Summary
この手順では、IR、蛍光マウスでのコラーゲンのリモデリング活動の画像化だけでなく、変性コラーゲンの鎖とハイブリダイズするために、光トリガすることができるケージコラーゲン模倣ペプチドを使用して、組織切片におけるコラーゲンのex vivo染色に近い生体内で示しています。
Abstract
コラーゲンは、組織の形成と維持をサポートする細胞外マトリックスの主要な構造成分である。コラーゲンリモデリングは、正常組織再生の不可欠な部分であるが、リモデリング活性の過剰量は、腫瘍、関節炎、および他の多くの病的状態に関与している。コラーゲンリモデリングの際に、コラーゲン分子の三重らせん構造は細胞外環境中のプロテアーゼによって破壊されている。さらに、多くの組織学的組織サンプル中に存在するコラーゲンは、部分的に固定および保存プロセスによって変性される。したがって、これらの変性コラーゲン鎖は、生物学的イメージング用として有効なターゲットを提供することができます。我々は以前に、光トリガコラーゲンに固有のものである三重らせん構造を形成することにより、変性コラーゲンの鎖とハイブリダイズすることができるケージドコラーゲン模倣ペプチド（CMP）を開発した。この手順の全体的な目標は、イメージ変性コラーゲンストランドrに）私です生体内で正常な改造活動esultingと、ii）光トリガリテーナ入りのCMPを使用してex vivoで組織切片中のコラーゲンを可視化する。効果的なハイブリダイゼーションおよびin vivoおよび ex vivoイメージングで成功を達成するために、蛍光標識されたケージドのCMPは、光活性化のいずれかの静脈内注射の直前に、または直接に組織切片上で活性化される。接頭辞付きマウス角膜組織切片におけるヌードマウスやコラーゲンの正常な骨格コラーゲン再成形は、この手順で画像化されています。ここで提示CMP-コラーゲンブリダイゼーション技術は、組織リモデリング過程のより深い理解につながるだけでなく、高いコラーゲンリモデリング活性に関連する疾患のための新しい診断法の開発を可能性に基づいて、撮像方法。
Introduction
コラーゲンは、哺乳類において最も豊富なタンパク質は、細胞の増殖および分化をサポートすることにより、組織の発生および再生において重要な役割を果たしている。繊維状コラーゲン（ 例えば、I型、II）、結合組織に組織に機械的強度を得ながら、網目状コラーゲン（タイプIV）は、細胞が付着し、編成組織を形成、基底膜の基本的な足場を形成する。コラーゲンリモデリングは、コラーゲン分解（プロテアーゼによる）及び合成（増殖因子によって促進さ）の両方を含む。コラーゲンリモデリングは、骨内、例えば、異常な場所に正常組織再生過程の一部、過剰のリモデリング活性、又はその発生であるが、典型的には、損傷または癌、骨粗しょう症、関節炎などの慢性の病的状態に対する創傷治癒応答を示し、線維化1-4。直接画像コラーゲンは、生体内での改造を受けている能力は、進行の理解につながる可能性がこれらの疾患のイオンだけでなく、新しい診断および治療。例えば、ライブイメージングは、疾患の重症度および位置に関する情報を提供することができ、また、新しい治療薬の有効性を評価するために使用することができる。多光子レーザー走査顕微鏡と第二高調波発生は、生きたマウス5における腫瘍における細胞外マトリックスリモデリングをモニタリングするための画像線維性コラーゲンに適用されている。しかしながら、この技術は、侵襲的な処置である、透明な背部皮下脂肪室に取り付けられるように動物を必要とする。コラーゲンリモデリングの直接的かつ非侵襲的イメージングは、具体的にリモデリングを受けているコラーゲンをターゲットとプローブの恩恵を受ける。そのようなプローブは、正常組織6に豊富に存在し、無傷の成熟コラーゲン、コラーゲンのリモデリングを区別する必要があるため、製造することは困難である。
コラーゲンは、ある三重らせんと呼ばれる非常にまれなタンパク質の構造から構成されているコラーゲンリモデリング中にこのようなマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）のようなプロテアーゼによって切断。切断されたコラーゲン断片は、その三重らせん構造を失い、さらに非特異的プロテアーゼ1によって消化されて展開されたストランド（ゼラチン）、となります。それが最近、三重らせん構造に折り畳まれる傾向がありコラーゲン模倣ペプチド（CMP）は、具体的のどちらか熱変性によって、または酵素分解1,7によってその重らせん状態から解離されたコラーゲン鎖を標的にすることができることが発見されました。結合は、主に、モノマーのCMPおよび変性コラーゲン鎖間の三重らせんブリダイゼーションによって駆動される。のCMPは、コラーゲンブリダイゼーション、ケージのCMPのために少し駆動力を用いて室温でホモ三量体三重らせんに自己組織化するので、[（GPO）4 NB GPO（GPO）4、NB（GPO）9として指定された、O：ヒドロキシプロリン]、開発されました、光切断ニトロが含まれているグループ（NB）ペプチドの中心グリシンに取り付ける。 NBケージ·グループは、立体的に三重らせんへの折り畳みから、CMPを防ぎ、まだ、UV照射によるケージ基の除去は、すぐに三重らせん折りたたみ及びコラーゲンハイブリダイゼーション1をトリガします。近赤外（NIR）蛍光体で標識単量体のCMPが全身マウスをモデル化するために配信されると、それらは特異的に標的と通常（ 例えば 、骨や軟骨）を受けている組織や病理学（ 例えば腫瘍中の）1を再構築において、変性コラーゲンのin vivoイメージングに許可することができます。
蛍光標識のCMPはまた、組織学的組織切片中のコラーゲンを撮像するために使用することができる。組織学的研究では、採取した組織は、多くの場合、細胞成分や劣化からの全体的な組織形態を維持するために固定することにより保存されています。熱、有機溶剤を用いた治療、および化学的リンキンを含む固定手順、G試薬（ 例えばホルムアルデヒド）、コラーゲン8の三重らせん構造を変性させる。この変性は、CMPのハイブリダイゼーションのためのサイトを生成します。これは、その蛍光標識のCMPは、特により一層効果的に肝線維化組織9における病的状態の容易な同定を可能にし、抗コラーゲン抗体、より固定された組織切片中のコラーゲンに（ 例えば 、皮膚、角膜、および骨）に結合することができることが示されている。 CMPは、コラーゲンのすべてのタイプに共通である三重らせんモチーフのアミノ酸配列を含有する変性コラーゲン鎖を標的とする。したがってCMPは、広域スペクトルのコラーゲン染色剤と考えることができる。ここでは、 生体内で変性コラーゲン鎖を画像化するiのための詳細な実験手順）を提示及びii）蛍光標識されたケージドのCMPを用いてex vivoで組織切片中のコラーゲンを可視化する。 NIRタグ、IR680、ライブイメージングのためにケージに入れ、CMPに結合させた、ウコン電子のカルボキシフルオレセイン（CF）を、標準的な蛍光顕微鏡との互換性のために、組織染色作業で使用した。このプロトコルは、コラーゲンのリモデリングに関連するものとしてのCMPのイメージングアプリケーションに焦点を当てています。 CMPの合成のための方法には、これまでの報告1,7,9-15に記載されています。このビデオ報告では、正常なマウスおよびマウス角膜の組織切片における撮像骨格組織は、デモンストレーション目的のために選択したが、ここに提示される方法は、容易に、コラーゲンのリモデリング（ 例えば、腫瘍、創傷治癒）を含む多くの病理的および生物学的モデルを適用することができるがよくコラーゲンが含まれているほぼすべての先頭に組織サンプルに関して。
Protocol
すべての動物実験は、ジョンズホプキンス動物実験委員会の規定を遵守して実施された。
1。 生体内における骨格コラーゲンリモデリングの近赤外（NIR）蛍光イメージング
- ケージCMPおよび尾静脈注射の光活性化
- とインジェクションの間の可能な損失のための余分な10μLのクッションで、投与のための溶液100μl：各マウス用ケージのCMP液110μL（20〜30グラムマウス体重）を準備します。滅菌PBS溶液中の100μMのシステインの11μlのIR680-AHX-NB（GPO）9ストック溶液（400μM）の11μLを混合してから、1×PBS緩衝液で110μlに全量を。最終的なペプチド溶液を1X PBS溶液100μl中4 IR680-AHX-NBのナノモル（GPO）9とシステインの1ナノモルが含まれています。
- ゆっくりwithdra慎重にペプチド透明バレルと小さなゲージ（28〜30 G）針で0.5ミリリットルのインスリン注射器に溶液、およびワット気泡を除去。ランプが2〜5分間のウォームアップできるようにするためにUVランプをオンにします。
- 光活性化を可能にするために、直接5分間UVランプ（365nmで、> 25 MW / cm 2）を下にペプチド含有注射器を置きます。
- 一方、加熱されたランプの下の制止にマウスを置き、尾や、耳のタグやつま先のタトゥーなど、他の識別方法に油性ペンでマウスをラベル、および70％のアルコールで尾を消毒。
- すぐに紫外線活性化の後に、優先的に尾の後部で、尾静脈に紫外線活性化IR680-AHX-NB（GPO）9溶液100μlを注入。注射の後に戻ってケージにマウスを置きます。
- コラーゲンリモデリング活性のNIR蛍光イメージング
- セットパールインパルス2.0ソフトウェアを用いて37℃にインパルス撮像装置の撮影台のヒータープレート。
- 酸素の2％イソフルランを含む麻酔導入室にヌードや剃ったマウスを置く。取扱い中および呼吸の頻度（〜1/sec）を監視することにより、マウスの動きの欠如によって麻酔面の深さを確認してください。
- マウスを麻酔した後、パールイメージャ引き出しを開き、イメージングベッドの上で動物を配置します。素早くノーズコーンプラグを取り外し、およびイメージングプロセスの間に（ノーズコーンを通して2リットル/分で供給酸素の2％イソフルランによって）麻酔下でマウスを維持するためにノーズコーンの内側に、マウスの銃口をスライドさせます。マウスが配置されると、引き出しを閉じます。
- 楽器はImageソフトウェアパネルに「READY」を示している場合、画像を取得する「ボタン」に続くボックス」「700チャンネル」、「白色光」と「85ミクロンをクリックします。 NIR（励起685 nm、発光720 nm）をAND白色光の写真は、自動ピントと露出を使用して撮影されます。
- 記録が完了すると、引出しを開き、マウスをオンにし、別の角度から画像を取得する。マウスは、後ろから前（腹側）、（背側）、またはカメラを対向面に配置することができます。テープの幅の狭いストリップは、関心のある領域（ 例えば胸郭、足首、手首）の最高のビューを取得するために、その手足を伸ばすために制約として使用することができます。
- IR680-CMPの骨格取り込みを観察するための適切な時間は、投与量（〜4ナノモル/マウス）に基づいて、24〜96時間後に注射（HPI）の間にある。上記のようなNIR蛍光によってそれを、高解像度の画像を取得する72 HPI後、深い麻酔下で、皮膚（毛髪）を削除しながら、頸椎脱臼によりマウスを犠牲外科鉗子やハサミを使って、イメージに。
- 獲得した近赤外蛍光画像を分析します。
2。 ex vivoでコラーゲンの可視化0;組織切片
- 材料の準備
- 10パーセントの1ミリリットル脱イオン水（w / v）のBSA溶液を準備します。室温で水浴中でヤギ血清1mlの解凍する。 X 5センチメートル約2cmの大きさのパラフィルムのいくつかの作品をカット。
- ヤギ血清500μlを、10倍のPBSの1ミリリットルの脱イオン水8.5ミリリットルを混合することにより、ブロッキング緩衝液10ミリリットルを用意します。脱イオン水4.45ミリリットルと500μlの10倍のPBSで（W / V）のBSA 10パーセントの50μLを希釈することにより、CMP希釈緩衝液5mlを準備します。
- CMP希釈バッファーを使用して、5μmで、カルボキシで標識されたリテーナ入り、CMP、CF NB（GPO）9（480μM）のストック溶液を希釈します。最適なCMP濃度は、組織の種類および組織試料の性質に応じて、2.5〜30μMで変化する。 100μlの容量は、1組織切片スライドを染色することをお勧めします。策定のCMP solutを保管して暗闇の中でのイオン。
- マウス角膜組織スライドを室温に戻してみましょう。 5分間1×PBS緩衝液中でスライドをインキュベートする。このデモンストレーションで使用したマウスの角膜組織をティッシュテックのOCT培地中で凍結保存し、1時間、PBS溶液中で4％パラホルムアルデヒドで始まるされている、8μmの厚さに凍結切片化し、荷電ガラススライドにマウント。
- 組織染色およびイメージング
- 加湿チャンバー内でスライドを置きます。各スライドを、ブロッキング溶液を0.5mlを適用し、室温で30分間スライドをインキュベートする。ペーパータオル上スライドをブロッティングによりブロッキング溶液を除去します。
- 各スライドの組織切片をカバーするために、CF NB（GPO）9ソリューションの約100μLを適用します。 CMP溶液が組織に浸透できるようにするために2分間スライドをインキュベートする。
- UVランプの電源をオンにします。ランプが温まっているときに、CMPに覆われた組織SEを公開ケージのCMPを脱保護するための6分（365nmで、〜8ミリワット/ cm 2で ）UV光にctions。 UV露光の後、乾燥を防ぐためにパラフィルム片を有する各スライドの組織切片を覆う。加湿チャンバー内でスライドを置き、2時間4℃でそれらをインキュベートする。
- 1X PBS中DAPI溶液の1:3,000の希釈液を調製。 CMPの染色した後、静かにピンセットでパラフィルムを除去し、過剰のCMP溶液を除去し、ペーパータオル上でスライドをブロット。各組織スライドに希釈DAPI溶液の約100μlをアプライし、室温で1分間インキュベートする。
- 染色後、5分間染色ジャー内で1×PBS緩衝液中でスライドを浸す。未結合の染色剤を洗い流し、新鮮な1X PBSにこの3回繰り返します。
- 組織切片上の封入剤の液滴を追加して、気泡を捕捉回避しながら、ガラスカバースリップでカバー。光から保護するために段ボールスライドトレイ内のスライドを置く。
- 画像コラーゲン鎖（FITCチャンネル）および細胞核（DAPIチャネル）蛍光顕微鏡を用いて組織スライドする。
Representative Results
図1は、光トリガーIR680-AHX-（GPO）9は、24〜96時間後に注射した後の健康な女性SKH1ヌードマウスにどのように分配するかの典型的な結果を示しています。それが結合していないペプチドの大部分は大部分がクリアされた時点で、24 HPIの後、骨格の見かけのCMP蓄積を示す。リモデリングコラーゲン鎖とハイブリダイズするCMPプロセスは、特に他のペプチドイメージングプローブ（ 例えば、RGD 16）とは対照的に、比較的遅いようである。これが最も可能性が高いため、コラーゲンの三重らせん17,18の遅いフォールディング率である。わずかな信号の減少が24 hpiの（ 図1）の後に見られるようしかし、一旦ハイブリダイズし、CMPストランドが強く、膠原性組織に結合している。 96 HPIで、肌の除去後のマウスの近赤外蛍光像がはっきりIR680-AHX-（GPO）の骨格取り込みを示して背骨と肋骨内だけでなく、膝内9、足首、手首、下顎（ 図2A）。
エクスビボ組織染色では、光トリガ蛍光標識されたケージドのCMPは、具体的には組織切片中の変性コラーゲンの鎖にハイブリダイズする。 図3では、CMP染色は、明らかに、コラーゲン特異的染色剤としてのその使用を実証角膜実質内に微細な平行コラーゲン原線維を明らかにする。
図1。4日間の骨格取り込みを示すフォトdecaged IR680-AHX-（GPO）9を静脈内投与したヌードマウスのシリアルNIR蛍光画像。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。フォトdecaged IR680-AHX-（GPO）を投与したマウスの近赤外蛍光画像を図9（A）、UV露光（B）なしでIR680-AHX-NB（GPO）9ケージ、三重らせん[IR680-AHX-（GPOを折りたたま CMPによる皮膚除去後96 hpiの少なくとも）9] 3（C）、または熱解離した一本鎖IR680-AHX-（GPO）9（D）。骨格ターゲティングはAとDで観察することができる。 NIR蛍光シグナルは、虹のスケールで表示されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。マウスの同時の蛍光顕微鏡写真rneal組織切片はホルムアルデヒド中で先頭に、およびDAPIと光トリガーCF（GPO）で染色9、プロトコル2を使用して（緑CMPにより染色された、）密な膠原性基質を表示するだけでなく、青の細胞上皮および内皮（DAPIで染色し、 （）スケールバー：100μm）を。
Discussion
このプロトコルに見られるように、ケージのCMPのUV-活性化は共通の尾静脈注射プロトコルに唯一の追加のステップ19であるため、CMPの送達は直接的である。キーはアンケージドと準安定一本鎖状態のペプチドプローブを注入することである。それはCMPが三重らせんに折り畳まし始める時点でUV光により除去されるまでケージ基は自己集合したコラーゲン（ 図2B）に結合するのCMPを防止する。注射製剤は、すぐに毒性を最小限にするためにUV照射時の切断されたケージ基と反応することができるシステインを含有する。別の株（ 例えば SKH-1とDR-1）との数々のマウスは、この製剤を使用してテストされて、我々は6ヶ月まで、これらのマウスにおけるいかなる行動またはその他の健康上の欠陥を検出しませんでした。注射はUV暴露の直後に記述していない場合は、CMPのはハイブリダイゼーション能力を持たないホモ三量体三重らせんの中に折り畳まれます。 図2Cは、注射前にのCMPが完全に長い遅延時間（> 2日間）で三重らせんに再構築された極端な場合を示している。この問題を回避するために、CMP溶液は、比較的低濃度（ 例えば、約40μM）で調製し、直ちにUV-decaging後にマウスに注射されるべきである。そのため、希薄状態でのCMPのゆっくりとした三重らせんフォールディング率（リフォールディングの半分の時間：> 50分）と短いUV露光および噴射時間（5〜7分の合計）、のCMPのほとんどは単血流に入るこのプロトコルに従っているとき鎖が形成される。濃度がアセンブル率18の劇的な減少をもたらす、血液プール中で20倍に低減されるように、一旦注入のCMPは、単鎖として残ることが期待される。注入が遅れた（ 例えば起因する動物の取り扱い）およびホモ三量体リフォールディングが疑われる場合は、部分的に組み立てられたペプチドは、70より上に加熱することによって再活性化することができます76 Cは、プロンプト冷却と注入し、単一鎖にのCMPを解離する。不便が、このような熱解離のCMPには、（ 図2D）を標的の生体内の予想される結果を示している。
NIR信号の最大50％が毛髪によって遮断することができるので、このデモでは、ヌードマウスを、NIR蛍光イメージングのために使用した。髪のマウスモデル（黒毛で、特にもの）を使用する場合、我々は電気シェーバーやヘアリムーバーを使用して画像化の前に関心のある領域でマウスをシェービングをお勧めします。 図1において、動物の食事療法でクロロフィルの自家蛍光によって引き起こされる動物の腹部からの偽陽性シグナルがあります。このようなバックグラウンドシグナルが有意に約4日前に結像する精製飼料に切り替えることにより、マウスを低下させることができる。 図1および図2Aに見られるように、強力なCMPの吸収量は、テールスピンでありE。したがって、不完全な尾静脈注射に起因するアーチファクトを回避するために、我々は、注射部位が蛍光画像内に捕捉されないように、尾部の後部に注入することをお勧めします。
標識CMPは、他の方法を用いて検出することが困難であり、インビボにおけるコラーゲンリモデリングの特定の位置の標的化および画像化を可能にする。例えば、ELISAベースの血液や尿のアッセイは、切断されたコラーゲンテロペプチド断片のために敏感であるが、それは可溶性抗原をターゲットにしているための方法は、コラーゲンの代謝回転のソースをローカライズすることはできません。 NIRを用いたin vivoイメージング技術の主な制限は、ヘモグロビンは710分の680 nmの近赤外色素の内因性のクエンチャーであるとしてのCMPは、近位にプール赤血球による深度浸透減衰と消光であるラベル。 CMPのin vivoイメージングの将来のアプリケーションは、直接ガンマ線放出核種または陽電子EMIで標識のCMPを使用して、SPECTやPETイメージングを含むtters、コラーゲンリモデリング（ 例えば、骨粗鬆症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、および線維症）を含む疾患状態の診断のために。これらの放射性標識CMP類似体は、組織の深さおよびプールされた赤血球の存在による信号損失の制限を排除し、病変組織の定量的測定を可能にする。また、CMPののゆっくりと結合し、隙間に起因する比較的遅い撮影時間（ 例えば 48〜96 HPI）は、それが困難なコラーゲンリモデリングの急速な変化に追随するために作ることができます。そのような制限は、結合反応速度およびCMPイメージング剤の親和性のさらなる工学によって克服することができる。 CMPは少し構造を有する変性したコラーゲンに結合するので、CMP-コラーゲンベースのイメージングができる唯一の画像コラーゲン繊維5第二高調波発生顕微鏡法に相補的である。
蛍光標識のCMPで組織切片を染色する際に、我々はそれが有益でインキュベートすることが見出され4℃でのUV活性化ペプチド溶液中のサンプル、三重らせんハイブリダイゼーションは、より低い温度1,20で促進されるからです。また、染色ジャー中で、新鮮なPBS緩衝液中でスライドを浸漬すると、単なるサンプルにわたって洗浄緩衝液をピペットよりもはるかに良い作品、未結合のCMPを洗い流すための最も効果的な方法であることがわかった。 CMP-コラーゲン鎖のハイブリダイゼーションが非常に特異的かつ堅牢であるので、このビデオで提示単純な染色プロトコルを容易に付加的なバイオマーカーを共染色するための、および未固定組織切片中のコラーゲンの劣化を識別するために修飾することができる。これは、様々な組織学的サンプル中の繊維状のコラーゲンを検出するための抗コラーゲン抗体を使用することに効果的で便利な代替手段です。
Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者は、技術支援のためのギルバート緑に感謝します。この作品はSMYにし、MGPに授与NIH（U24 CA92871およびU54 CA151838）から授与さNIAMS / NIH（R01-AR060484）およびDOD（W81XWH-12-1から0555）からの補助金によって支えられて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1. |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12. |
| Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
| Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
| Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
| DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
| Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
| Syringes | BD | 329461 | |
| UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
| Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
| Surgical forceps and scissors | |||
| EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
| 20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
| Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
References
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