Summary
이 절차는 IR 형광 마우스에서 콜라겐 리모델링 활동의 영상뿐만 아니라 변성 콜라겐 가닥과 혼성화 사진 트리거 할 수 있습니다 갇힌 콜라겐 모방 펩타이드를 사용하여 조직 섹션에있는 콜라겐의 생체 염색 근처 생체 내에서 보여줍니다.
Abstract
콜라겐은 조직 형성 및 유지 보수를 지원하는 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 주요 구조 요소입니다. 콜라겐 리모델링이 정상 조직 재생의 중요한 부분이지만, 개조 활동의 과도한 양의 종양, 관절염, 그리고 다른 많은 병적 인 상태에 참여하고있다. 콜라겐 리모델링 중에 콜라겐 분자의 삼중 나선 구조는 세포 외 환경에서 프로테아제에 의해 방해된다. 또한, 많은 조직 학적 조직 샘플에 존재하는 콜라겐 부분적 고정 보존 방법에 의해 변성된다. 따라서 이러한 변성 콜라겐 가닥 생물 이미징을위한 효과적인 목표를 제공 할 수 있습니다. 우리는 이전에 사진 트리거 콜라겐 고유 삼중 나선 구조를 형성하여 변성 된 콜라겐 가닥과 혼성화 할 수 있습니다 갇힌 콜라겐 모방 펩티드 (CMP)를 개발했다. 이 절차의 전반적인 목표는 변성 된 콜라겐 가닥 r에 이미지에) 내가있다생체 내에서 정상 개장 활동 esulting하고, ⅱ) 사진 트리거 리테이너 타입 CMP한다을 사용하여 생체 조직 섹션에있는 콜라겐을 시각화 할 수 있습니다. 효과적인 하이브리드 생체 내 및 생체 영상에서 성공을 달성하기 위해, 형광 표지 리테이너 타입 CMP한다은 사진을 활성화하거나 정맥 주사하기 직전에, 또는 직접 조직 섹션에 활성화됩니다. 접두사가 마우스 각막 조직 섹션에서 누드 마우스와 콜라겐의 일반 골격 콜라겐 remolding는이 절차에서 몇 군데 있습니다. 여기에 제시된 CMP-콜라겐 하이브리드 기술을 기반으로 영상 법은 조직의 리모델링 과정의 깊은 이해로 이어질뿐만 아니라, 높은 콜라겐 리모델링 활동과 관련된 질환에 대한 새로운 진단의 개발을 허용 할 수 있습니다.
Introduction
콜라겐, 포유 동물에서 가장 풍부한 단백질은 세포의 증식 및 분화를 지원함으로써 조직 발달 및 재생에 중요한 역할을한다. 섬유 콜라겐 (예를 들어, 유형 I, II), 결합 조직의 조직에 기계적인 힘을 제공하는 동안, 네트워크와 같은 콜라겐 (타입 IV)는 세포가 부착하고 조직 조직을 형성하는 기저막의 기본 골격을 형성한다. 콜라겐 리모델링 콜라겐 분해 (단백질 분해 효소에 의해) 및 합성 (성장 인자에 의해 추진)을 모두 포함한다. 콜라겐 리모델링, 뼈의 예를 들면, 정상 조직의 갱신 과정, 초과 개조 활동, 또는 비정상적인 위치에있는 그것의 발생의 한 부분이지만, 일반적으로 나타냅니다 상처 부상이나 암, 골다공증, 관절염과 같은 만성 병적 인 상황에 대응을 치유하고, 섬유증 1-4. 직접 이미지 콜라겐은 생체 내에서 리모델링을 진행하는 능력은 진행 상황에 대한 이해로 이어질 수이러한 질병의 이온뿐만 아니라, 새로운 진단 및 치료. 예를 들어, 라이브 영상은 중증도 및 질환의 위치에 대한 정보를 제공 할 수 있고, 또한 새로운 치료제의 효능을 평가하기 위해 사용될 수있다. 다 광자 레이저 스캐닝 현미경과 두 번째 고조파 발생 살아있는 쥐 5에 종양 세포 외 기질 리모델링 모니터링을위한 영상 원 섬유 콜라겐에 적용되었습니다. 그러나,이 방법은 침습적 인, 투명 등쪽 피하 지방 챔버에 장착 할 동물을 필요로한다. 콜라겐 리모델링의 직접적이고 비 침습적 영상은 특별히 개조를 겪고 콜라겐을 대상으로하는 조사에서 도움이 될 것입니다. 이러한 조사는 정상 조직 6 풍부 온전하고 성숙한 콜라겐에서 리모델링 콜라겐을 구별 할 필요가 있기 때문에 준비하기가 어렵습니다.
콜라겐입니다 트리플 헬릭스라는 매우 희귀 한 단백질의 구조로 구성되어 있습니다콜라겐 리모델링 동안 매트릭스 메탈로 프로테아제 (MMP)와 같은 단백질 분해 효소에 의해 절단. 분해 콜라겐 조각은 배 나선 구조를 잃고 더 특이 단백질 분해 효소 (1)에 의해 소화 펼쳐진 가닥 (젤라틴),가. 그것은 최근에 삼중 나선 구조로 접을 수있는 성향을 가지고 콜라겐 모방 펩티드 (CMP)가 구체적으로 어느 열 변성에 의해 또는 효소 분해 1,7하여 삼중 나선 상태에서 분해되는 콜라겐 가닥을 대상으로 할 수 있다는 것을 발견했다. 바인딩은 주로 단량체 CMP한다과 변성 된 콜라겐 가닥 사이에 삼중 나선 교잡에 의해 구동된다. CMP한다 콜라겐 하이브리드, 갇힌 CMP를위한 작은 구동력으로 실온에서 homotrimeric 트리플 나선에 자기 조립하기 때문에 [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, NB (GPO) 9로 지정, O : 하이드 록시 프롤린], 개발 된 어느 사진 분해성 니트로가 포함되어그룹 (NB) 펩티드의 중앙 글리신 부속. NB 케이지 그룹은 입체적으로 트리플 헬릭스에 접어에서 CMP를 방지, 아직, UV 조사에 의해 케이지 그룹의 제거는 바로 삼중 나선 접이식 콜라겐 하이브리드 1을 트리거합니다. 근적외선 (NIR) 형광 물질로 표지 단량체 CMP한다이 체계적으로 쥐를 모델로 전달 될 때, 구체적 대상과 일반 (예를 들어, 뼈와 연골)을받은 조직 병리학 (예 : 종양) 1 개조의 변성 된 콜라겐의 생체 내 이미징 할 수 있습니다 .
형광 표지 된 CMP한다 또한 조직 학적 조직 섹션에 콜라겐을 묘화를 위해 사용될 수있다. 조직 학적 연구에서 수확 조직은 종종 세포 구성 요소와 열화 전체 조직의 형태를 유지하기 위해 고정으로 유지됩니다. 열, 유기 용매로 처리, 화학적 상호 린킨을 포함하는 고정 절차,G 시약 (예를 들어, 파라 포름 알데히드), 콜라겐 (8)의 삼중 나선 구조를 변성. 이 변성 CMP 하이브리드을위한 사이트를 생성합니다. 그것은 그 찬란 CMP한다 특별히 더 효율적으로 섬유 성 간 조직 9 병적 상태의 손쉬운 식별을 허용 항 콜라겐 항체보다 고정 된 조직 섹션에서 콜라겐에 (예를 들어, 피부, 각막, 뼈를) 바인딩 할 수 있습니다 나타났다. CMP는 콜라겐의 모든 타입에 공통 삼중 나선 모티프의 아미노산 서열을 함유하는 변성 콜라겐 가닥을 표적. 따라서 CMP는 광범위한 스펙트럼 콜라겐 착색제 간주 될 수 있습니다. 여기, 우리는 형광 표지 리테이너 타입 CMP한다를 사용하여 생체 내에서 변성 된 콜라겐 섬유 및 생체 조직 절편에서 II) 시각화 콜라겐을 영상) 나에 대한 세부 실험 절차를 제시한다. NIR 태그, IR680은, 라이브 영상, 간편하게 조절할에 갇힌 CMP에 결합시켰다전자 카르복시 (CF)는 표준 형광 현미경과의 호환성을 위해 조직 염색 작업에 사용되었다. 이 프로토콜은 콜라겐 리모델링에 관련된으로 CMP한다의 이미징 응용 프로그램에 초점을 맞추고 있습니다. CMP 합성하는 방법은 이전의보고 1,7,9-15에서 찾을 수 있습니다. 이 비디오 보고서에서, 정상 마우스와 마우스 각막의 조직 섹션에서 영상 골격 조직은 데모 목적을 위해 선택되었다, 여기에 제시된 방법은 쉽게로, 콜라겐 리모델링 (예를 들어, 종양, 상처 치유를) 포함하여 많은 병리 생물학적 모델에 적용 할 수 있지만 물론 콜라겐이 들어 거의 모든 접두사 조직 샘플에 관해서.
Protocol
모든 동물 연구는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회의 규정에 따라 수행되었다.
1. 생체 내에서 골격 콜라겐 리모델링의 적외선 (NIR) 형광 이미징 근처
- 갇힌 CMP와 꼬리 정맥 주입의 사진 활성화
- 전송 및 주입시 손실 가능성에 대한 추가 10 μL 쿠션, 투약 용액 100 ㎕를 각 마우스에 갇힌 CMP 용액 110 μL (20-30그램 마우스 무게를) 준비합니다. IR680-AHX-NB (GPO) 멸균 PBS 용액에서 100 μM 시스테인의 11 μL 9 원액 (400 μM)의 11 μl를 혼합 한 후 1X PBS 버퍼와 110 μL에 전체 볼륨을 가지고. 최종 펩타이드 솔루션은 IR680-AHX-NB (GPO) 9의 4 nmol의 및 1X PBS 용액 100 μL에있는 시스테인 1 nmol의가 포함되어 있습니다.
- 천천히 withdra주의 깊게 펩타이드 투명 배럴과 작은 게이지 (28 ~ 30 G) 바늘 0.5 ml의 인슐린 주사기로 솔루션 및 W 기포를 제거합니다. 램프가 2 ~ 5 분 동안 워밍업 할 수 있도록 UV 램프를 켭니다.
- 사진을 활성화 할 수 있도록 직접 5 분 동안 UV 램프 (365 nm의,> 25 mW의 / ㎠)에서 펩티드 함유 주사기를 놓습니다.
- 한편, 가열 램프 아래에 제한 수단에 마우스를 위치, 꼬리 또는 귀 태그 또는 발가락 문신 등의 식별 방법에 대한 영구 마커와 마우스를 라벨, 70 %의 알코올로 꼬리를 소독.
- 즉시 UV 활성화 한 후, 우선적으로 꼬리의 뒤 부분에서, UV 활성화 IR680-AHX-NB (GPO) 꼬리 정맥에 9 용액 100 μl를 주입. 주사 후 다시 케이지에 마우스를 놓습니다.
- 콜라겐 리모델링 활동의 근적외선 형광 이미징
- 세트진주 임펄스 2.0 소프트웨어를 사용하여 37 ° C에 충격 화상 카메라의 영상 침대의 히터 플레이트.
- 산소의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 포함하는 마취 유도 챔버로 누드 또는 면도 마우스를 놓습니다. 처리 도중 호흡의 빈도 (~ 1/sec)를 모니터링하여 마우스 움직임의 부족에 의해 마취 비행기의 깊이를 확인합니다.
- 마우스를 마취 한 후, 진주 이미 저 서랍을 열고 영상 침대에 동물을 배치합니다. 신속 코 콘 플러그를 제거하고, 이미징 프로세스 동안 (코 콘을 통해 2 리터 / 분에 전달 산소의 2 % 이소 플루 란으로) 마취 마우스를 유지하기 위해 코 콘 내부에 마우스의 총구를 밀어 넣습니다. 마우스가 자리에되면, 서랍을 닫습니다.
- 악기가 이미지 소프트웨어 패널의 "준비"표시되면 이미지를 획득 "버튼"다음 상자 ""700 채널 ","하얀 빛 "과"85 미크론을 클릭합니다. NIR (여기 685 nm의 방출 720 NM)D 백색광 사진은 자동 초점과 노출을 사용하여 촬영합니다.
- 녹음이 완료되면, 서랍을 열고 마우스를 설정하고, 다른 각도에서 이미지를 수집. 마우스가 다시 전면 (복부), (지느러미) 또는 카메라에 직면 측면으로 배치 할 수 있습니다. 구속은 관심 영역 (예를 들어, 갈비뼈, 발목과 손목)의 최고의 전망을 얻기 위해 팔다리를 스트레칭으로 테이프의 좁은 스트립을 사용할 수 있습니다.
- IR680-CMP의 골격 이해를 관찰 할 수있는 적절한 시간은 투여 량 (1 ~ 4의 nmol / 마우스)에 따라 24-96 시간 포스트 분사 (HPI) 사이에있다. 고해상도 이미지를 얻기 72 HPI 후, 수술 집게와 가위를 사용하여 피부 (머리카락)를 제거 깊은 마취를하는 동안 자궁 전위에 의해 마우스를 희생하고, 상기 한 바와 같이 NIR 형광으로 이미지를하십시오.
- 인수 NIR 형광 이미지를 분석 할 수 있습니다.
2. 예에있는 콜라겐의 시각화 생체0; 조직 섹션
- 재료 준비
- 10 %의 1 ㎖ 탈 이온수 (W / V) BSA 솔루션을 준비합니다. 실온 수욕 염소 혈청 1 ㎖를 해동. X 5cm 대략 2 cm의 크기에 파라 필름의 몇 조각을 잘라.
- 염소 혈청 500 μL, 10X PBS 1 ㎖ 탈 이온수 8.5 ㎖를 혼합하여 차단 완충액 10 ㎖를 준비한다. 탈 이온수 4.45 ㎖ 및 500 ㎕의 10 배 PBS로 (W / V) BSA 10 %의 50 μl를 희석하여 CMP 희석액 5 mL를 준비합니다.
- CMP 희석 버퍼를 사용하여 5 μm의, 카복시 표지 리테이너 타입 CMP, CF NB (GPO) 9 (480 μM)의 주식 솔루션을 희석. CMP 최적 농도는 조직 유형 및 조직 샘플의 특성에 따라, 2.5-30 μM에서 변화한다. 100 μL의 볼륨은 하나의 조직 절편 슬라이드를 염색하는 것이 좋습니다. 공식화 CMP의 한 solut를 저장어둠 속에서 이온.
- 마우스 각막 조직 슬라이드를 실온으로 평형화하자. 5 분 1X PBS 버퍼에 슬라이드를 품어. 이 데모에 사용 된 마우스 각막 조직은 8 μm의 두께로 저온 절단 된 조직 테크 10월 중간에 냉동 보관 1 시간, 위해 PBS 용액에 4 % 파라 포름 알데히드로 시작하고, 충전 된 유리 슬라이드에 마운트되었습니다.
- 조직 염색 및 이미징
- 가습 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 각 슬라이드에 차단 솔루션의 0.5 ML을 적용하고 실온에서 30 분 동안 슬라이드를 품어. 종이 타월에 슬라이드를 내듯 차단 솔루션을 제거합니다.
- 각 슬라이드의 조직 섹션을 포함하는 CF NB (GPO) 9 솔루션의 약 100 μl를 적용합니다. CMP 용액이 조직을 침투 할 수 있도록 2 분간 슬라이드를 배양한다.
- UV 램프를 켭니다. 램프가 예열 될 때, CMP 덮인 조직을 노출 SE갇힌 CMP한다 탈 보호하는 6 분 (365 nm의, ~ 8 mW의 / cm 2)의 UV 광에 ctions. UV 노광 한 후, 건조를 막기 위해, 파라 필름의 조각을 각 슬라이드 조직 절편을 커버. 가습 실에서 슬라이드를 놓고 2 시간 동안 4 ° C에서 그들을 품어.
- 1X PBS에서 DAPI 용액 1:3,000 희석을 준비합니다. CMP 염색 한 후, 부드럽게 집게와 파라 필름을 제거하고 여분의 CMP 솔루션을 제거하기 위해 종이 타월에 슬라이드를 얼룩. 각 조직 슬라이드로 희석 DAPI 솔루션의 약 100 μl를 적용하고 실온에서 1 분 동안 품어.
- 염색 후, 5 분 동안 염색 항아리에서 1X PBS 버퍼에 슬라이드를 담가. 언 바운드 염색 에이전트를 씻어 신선한 1X PBS에이 배를 반복합니다.
- 조직 섹션에 장착 매체의 방울을 추가하고 공기 방울이 피하면서 유리 커버 슬립으로 커버. 빛으로부터 그들을 보호하기 위해 골판지 슬라이드 트레이에 슬라이드를 넣습니다.
- 이미지 콜라겐 가닥 (FITC 채널) 및 세포 핵 (DAPI 채널) 형광 현미경을 이용하여 조직 슬라이드에서.
Representative Results
그림 1은 사진 트리거 IR680-AHX - (GPO) 9는 24-96 시간 포스트 주사 후 건강한 여성 SKH1 누드 마우스에 배포하는 방법의 일반적인 결과를 보여줍니다. 그것은 언 바운드 대부분의 펩타이드는 크게 비우게되어있는 시점에서, 24 HPI 후 골격 명백한 CMP 축적을 보여줍니다. 개조 콜라겐 가닥과 혼성화의 CMP 공정은 특히, 다른 펩티드 이미징 프로브 (예 RGD 16)에 대조적으로, 상대적으로 느린 것으로 보인다. 이것은 대부분의 가능성이 있기 때문에 콜라겐 트리플 나선 (17, 18)의 느린 접는 속도입니다. 단지 약간의 신호 감소가 24 HPI (그림 1) 후 볼 수 있습니다 그러나, 한 번 하이브리드, CMP 가닥은 강하게, 콜라겐 조직에 바인딩됩니다. 96 HPI에서, 피부 제거 후 마우스의 NIR 형광 화상은 깨끗이 IR680-AHX-(GPO)의 골격 흡수를 보여 등뼈와 늑골에서뿐만 아니라, 무릎 내의 9, 발목,손목, 낮은 턱 (그림 2A).
생체 조직 염색에서 사진 트리거 형광 표지 된 리테이너 타입 CMP한다 특별히 조직 섹션의 변성 콜라겐 가닥 하이브리드. 그림 3에서, CMP 염색 명확 콜라겐 특정 착색제로 사용하는 방법을 보여줍니다 각막 기질에 잘 병렬 콜라겐 섬유를 보여준다.
그림 1. 누드 마우스의 시리얼 NIR 형광 이미지 9 네 일 동안 골 흡수를 보여주는 사진 - decaged IR680-AHX - (GPO)를 정맥으로 관리. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 사진 - decaged IR680-AHX - (GPO)를 투여 한 쥐의 NIR 형광 이미지 9 (A), UV 노출 (B)없이 IR680-AHX-NB (GPO) 9 감금, 트리플 나선형 [IR680-AHX - (GPO를 prefolded CMP에 의한 피부 제거 후 96 HPI에서) 9] 3 (C), 또는 열 해리 단일 가닥 IR680-AHX - (GPO) 9 (D). 골격 타겟팅은 A와 D에서 관찰 할 수있다. NIR 형광 신호는 무지개 규모에 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 마우스 공동의 형광 현미경 사진rneal 조직 섹션 파라 포름 알데히드에 접두사 및 DAPI 및 사진 트리거 CF (GPO)로 염색 9, 프로토콜 2를 사용 (녹색 CMP 스테인드) 조밀 한 콜라겐 기질을 표시뿐만 아니라 파란색 세포 상피 세포와 내피 세포 (DAPI 스테인드 ) (스케일 바 : 100 μm의).
Discussion
이 프로토콜에서 알 수있는 바와 같이 CMP한다 갇힌의 UV 활성화는 공통 꼬리 정맥 주사 프로토콜 (19)만을 추가 단계이기 때문에, CMP의 배송은 간단하다. 키는 uncaged 및 준 단일 가닥 상태에서 펩타이드 프로브를 삽입하는 것입니다. 케이지 그룹은 자기 조립에서 CMP를 방지하고 그것이 CMP 트리플 헬릭스에 접하기 시작하는 시점에서 UV 빛에 의해 제거 될 때까지 콜라겐 (그림 2B)에 결합. 주사제는 신속하게 독성을 최소화하기 위해 UV 조사시 쪼개진 케이지 그룹과 반응 할 수있는 시스테인이 포함되어 있습니다. 다른 변종 (예 : SKH-1 DR-1)와 다수의 마우스는이 제제를 사용하여 테스트 한, 우리는 6 개월까지이 마우스에있는 어떤 행동이나 다른 건강 결함을 감지하지 못했습니다. 사출 UV 노출 직후에 수행하지 않는 경우, CMP한다 기준 혼성화 능력이없는, homotrimeric 삼중 나선으로 접힐 것이다. 그림 2c는 주사 전에 CMP한다 완전히 긴 지연 시간 (> 이일)에 의해 배 나선으로 재 조립 된 극단적 인 경우를 보여줍니다. 이 문제를 회피하기 위해, CMP 솔루션은 상대적으로 낮은 농도 (예를 들면 ~ 40 μM)에서 제조, 즉시 UV-decaging 후 생쥐에 주입해야한다. 때문에 희석 조건에서 CMP한다의 느린 배 나선 접는 속도 (폴딩의 절반 시간 :> 50 분)와 짧은 자외선 노출 및 주입 시간 (5 ~ 7 분 합계), CMP한다 대부분의 단일 혈류를 입력 이 프로토콜을 준수 할 때 양식을 좌초. 농도를 재 조립 속도 18에서 극적인 감소로 이어지는, 혈액 풀의 20 배 감소로 일단 주입, CMP한다은 단일 가닥으로 남아있을 것으로 예상된다. 주입이 지연 (예 인해 동물의 처리에) 및 homotrimeric 폴딩이 의심되는 경우, 부분적으로 조립 된 펩타이드는 70 이상으로 가열하여 활성화 할 수 있습니다76, C는 신속한 냉각 주입 한 다음 단일 가닥에 CMP한다 해리합니다. 덜 편리하지만, 이러한 열 해리 CMP한다은 (그림 2D)을 대상으로 생체의 결과를 기대합니다.
NIR 신호의 최대 50 %가 머리에 의해 차단 될 수 있기 때문에이 데모에서는, 누드 마우스는 근적외선 형광 이미징에 사용되었다. 머리 마우스 모델 (검은 머리카락과 함께 특히 사람)로 작업 할 때, 우리는 전기 면도기 나 헤어 리무버를 사용하여 이전 영상에 관심 영역에 마우스를 면도하는 것이 좋습니다. 그림 1에서, 동물의 음식에 엽록소의 자동 형광에 의해 발생합니다 동물의 복부에서 거짓 긍정적 인 신호가있다. 이러한 배경 신호는 크게 약 사일 전에 이미지에 정제 다이어트에 마우스를 전환하여 낮출 수있다. 그림 1 (a)에 보이는 것과 같이, 강한 CMP의 흡수량은 꼬리 스핀에있다전자. 따라서 불완전 꼬리 정맥 주사로 인한 아티팩트를 방지하기 위해, 우리는 주사 부위는 형광 이미지에서 포착되지 않도록 꼬리의 후방 부에 주입 추천합니다.
표시 CMP는 다른 방법을 사용하여 감지하기 어려운 생체 내에서 콜라겐 리모델링의 특정 위치의 타겟팅 및 이미징을 할 수 있습니다. 예를 들어, ELISA-기반의 혈액과 소변 분석은 절단 된 콜라겐 텔로 펩타이드 단편 대해 민감하지만 가용성 항원을 표적으로하기 때문에 상기 방법은 콜라겐 회전율의 소스를 지역화 없다. NIR을 사용하여 생체 내 이미징 기술의 주요 한계는 헤모글로빈 710분의 680 nm의 근적외선 염료의 내생 끄는대로 CMP한다 근위 풀링 적혈구로 깊이 침투 감쇠 담금질 있습니다 표시. 생체 내 이미징에서 CMP의 미래 응용 프로그램은 직접 감마 방출 핵종 또는 양전자 EMI 레이블이 CMP한다을 사용하여 SPECT 또는 PET 영상을 포함tters, 콜라겐 리모델링 (예를 들면 골다공증, 관절염, 동맥 경화, 섬유화)을 포함하는 질병 상태의 진단을위한. 이러한 무선 표지 CMP 유사체 조직의 깊이와 풀링 된 적혈구의 존재로 인한 신호 손실의 한계를 제거하고, 병에 걸린 조직의 정량적 측정을 수 있습니다. 또한, 상대적으로 늦게 촬영 시간 (예 : 48 ~ 96 HPI)는 CMP한다의 느린 바인딩 및 정리로 인한 어려운 콜라겐 리모델링의 급격한 변화를 따라 만들 수 있습니다. 이러한 제한은 바인딩 속도론 및 CMP의 이미징 요원의 친 화성의 추가 공학에 의해 극복 될 수있다. CMP는 작은 구조가 변성 된 콜라겐에 결합하기 때문에, CMP 기반 콜라겐 영상은 수 만 이미지 콜라겐 섬유 5 번째 고조파 발생 현미경을 보완.
찬란과 CMPS 조직 절편을 염색 할 때, 우리는 도움이 부화 발견4 ° C,에서 UV 활성화 펩타이드 솔루션의 샘플은 삼중 나선 하이브리드는 낮은 온도 1,20에 용이하기 때문이다. 또한 염색 항아리에 신선한 PBS 버퍼에있는 슬라이드를 담그는 것은 단순히 샘플을 통해 세척 버퍼를 피펫 팅보다 훨씬 더 잘 작동하는, 언 바운드 CMP한다 씻어 수있는 가장 효과적인 방법입니다 것으로 나타났습니다. CMP-콜라겐 가닥 하이브리드는 매우 구체적이고 강력하므로이 비디오에 제시된 간단한 염색 프로토콜은 쉽게 추가 생체를 costaining에 대한 수정 및 고정되지 않은 조직 섹션에서 성능이 저하 된 콜라겐을 식별 할 수 있습니다. 이것은 다양한 조직 학적 샘플에서 콜라겐 섬유를 검출하기 위해 항 - 콜라겐 항체를 사용하는 효과적이고 편리한 대안이다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원을 길버트 녹색 감사합니다. 이 작품은 MGP에게 수여 NIAMS / NIH (R01-AR060484) 및 DOD (W81XWH-12-1-0555) SMY 수여,에서와 NIH (U24의 CA92871와 U54 CA151838)에서 교부금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1. |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12. |
| Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
| Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
| Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
| DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
| Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
| Syringes | BD | 329461 | |
| UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
| Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
| Surgical forceps and scissors | |||
| EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
| 20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
| Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
References
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