलेजन किस्में इमेजिंग Published: January 31, 2014 doi: 10.3791/51052
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1,3
1Department of Bioengineering, University of Utah, 2Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Institute for NanoBiotechnology, Johns Hopkins University

Summary

यह प्रक्रिया आईआर प्रतिदीप्ति चूहों में कोलेजन remodeling गतिविधियों की इमेजिंग के साथ ही विकृत कोलेजन किस्में के साथ संकरण के लिए तस्वीर चालू किया जा सकता है कि बंदी कोलेजन अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड का उपयोग ऊतक वर्गों में कोलेजन की पूर्व vivo धुंधला निकट vivo में दर्शाता है.

Abstract

कोलेजन ऊतक गठन और रखरखाव का समर्थन करता है कि बाह्य मैट्रिक्स का एक प्रमुख संरचनात्मक घटक है. कोलेजन remodeling के सामान्य ऊतकों नवीकरण का एक अभिन्न हिस्सा है हालांकि, remodeling गतिविधि का अत्यधिक मात्रा में ट्यूमर, गठिया, और कई अन्य रोग की स्थिति में शामिल है. कोलेजन remodeling के दौरान, कोलेजन अणुओं की ट्रिपल पेचदार संरचना बाह्य वातावरण में proteases से बाधित है. इसके अलावा, कई ऊतकीय ऊतकों के नमूनों में मौजूद कोलेजन आंशिक रूप से निर्धारण और संरक्षण प्रक्रियाओं द्वारा विकृत कर रहे हैं. इसलिए, इन विकृत कोलेजन किस्में जैविक इमेजिंग के लिए के रूप में प्रभावी लक्ष्यों की सेवा कर सकते हैं. हम पहले से फोटो ट्रिगर कोलेजन के लिए अद्वितीय है जो ट्रिपल पेचदार संरचना, गठन से विकृत कोलेजन किस्में के साथ संकरण के लिए हो सकता है कि एक बंदी कोलेजन अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड (सीएमपी) विकसित की है. इस प्रक्रिया के समग्र लक्ष्यों विकृत कोलेजन किस्में r छवि के लिए) मैं कर रहे हैंvivo में सामान्य remodeling गतिविधियों से esulting, और द्वितीय) फोटो ट्रिगर कैद CMPs का उपयोग पूर्व vivo ऊतक वर्गों में कोलेजन कल्पना करने के लिए. प्रभावी संकरण और vivo और पूर्व vivo इमेजिंग में सफल प्राप्त करने, fluorescently लेबल कैद CMPs फोटो सक्रिय या तो नसों में इंजेक्शन से ठीक पहले कर रहे हैं, या सीधे ऊतक वर्गों पर सक्रिय कर रहे हैं. उपसर्ग माउस कॉर्निया ऊतक वर्गों में नग्न चूहों और कोलेजन में सामान्य कंकाल कोलेजन remolding इस प्रक्रिया में imaged हैं. यहाँ प्रस्तुत सीएमपी-कोलेजन संकरण तकनीक पर आधारित इमेजिंग विधि ऊतक remodeling प्रक्रिया की गहरी समझ को बढ़ावा, साथ ही उच्च कोलेजन remodeling गतिविधि के साथ जुड़े रोगों के लिए नए निदान के विकास की अनुमति दे सकता.

Introduction

कोलेजन, स्तनपायी में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, प्रसार और कोशिकाओं की भिन्नता का समर्थन करके ऊतकों के विकास और उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. रेशेदार कोलेजन (जैसे प्रकार मैं, द्वितीय), संयोजी ऊतक में ऊतकों को यांत्रिक शक्ति देते हैं, नेटवर्क की तरह कोलेजन (प्रकार चतुर्थ) कोशिकाओं देते हैं और संगठित ऊतकों फार्म जहां तहखाने झिल्ली की बुनियादी पाड़ के रूप में. कोलेजन remodeling कोलेजन गिरावट (proteases से) और संश्लेषण (वृद्धि कारकों द्वारा पदोन्नत) दोनों शामिल है. कोलेजन remodeling, हड्डी में उदाहरण के लिए, सामान्य ऊतक नवीकरण प्रक्रिया, अतिरिक्त remodeling गतिविधि, या असामान्य स्थानों में घटना का हिस्सा है हालांकि, आम तौर पर इंगित करता है घाव एक चोट या इस तरह के कैंसर, ऑस्टियोपोरोसिस, गठिया जैसे जीर्ण रोग की स्थिति के जवाब चिकित्सा, और फाइब्रोसिस 1-4. सीधे छवि कोलेजन vivo में remodeling के दौर से गुजर करने की क्षमता प्रगति की समझ सकती हैइन रोगों के आयन, साथ ही नए निदान और चिकित्सा. उदाहरण के लिए, लाइव इमेजिंग गंभीरता और रोगों के स्थान के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और भी नए चिकित्सीय एजेंट की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी रहते चूहों 5 में ट्यूमर में बाह्य मैट्रिक्स remodeling की निगरानी के लिए छवि तंतुमय कोलेजन को लागू किया गया है. हालांकि, इस तकनीक को एक आक्रामक प्रक्रिया है, जो पारदर्शी पृष्ठीय skinfold कक्षों के साथ रखा जा करने जानवरों की आवश्यकता है. कोलेजन remodeling के प्रत्यक्ष और noninvasive इमेजिंग विशेष रूप से remodeling के दौर से गुजर कोलेजन कि लक्ष्य एक जांच से लाभ होगा. इस तरह की जांच यह सामान्य ऊतकों 6 में प्रचुर मात्रा में हैं, जो बरकरार है और परिपक्व कोलेजन, से remodeling कोलेजन भेद करने की जरूरत है के बाद से तैयार करने के लिए मुश्किल है.

कोलेजन है जो ट्रिपल हेलिक्स बुलाया अत्यंत दुर्लभ प्रोटीन संरचना, से बना हैऐसे कोलेजन remodeling के दौरान मैट्रिक्स metalloproteinases (एमएमपी) के रूप में proteases से cleaved. cleaved कोलेजन टुकड़े उनके ट्रिपल पेचदार संरचना खो देते हैं और आगे अविशिष्ट proteases 1 से पच जाता है जो सामने आया किस्में (जिलेटिन), हो जाते हैं. यह हाल ही में ट्रिपल पेचदार संरचना में गुना करने के लिए प्रवृत्ति है जो कोलेजन अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड (सीएमपी) विशेष रूप से या तो गर्मी विकृतीकरण द्वारा या एंजाइमी गिरावट 1,7 द्वारा अपनी ट्रिपल पेचदार राज्य से अलग कर रहे हैं, जो कोलेजन किस्में लक्षित कर सकते हैं कि खोज की थी. बंधन मुख्यतः मोनोमेरिक CMPs और विकृत कोलेजन किस्में के बीच ट्रिपल हेलिक्स संकरण द्वारा संचालित है. CMPs कोलेजन संकरण, एक बंदी सीएमपी के लिए थोड़ा प्रेरणा शक्ति के साथ कमरे के तापमान पर homotrimeric ट्रिपल हेलिक्स में स्वयं को इकट्ठा क्योंकि [(जीपीओ) 4 नायब जीपीओ (जीपीओ) 4, नायब (जीपीओ) 9 के रूप में नामित, हे: हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन], विकसित किया गया था , जो एक तस्वीर cleavable nitrobenzyl शामिलसमूह (नो बॉल) पेप्टाइड की केंद्रीय ग्लाइसिन से जुड़ी. नायब पिंजरे समूह sterically ट्रिपल हेलिक्स में तह से सीएमपी रोकता है, अभी तक, यूवी विकिरण से पिंजरे समूह को हटाने के तुरंत ट्रिपल पेचदार तह और कोलेजन संकरण 1 से चलाता है. निकट अवरक्त (NIR) fluorophores के साथ लेबल मोनोमेरिक CMPs प्रणालीबद्ध चूहों को मॉडल के लिए दिया जाता है, वे विशेष रूप से लक्ष्य और सामान्य (जैसे हड्डी और उपास्थि में) के दौर से गुजर ऊतकों और रोग (जैसे ट्यूमर में) 1 remodeling में विकृत कोलेजन के vivo इमेजिंग में अनुमति दे सकते हैं .

Fluorescently लेबल CMPs भी ऊतकीय ऊतक वर्गों में कोलेजन इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतकीय अध्ययन में, काटा ऊतकों अक्सर सेलुलर घटकों और गिरावट से समग्र ऊतक आकारिकी रखने के निर्धारण द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. गर्मी, और कार्बनिक विलायकों के साथ उपचार, और रासायनिक पार लिंकिन में शामिल हैं जो फिक्सिंग प्रक्रियाओं,जी अभिकर्मकों (जैसे paraformaldehyde), कोलेजन 8 की ट्रिपल पेचदार संरचना denature. इस विकृतीकरण सीएमपी संकरण के लिए साइटों को उत्पन्न करता है. ऐसा लगता है कि fluorescently लेबल CMPs विशेष रूप से और भी अधिक प्रभावी ढंग से तांतव जिगर के ऊतकों 9 में वैकृत शर्तों के सतही पहचान अनुमति दी है जो एक विरोधी कोलेजन एंटीबॉडी, की तुलना में निश्चित ऊतक वर्गों में कोलेजन (जैसे त्वचा, कॉर्निया, और हड्डी) बाध्य कर सकते हैं दिखाया गया है. सीएमपी कोलेजन के सभी प्रकार के लिए आम है जो ट्रिपल पेचदार रूपांकनों के अमीनो एसिड अनुक्रम युक्त विकृत कोलेजन किस्में लक्ष्य. इसलिए सीएमपी एक व्यापक स्पेक्ट्रम कोलेजन धुंधला एजेंट माना जा सकता है. यहाँ, हम fluorescently लेबल कैद CMPs का उपयोग vivo में विकृत कोलेजन किस्में और पूर्व vivo ऊतक वर्गों में द्वितीय) visualizing कोलेजन इमेजिंग) मैं के लिए विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं. एक Nir टैग, IR680, लाइव इमेजिंग, whil के लिए बंदी सीएमपी संयुग्मित गया थाई carboxyfluorescein (सीएफ) मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ अपनी संगतता के लिए ऊतक धुंधला काम में इस्तेमाल किया गया था. इस प्रोटोकॉल कोलेजन remodeling के लिए संबंधित के रूप में CMPs की इमेजिंग आवेदन पर केंद्रित है. सीएमपी संश्लेषण के लिए तरीके पिछली रिपोर्टों 1,7,9-15 में पाया जा सकता है. इस वीडियो रिपोर्ट में, सामान्य चूहों और माउस कॉर्निया के ऊतक वर्गों में इमेजिंग कंकाल ऊतकों प्रदर्शन उद्देश्य के लिए चुना गया है, यहाँ प्रस्तुत तरीकों आसानी के रूप में, कोलेजन remodeling (जैसे ट्यूमर, घाव भरने) से जुड़े कई विकृतियों और जैविक मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है लेकिन अच्छी तरह से कोलेजन होता है कि लगभग किसी भी उपसर्ग ऊतक नमूने के रूप में.

Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन जॉन्स हॉपकिन्स पशु की देखभाल और उपयोग समिति के नियमों के अनुपालन में किया गया.

1. विवो में कंकाल कोलेजन remodeling के अवरक्त (NIR) प्रतिदीप्ति इमेजिंग के पास

  1. बंदी सीएमपी और पूंछ नस इंजेक्शन का फोटो एक्टिवेशन
    1. स्थानांतरण और इंजेक्शन के दौरान संभावित नुकसान के लिए एक अतिरिक्त 10 μl तकिया के साथ, खुराक के लिए समाधान के 100 μl: प्रत्येक माउस के लिए बंदी सीएमपी समाधान के 110 μl (20-30 ग्राम माउस वजन) तैयार करें. IR680-Ahx-नायब (जीपीओ) बाँझ पीबीएस समाधान में 100 माइक्रोन सिस्टीन के 11 μl के साथ 9 शेयर समाधान (400 माइक्रोन) का 11 μl मिक्स, तो 1x पीबीएस बफर के साथ 110 μl के लिए कुल मात्रा लाने. अंतिम पेप्टाइड समाधान IR680-Ahx-नायब (जीपीओ) 9 से 4 nmol और 1x पीबीएस समाधान के 100 μl में सिस्टीन की 1 nmol होता है.
    2. धीरे धीरे withdraध्यान से पेप्टाइड एक पारदर्शी बैरल और एक छोटे गेज (28-30 जी) सुई के साथ एक 0.5 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में समाधान, और डब्ल्यू हवाई बुलबुले को दूर. दीपक 2-5 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिए यूवी लैंप पर बारी.
    3. फोटो सक्रियण की अनुमति के लिए सीधे 5 मिनट के लिए यूवी लैंप (365 एनएम,> 25 मेगावाट / 2 सेमी) के तहत पेप्टाइड युक्त सिरिंज रखें.
    4. इस बीच, एक गर्म दीपक के नीचे एक restrainer में माउस की स्थिति, पूंछ या कान टैग या पैर की अंगुली टैटू के रूप में अन्य पहचान तरीकों पर एक स्थायी मार्कर के साथ माउस लेबल, और 70% शराब के साथ पूंछ कीटाणुरहित.
    5. तुरंत यूवी सक्रियण के बाद, preferentially पूंछ के पीछे भाग में, यूवी सक्रिय IR680-Ahx-नायब (जीपीओ) पूंछ नस में 9 समाधान के 100 μl इंजेक्षन. इंजेक्शन के बाद वापस पिंजरे में माउस रखें.
  2. कोलेजन remodeling गतिविधि की NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग
    1. समूहपर्ल आवेग 2.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस तक आवेग इमेजर की इमेजिंग बिस्तर का हीटर प्लेट.
    2. ऑक्सीजन में 2% isoflurane युक्त संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में नग्न या मुंडा माउस रखो. से निपटने के दौरान और respirations की आवृत्ति (~ 1/sec) की निगरानी के द्वारा माउस आंदोलन की कमी से संज्ञाहरण विमान की गहराई सत्यापित करें.
    3. माउस anesthetized है, के बाद पर्ल इमेजर दराज खोलने, और इमेजिंग बिस्तर पर जानवरों की जगह. जल्दी नाक शंकु प्लग हटा दें, और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान (नाक शंकु के माध्यम से / मिनट 2 एल पर दिया ऑक्सीजन में 2 isoflurane%) द्वारा संज्ञाहरण के तहत माउस रखने के लिए नाक शंकु के अंदर माउस के थूथन स्लाइड. माउस जगह में एक बार, दराज बंद करें.
    4. साधन छवि सॉफ्टवेयर पैनल पर "तैयार" इंगित करता है, छवि अधिग्रहण "बटन" के बाद बक्से "" 700 चैनल, "" सफेद प्रकाश "और" 85 माइक्रोन क्लिक करें. NIR (उत्तेजना 685 एनएम, उत्सर्जन 720 एनएम) एकडी व्हाइट प्रकाश तस्वीरें तो स्वत: ध्यान और जोखिम का उपयोग कर लिया जाएगा.
    5. रिकॉर्डिंग पूरी हो जाए,, दराज खोलने माउस बारी है, और एक अन्य कोण से प्राप्त चित्रों के. माउस वापस अपने सामने (उदर), (पृष्ठीय) या कैमरे का सामना करना पड़ पक्ष के साथ रखा जा सकता है. मजबूरी ब्याज के क्षेत्र (जैसे रिब पिंजरे, टखनों, और कलाई) का सबसे अच्छा दृश्य प्राप्त करने के लिए अपने हाथ पैर फैलाने के लिए के रूप में टेप की संकीर्ण स्ट्रिप्स इस्तेमाल किया जा सकता है.
    6. IR680-सीएमपी का कंकाल तेज निरीक्षण करने के लिए एक उचित समय खुराक (~ 4 nmol / माउस) पर आधारित है, 24-96 घंटे बाद इंजेक्शन (HPI) के बीच है. , उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त 72 HPI के बाद, सर्जिकल संदंश और कैंची का उपयोग त्वचा (और बाल) को हटाने गहरी संज्ञाहरण के तहत जबकि गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस बलिदान, और जैसा कि ऊपर वर्णित NIR प्रतिदीप्ति द्वारा छवि यह करने के लिए.
    7. का अधिग्रहण NIR प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण.

2. पूर्व में कोलेजन के दृश्य विवो0; ऊतक वर्गों

  1. माल की तैयारी
    1. 10% से 1 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में (w / v) बीएसए समाधान तैयार करें. कमरे के तापमान पर एक पानी के स्नान में बकरी सीरम के 1 मिलीलीटर पिघलना. एक्स 5 सेमी लगभग 2 सेमी के आकार में Parafilm के कुछ टुकड़े काटें.
    2. बकरी सीरम के 500 μl, 10x पीबीएस के 1 मिलीग्राम और विआयनीकृत पानी की 8.5 मिलीलीटर मिश्रण से अवरुद्ध बफर के 10 एमएल तैयार करें. विआयनीकृत पानी की 4.45 मिलीग्राम और 500 μl 10x पीबीएस के साथ (w / v) बीएसए 10% का 50 μl गिराए द्वारा सीएमपी कमजोर पड़ने बफर के 5 एमएल तैयार करें.
    3. सीएमपी कमजोर पड़ने बफर का उपयोग 5 माइक्रोन के लिए, carboxyfluorescein लेबल कैद सीएमपी, सीएफ नायब (जीपीओ) 9 (480 माइक्रोन) के शेयर समाधान पतला. इष्टतम सीएमपी एकाग्रता ऊतकों के प्रकार और ऊतकों के नमूनों की प्रकृति पर निर्भर करता है, 2.5-30 माइक्रोन से भिन्न होता है. 100 μl की एक मात्रा एक ऊतक अनुभाग स्लाइड धुंधला करने के लिए सिफारिश की है. तैयार सीएमपी solut स्टोरअंधेरे में आयनों.
    4. माउस कॉर्निया ऊतक स्लाइड कमरे के तापमान को संतुलित करना. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस बफर में स्लाइड्स सेते हैं. इस प्रदर्शन में इस्तेमाल माउस कॉर्निया ऊतकों 8 माइक्रोन मोटाई को cryosectioned ऊतक टेक अक्टूबर माध्यम में cryopreserved 1 घंटा,, के लिए पीबीएस समाधान में 4% paraformaldehyde के साथ उपसर्ग, और आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर बढ़ गया है.
  2. ऊतक धुंधला हो जाना और इमेजिंग
    1. एक humidified कक्ष में स्लाइड रखें. प्रत्येक स्लाइड के लिए, अवरुद्ध समाधान के 0.5 मिलीलीटर लागू करते हैं और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं. एक कागज तौलिया पर स्लाइड सोख्ता द्वारा अवरुद्ध समाधान निकालें.
    2. प्रत्येक स्लाइड के ऊतक वर्गों को कवर करने के सीएफ नायब (जीपीओ) 9 समाधान के लगभग 100 μl लागू करें. सीएमपी समाधान ऊतकों तर करने के लिए अनुमति देने के लिए 2 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं.
    3. यूवी दीपक पर मुड़ें. दीपक गरम किया जाता है, सीएमपी से ढके ऊतक का पर्दाफाश एसईबंदी CMPs deprotect के लिए 6 मिनट (365 एनएम, ~ 8 मेगावाट / 2 सेमी) के लिए पराबैंगनी प्रकाश में ctions. यूवी जोखिम के बाद, सुखाने को रोकने के लिए Parafilm के एक टुकड़े के साथ प्रत्येक स्लाइड के ऊतक वर्गों को कवर किया. Humidified कक्ष में स्लाइड्स प्लेस और 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं.
    4. 1x पीबीएस में DAPI समाधान की एक 1:3,000 कमजोर पड़ने को तैयार है. सीएमपी धुंधला के बाद, धीरे संदंश के साथ Parafilm हटाने, और अतिरिक्त सीएमपी समाधान निकालने के लिए एक कागज तौलिया पर स्लाइड दाग. प्रत्येक ऊतक स्लाइड को पतला DAPI समाधान के लगभग 100 μl लागू करें और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. धुंधला के बाद, 5 मिनट के लिए एक धुंधला जार में 1x पीबीएस बफर में विसर्जित स्लाइड. अनबाउंड धुंधला एजेंटों से धो ताजा 1x पीबीएस में इस 3x दोहराएँ.
    6. ऊतक खंड पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें और हवाई बुलबुले फँसाने से परहेज करते हुए एक गिलास को कवर पर्ची के साथ कवर. प्रकाश से बचाने के लिए एक गत्ता स्लाइड ट्रे में स्लाइड्स रखो.
    7. छवि कोलेजन किस्में (FITC चैनल) और सेल नाभिक (DAPI चैनल) एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग ऊतक स्लाइड्स में.

Representative Results

चित्रा 1 फोटो ट्रिगर IR680-Ahx-(जीपीओ) 9 24-96 घंटे बाद इंजेक्शन के बाद एक स्वस्थ महिला SKH1 नग्न माउस में वितरित करता है कि कैसे एक ठेठ परिणाम से पता चलता है. यह अपार पेप्टाइड्स के सबसे बड़े पैमाने पर बाहर साफ हो गया है जो बिंदु पर, 24 HPI के बाद कंकाल में स्पष्ट सीएमपी संचय से पता चलता है. remodeling कोलेजन किस्में साथ hybridizing सीएमपी की प्रक्रिया विशेष रूप से अन्य पेप्टाइड इमेजिंग जांच (जैसे RGD 16) के विपरीत, अपेक्षाकृत धीमी गति से लगता है. यह सबसे अधिक संभावना है, क्योंकि कोलेजन ट्रिपल हेलिक्स 17,18 की धीमी तह दर की है. केवल मामूली संकेत कमी 24 HPI (चित्रा 1) के बाद देखा जाता है लेकिन, जैसा कि एक बार संकरित, सीएमपी किस्में दृढ़ता, श्लेषजनउत्पादी ऊतकों के लिए बाध्य कर रहे हैं. 96 HPI में, त्वचा को हटाने के बाद माउस की NIR प्रतिदीप्ति छवि स्पष्ट रूप से IR680-Ahx-(जीपीओ) के कंकाल तेज दर्शाता रीढ़ की हड्डी और पसलियों में, साथ ही घुटनों के भीतर 9, एड़ियों,कलाई, और निचले mandibles (2A चित्रा).

पूर्व vivo ऊतक धुंधला में, फोटो ट्रिगर fluorescently लेबल कैद CMPs विशेष रूप से ऊतक वर्गों में विकृत कोलेजन किस्में को संकरण. चित्रा 3 में, सीएमपी धुंधला स्पष्ट रूप से एक कोलेजन विशिष्ट धुंधला एजेंट के रूप में इसके उपयोग को दर्शाता है जो कार्निया स्ट्रोमा में ठीक समानांतर कोलेजन तंतुओं का पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक नग्न माउस के सीरियल NIR प्रतिदीप्ति छवियों 9 चार दिनों में कंकाल तेज दिखा फोटो decaged IR680-Ahx-(जीपीओ) के साथ नसों के द्वारा प्रशासित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2 चित्रा 2. फोटो decaged IR680-Ahx-(जीपीओ) के साथ प्रशासित चूहों की NIR प्रतिदीप्ति छवियों 9 (ए), यूवी जोखिम (बी) के बिना IR680-Ahx-नायब (जीपीओ) 9 बंदी, ट्रिपल पेचदार [IR680-Ahx-(जीपीओ prefolded सीएमपी से त्वचा को हटाने के बाद 96 HPI पर) 9] 3 (सी), या गर्मी अलग एकल किनारा IR680-Ahx-(जीपीओ) 9 (डी). कंकाल लक्ष्यीकरण केवल एक और डी में देखा जा सकता है. NIR प्रतिदीप्ति संकेत इंद्रधनुष पैमाने में दिखाया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक माउस सह के प्रतिदीप्ति micrographsrneal ऊतक अनुभाग paraformaldehyde में उपसर्ग, और DAPI और फोटो ट्रिगर सीएफ (जीपीओ) के साथ दाग 9, प्रोटोकॉल 2 का उपयोग कर (हरे रंग में सीएमपी से सना हुआ,) घने श्लेषजनउत्पादी स्ट्रोमा प्रदर्शित करने के साथ ही नीले रंग में सेलुलर उपकला और endothelium (DAPI से सना हुआ, ) (पैमाने पर पट्टी: 100 माइक्रोन).

Discussion

इस प्रोटोकॉल में देखा जा सकता है बंदी CMPs की यूवी सक्रियण आम पूंछ नस इंजेक्शन प्रोटोकॉल 19 को ही अतिरिक्त कदम है के बाद से, सीएमपी का वितरण सीधा है. कुंजी एक Uncaged और metastable एकल कतरा राज्य में पेप्टाइड जांच इंजेक्षन है. पिंजरे समूह स्वयं विधानसभा से सीएमपी रोकता है और यह सीएमपी ट्रिपल हेलिक्स में गुना करने के लिए शुरू होता है, जो बिंदु पर पराबैंगनी प्रकाश से निकाल दिया जाता है जब तक कोलेजन (चित्रा 2 बी) के लिए बाइंडिंग. इंजेक्शन तैयार करने के लिए जल्दी विषाक्तता को कम करने के लिए पराबैंगनी विकिरण के दौरान cleaved पिंजरे समूह के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं जो सिस्टीन, शामिल हैं. विभिन्न प्रकारों (जैसे SKH -1 और डॉ.-1) के साथ कई चूहों इस निर्माण का उपयोग कर परीक्षण किया गया है, और हम छह महीने तक इन चूहों में किसी भी व्यवहार या अन्य स्वास्थ्य दोषों का पता नहीं चला. इंजेक्शन यूवी जोखिम के तुरंत बाद का पालन नहीं करता है, CMPs कोई संकरण की क्षमता है, जो homotrimeric ट्रिपल हेलिक्स में गुना होगा. चित्रा -2 इंजेक्शन के लिए पहले CMPs पूरी तरह से लंबे समय से देरी समय (> 2 दिन) द्वारा ट्रिपल हेलिक्स में पुन: संयोजित किया गया है, जहां एक चरम मामले से पता चलता है. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, सीएमपी समाधान अपेक्षाकृत कम एकाग्रता (जैसे ~ 40 माइक्रोन) में तैयार किया, और तुरंत यूवी decaging के बाद चूहों में इंजेक्शन की जानी चाहिए. क्योंकि कमजोर स्थिति में CMPs की धीमी गति ट्रिपल हेलिक्स तह दर (refolding का आधा समय:> 50 मिनट) का और कम जोखिम यूवी और इंजेक्शन समय (5 ~ 7 मिनट कुल), CMPs के अधिकांश में एकल खून में प्रवेश इस प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है जब प्रपत्र किनारा. एकाग्रता reassembling दर 18 में नाटकीय कमी के लिए अग्रणी रक्त पूल में 20 का एक पहलू से कम हो जाता है के रूप में एक बार इंजेक्शन, CMPs, एकल किस्में के रूप में रहने की उम्मीद कर रहे हैं. इंजेक्शन देरी हो रही है (जैसे की वजह से जानवर से निपटने के लिए) और homotrimeric refolding संदिग्ध है, आंशिक रूप से इकट्ठे पेप्टाइड्स 70 से ऊपर के लिए हीटिंग द्वारा सक्रिय किया जा सकता है76, सी शीघ्र ठंडा और इंजेक्शन द्वारा पीछा एकल किस्में, को CMPs अलग कर देना. कम सुविधाजनक हालांकि, ऐसी गर्मी अलग CMPs भी चित्रा (2 डी) को निशाना बनाने में विवो के नतीजे उम्मीद दिखा.

NIR संकेत के ऊपर से 50% बाल द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है क्योंकि इस प्रदर्शन में, नग्न चूहों NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया. बालों माउस मॉडल (काला बाल के साथ विशेष रूप से लोगों) के साथ काम करते हैं, हम एक इलेक्ट्रिक शेवर या बाल हटानेवाला का उपयोग इमेजिंग के लिए पहले ब्याज के क्षेत्र में माउस हजामत बनाने की सलाह देते हैं. चित्रा 1 में, पशु आहार में chlorophylls के ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण होता है जो जानवर के पेट क्षेत्र से झूठी सकारात्मक संकेत भी हैं. इस तरह की पृष्ठभूमि संकेत काफी लगभग 4 दिन पहले इमेजिंग शुद्ध करने के लिए भोजन करने के लिए माउस स्विचन द्वारा कम किया जा सकता है. आंकड़े 1 और 2 में देखा, मजबूत सीएमपी uptakes चक्कर में कर रहे हैंई. इसलिए, अपूर्ण पूंछ नस इंजेक्शन से उत्पन्न कलाकृतियों से बचने के लिए, हम इंजेक्शन साइट प्रतिदीप्ति छवि में कब्जा नहीं है कि इतनी पूंछ के पीछे भाग में इंजेक्शन लगाने की सलाह देते हैं.

लेबल सीएमपी अन्य तरीकों का उपयोग कर पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है कि इन विवो में कोलेजन remodeling के विशिष्ट स्थानों को निशाना और इमेजिंग में सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, एलिसा आधारित रक्त और मूत्र assays cleaved कोलेजन telopeptide टुकड़े के लिए संवेदनशील हैं, लेकिन यह घुलनशील एंटीजन को लक्षित करता है क्योंकि विधि, कोलेजन कारोबार का स्रोत स्थानीय बनाना नहीं कर सकते हैं. NIR का उपयोग vivo इमेजिंग तकनीक के मुख्य सीमाओं हीमोग्लोबिन 680/710 एनएम NIR रंगों की एक अंतर्जात पीने की वस्तु के रूप में CMPs समीपस्थ जमा लाल कोशिकाओं द्वारा गहराई से पैठ क्षीणन और शमन हैं लेबल. Vivo इमेजिंग में सीएमपी का भविष्य अनुप्रयोगों प्रत्यक्ष गामा उत्सर्जन radionuclides के साथ या पोजीट्रान ईएमआई के साथ लेबल CMPs का उपयोग SPECT या पीईटी इमेजिंग शामिलtters, कोलेजन remodeling (जैसे ऑस्टियोपोरोसिस, गठिया, atherosclerosis, और फाइब्रोसिस) से जुड़े रोग राज्यों के निदान के लिए. ये रेडियो लेबल सीएमपी analogs ऊतक गहराई और जमा लाल कोशिकाओं की उपस्थिति की वजह से संकेत नुकसान की सीमाओं को समाप्त होगा, और रोगग्रस्त ऊतकों की मात्रात्मक माप की अनुमति देगा. इसके अलावा, अपेक्षाकृत देर इमेजिंग समय (जैसे 48-96 HPI) CMPs की धीमी बाध्यकारी और मंजूरी से उत्पन्न यह मुश्किल कोलेजन remodeling में तेजी से परिवर्तन का पालन करने के लिए कर सकता है. ये सीमा बंधन कैनेटीक्स और सीएमपी इमेजिंग एजेंट की आत्मीयता के आगे इंजीनियरिंग द्वारा दूर किया जा सकता है. सीएमपी छोटी संरचना है जो विकृत कोलेजन को बांध के बाद से, सीएमपी आधारित कोलेजन इमेजिंग जो कर सकते हैं केवल छवि कोलेजन फाइबर 5 दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी के पूरक है.

Fluorescently लेबल CMPs साथ ऊतक वर्गों धुंधला हो जाना, हम इसे लाभप्रद सेते पाया4 डिग्री सेल्सियस, पर यूवी सक्रिय पेप्टाइड समाधान में नमूने ट्रिपल पेचदार संकरण कम तापमान 1,20 में मदद की है क्योंकि. यह भी एक धुंधला जार में ताजा पीबीएस बफर में स्लाइड्स डुबो केवल नमूने के ऊपर धोने बफ़र्स pipetting से बेहतर काम करता है, जो अपार CMPs बंद धोने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है कि पाया गया था. सीएमपी-कोलेजन किनारा संकरण बहुत विशिष्ट और मजबूत है, इसलिए इस वीडियो में प्रस्तुत सरल धुंधला प्रोटोकॉल तत्काल अतिरिक्त बायोमार्कर costaining के लिए संशोधित, और unfixed ऊतक वर्गों में अपमानित कोलेजन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. यह विभिन्न ऊतकीय नमूनों में रेशेदार कोलेजन का पता लगाने के लिए विरोधी कोलेजन एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए एक प्रभावी और सुविधाजनक विकल्प है.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों तकनीकी सहायता के लिए गिल्बर्ट ग्रीन धन्यवाद. इस काम एमजीपी को सम्मानित किया NIAMS / एनआईएच (R01-AR060484) और DOD (W81XWH-12-1-0555) SMY को सम्मानित किया, से और एनआईएच (U24 CA92871 और U54 CA151838) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRdye 680RD Maleimide (IR680) LI-COR 929-71050 Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1.
5(6)-Carboxyfluorescein Sigma 21877-5G-F Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12.
Cysteine Advanced Chemtech YC2200
Isoflurane Butler Veterinary Supply 4/4/5260
Goat Serum Sigma G9023-10ML
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma A9647
DAPI Roche Applied Science 10236276001
Fluoroshield mounting medium Sigma F6182-20ML
Syringes BD 329461
UV lamp McMaster-Carr 1447T17
Pearl impulse imager LI-COR 9400
Surgical forceps and scissors
EasyDip slide staining system Light Labs M900-12B
20-place cardboard microscope slide tray Light Labs
Cover glasses Fisher 12-545-c
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE2000-E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Y., et al. Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).
  3. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
  4. Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).
  5. Perentes, J. Y., et al. et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).
  6. Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe. Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).
  7. Wang, A. Y., et al. Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity. Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).
  8. Bächinger, H. P., Morris, N. P. Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography. Matrix. 10, 331-338 (1990).
  9. Li, Y., et al. Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides. Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).
  10. Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions. Biopolymers. 95, 94-104 (2011).
  11. Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides. Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).
  12. Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides. J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).
  13. Wang, A. Y., et al. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis. Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).
  14. Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).
  15. Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds. Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).
  16. van Hagen, P. M., et al. Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy. Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).
  17. Boudko, S., et al. Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).
  18. Ackerman, M. S., et al. Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides. J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).
  19. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  20. Brodsky, B., Persikov, A. V. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 83 कोलेजन remodeling ट्रिपल हेलिक्स निकट अवरक्त प्रतिदीप्ति bioimaging ऊतक धुंधला
विकृत कोलेजन किस्में इमेजिंग<em&gt; में विवो</em&gt; और<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; कैद कोलेजन अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड्स के फोटो ट्रिगर संकरण के माध्यम से
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Foss, C. A., Pomper, M. G.,… More

Li, Y., Foss, C. A., Pomper, M. G., Yu, S. M. Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides. J. Vis. Exp. (83), e51052, doi:10.3791/51052 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter