Summary
Эта процедура демонстрирует в естественных условиях ближней ИК флуоресценции визуализации коллаген ремоделирования деятельности у мышей, а также экс естественных окрашивания коллагенов в срезах тканей с использованием в обойме коллагена мимические пептиды, которые могут быть фото-срабатывает для гибридизации с денатурированным коллагеновых нитей.
Abstract
Коллаген является важнейшим структурным компонентом внеклеточного матрикса, который поддерживает образование тканей и технического обслуживания. Хотя коллаген ремоделирования является неотъемлемой частью нормального обновления тканей, чрезмерное количество ремоделирования деятельности участвует в опухолях, артрит, и многих других патологических состояний. Во коллагена ремоделирования, тройка спиральная структура молекул коллагена нарушается протеаз в внеклеточной среде. Кроме того, коллаген, присутствующие во многих образцов гистологических тканей частично денатурированный по фиксации и консервации процессов. Таким образом, эти денатурированные коллагеновые нити могут служить эффективными цели для биологических изображений. Ранее мы разработали клетке коллаген миметического пептида (CMP), который может быть фото-срабатывает для гибридизации с денатурированных коллагеновых нитей, образуя тройную спиральную структуру, которая является уникальной для коллагенов. Общие цели этой процедуры я) к изображению денатурированные коллагеновые нити Resulting от обычной деятельности ремоделирования в естественных условиях, и б) для визуализации коллагенов в бывших естественных условиях срезах тканей с использованием фото-срабатывает клетке CMPS. Для достижения эффективного гибридизации и успешным в естественных условиях и экс естественных изображений, флуоресцентно меченных Caged CMPS либо фото-активированный непосредственно перед внутривенной инъекции, или непосредственно активирована на срезах тканей. Нормальная скелетных коллаген remolding голым мышам и коллагенов в префиксами секциях ткани роговицы мыши изображаются в этой процедуре. Метод визуализации на основе CMP-коллагена гибридизации технологии, представленной здесь может привести к более глубокому пониманию процесса ремоделирования ткани, а также позволяет разработку новых диагностических средств для заболеваний, связанных с высоким коллагена ремоделирования деятельности.
Introduction
Коллаген, самый распространенный протеин у млекопитающих, играет критическую роль в развитии и регенерации тканей, поддерживая пролиферацию и дифференцировку клеток. В то время как волокнистые коллагены (например, тип I, II), в соединительных тканях дать механическую прочность тканей, сеть, как коллаген (тип IV) образуют основную леску базальной мембраны, где клетки придают и образуют организованные ткани. Коллаген реконструкции включает в себя как разрушение коллагена (по протеаз) и синтез (продвигаемый факторов роста). Хотя коллаген ремонт, например, в кости, является частью нормального процесса обновления ткани, избыточный ремоделирования деятельности или ее возникновения в аномальных местах, как правило, указывает заживления ран ответ на травмы или хронических патологических состояний, таких как рак, остеопороз, артрит, и фиброз 1-4. Возможность напрямую изображений коллагены переживает реконструкцию в естественных условиях может привести к пониманию прогрессаион этих заболеваний, а также новые диагностики и терапии. Например, в прямом эфире изображений может предоставить информацию о серьезности и расположения заболеваний, а также может быть использован для оценки эффективности новых терапевтических агентов. Многофотонная лазерной сканирующей микроскопии и генерация второй гармоники были применены к фото фибриллярных коллагенов для мониторинга внеклеточного матрикса ремоделирования в опухоли в живых мышей 5. Тем не менее, этот метод требует животных должен быть установлен с прозрачными спинной кожных складок камер, который является инвазивной процедурой. Прямая и неинвазивной визуализации коллагена ремоделирования выиграют от зонда, который специально ориентирована коллаген проходит модернизацию. Такой зонд трудно подготовить, так как это необходимо различать ремоделирования коллагены от неповрежденных и зрелых коллагенов, которые в изобилии в нормальных тканях 6.
Коллаген состоит из чрезвычайно редких структуры белка называемой тройной спирали, котораярасщепляется протеаз, таких как матриксных металлопротеиназ (ММП) в течение коллагена ремоделирования. В расщепленных фрагментов коллагена теряют свою тройную спиральную структуру и стать развернутые нити (желатин), которые в дальнейшем перевариваются неспецифическими протеазами 1. Недавно было обнаружено, что коллаген миметический пептид (СМР), который имеет склонность к сложить в тройной спиральной структуры может специально направлены коллагеновые нити, которые в отрыве от его тройной спирали государства либо тепловой денатурации или ферментативного расщепления 1,7. Связывание в основном за счет тройной спирали гибридизации между мономерных CMPS и денатурированные коллагеновых нитей. Потому CMPS самостоятельно собираться в гомотримерную тройных спиралей при комнатной температуре с небольшим движущей силой коллагена гибридизации, в клетке CMP [(GPO), 4 NB GPO (GPO), 4, обозначенный как NB (GPO) 9, O: оксипролина], была разработана , который содержит фото-расщепляется нитробензилгруппа (NB) присоединены к центральной глицина пептида. Клетка группа NB пространственно препятствует CMP от складывания в тройной спирали, и все же, удаление клетке группы УФ-облучением сразу вызывает тройной винтовой складывания и коллагена гибридизации 1. Когда мономерные CMPS меченные ближней инфракрасной области (NIR) флюорофоры системно доставлены моделировать мышей, они могут специально предназначаться и позволяют в естественных изображений денатурированные коллагены в тканях, подвергающихся нормальным (например, в кости и хряща) и патологическое (например, в опухолях) реконструкции 1 .
Флуоресцентно меченных CMPS также может быть использован для визуализации коллагены в разделах гистологических тканей. В гистологического исследования, собранные ткани часто сохраняется фиксации сохранить клеточные компоненты и общую морфологию тканей от повреждения. Процедуры фиксации, которые включают высокую температуру, а также лечение с органическими растворителями и химического сшивающего Линкинаг реагенты (например, параформальдегид), денатурации тройной спиральную структуру коллагена 8. Это денатурации генерирует сайты для CMP гибридизации. Было показано, что флуоресцентно меченных CMPS может специфически связываться с коллагенов в разделах фиксированных тканей (например, кожи, роговицы, и кости), даже более эффективно, чем анти-антител коллагена, что позволило поспешное идентификации патологических состояний в фиброзных тканей печени 9. CMP цели денатурированные коллагеновые нити, содержащие аминокислотную последовательность тройных спиральных мотивов, который является общим для всех типов коллагенов. Поэтому CMP может рассматриваться широкого спектра окрашивание коллаген агент. Здесь мы представляем детальные экспериментальные процедуры I) визуализации денатурированные коллагеновые нити в естественных условиях и II), визуализирующих коллагенов в бывших естественных условиях срезах тканей с использованием флуоресцентно меченных клетке CMPS. NIR тег, IR680, конъюгировали к клетке CMP для живых изображений, Whilе Карбоксифлуоресцеин (CF) был использован в ткани окрашивания работы своей совместимости с стандартных флуоресцентных микроскопов. Этот протокол основное внимание уделяется применению формирования изображения CMPS по сравнению с коллагеном ремоделирования. Методы синтеза CMP можно найти в предыдущих докладах 1,7,9-15. В этом видео-докладе изображений скелетных тканей в нормальных мышей и тканевых секций мыши роговицы были выбраны для демонстрационных целей, однако методы, представленные здесь, могут быть легко применены к многих патологий и биологических моделей, включающих ремоделирование коллагена (например, опухоли, заживление ран), как а также практически к любому префиксом образца ткани, которая содержит коллагены.
Protocol
Все исследования на животных были проведены в соответствии с правилами Комитета по Джонса Хопкинса уходу и использованию животных.
1. Ближней инфракрасной (NIR) флуоресценции Визуализация скелетных ремоделирование коллагена в естественных условиях
- Фото-активация в клетке CMP и инъекции в хвостовую вену
- Подготовка 110 мкл раствора клетке CMP для каждой мыши (20-30 г веса мыши): 100 мкл раствора для дозирования, с дополнительной 10 мкл подушки для возможной потери при передаче и инъекции. Смешать 11 мкл IR680-AHX-NB (GPO) 9 исходный раствор (400 мкМ) с 11 мкл 100 мкМ цистеина в стерильном растворе PBS, а затем довести общий объем до 110 мкл с 1X PBS буфера. Конечный раствор пептид содержит 4 нмоль IR680-AHX-NB (GPO) 9 и 1 нмоль цистеина в 100 мкл раствора PBS 1x.
- Медленно withdraж пептидной раствора в 0,5 мл инсулина шприц с прозрачной баррель и небольшой колеи (28-30 G) иглы и осторожно удалить пузырьки воздуха. Включите УФ-лампой, чтобы лампа прогреться в течение 2-5 мин.
- Поместите пептида, содержащего шприц непосредственно под УФ-лампой (365 нм,> 25 мВт / см 2) в течение 5 мин, чтобы позволить фото-активации.
- Между тем, поместите курсор в фиксатор под нагретой лампой; маркировать мышь с постоянным маркером на хвосте или других методов идентификации, таких как бирки или ноги татуировкой, и дезинфицировать хвост с 70% спиртом.
- Сразу после активации УФ, придать 100 мкл УФ-активации IR680-AHX-NB (GPO) 9 решение в хвостовую вену, преимущественно в задней части хвоста. Наведите мышь обратно в клетку после инъекции.
- NIR флуоресцентных изображений коллагена ремоделирования деятельности
- Наборнагреватель пластина изображений кровати импульсной томографа до 37 ° С с использованием программного обеспечения Pearl Импульс 2,0.
- Поставьте ню или бритая мышь в индукционной анестезии камеру, содержащую 2% изофлуран в кислороде. Проверьте глубину анестезии плоскости отсутствием движения мыши во время обработки и путем мониторинга частоты дыханий (~ 1/сек).
- После того, как мыши под наркозом, откройте Перл Imager ящик, и место животного на кровати изображения. Быстро снять носовой обтекатель вилку, и сдвиньте морду мыши внутри носового конуса держать мышь под наркозом (на 2% изофлураном в кислороде, произнесенной на 2 л / мин через носовой конус) в процессе создания образа. Как только мышь находится в месте, закройте ящик.
- Когда прибор показывает "готов" на панели программного обеспечения изображения, нажмите кнопку "700 канал", "белый свет" и "85 микрон" коробки, за которой следует "кнопки приобрести имидж". NIR (возбуждение 685 нм, эмиссия 720 нм)г белого света фотографии будут затем приняты с использованием автоматического фокуса и экспозиции.
- Когда запись завершена, открыть ящик, включите мышь, и получать изображения с другого угла. Мышь может быть размещен с его передней (вентральной), задней (дорсальной) или сторон, стоящих перед камерой. Узкие полоски ленты можно использовать в качестве ограничения, чтобы растянуть свои конечности, чтобы получить лучший вид на интересующей области (например, грудной клетки, лодыжки, и запястья).
- Правильное время для наблюдения скелетную поглощение IR680-CMP между 24-96 ч после инъекции (HPI), на основе дозы (~ 4 нмоль / мышь). Для получения изображений с высоким разрешением, пожертвовать мышь смещением шейных позвонков, находясь под глубоким наркозом после 72 HPI, снять кожу (и волосы) с помощью хирургических щипцов и ножниц, и изображение его флуоресценции NIR, как описано выше.
- Проанализируйте полученные флуоресцентные изображения NIR.
2. Визуализация коллагенов в Экс Vivo0; ткани Разделы
- Подготовка материала
- Подготовка 1 мл 10% (вес / объем) BSA раствора в деионизированной воде. Разморозить 1 мл козьей сывороткой в водяной бане при комнатной температуре. Отрежьте несколько кусочков парафильмом в размере примерно 2 см х 5 см.
- Подготовка 10 мл блокирующего буфера путем смешивания 500 мкл козьей сывороткой 1 мл 10-кратного PBS и 8,5 мл деионизованной воды. Подготовка 5 мл буфера для разведения CMP разбавлением 50 мкл 10% (вес / объем) BSA с 4,45 мл деионизированной воды и 500 мкл 10х PBS.
- Развести исходные растворы карбоксифлуоресцеина меченных клетке CMP, CF NB (GPO) 9 (480 мкм), до 5 мкм с использованием буфера CMP разбавления. Оптимальная концентрация CMP изменяется от 2,5-30 мкМ, в зависимости от типа ткани и природы образцов ткани. Объем 100 мкл рекомендуется для окрашивания одной ткани раздел слайд. Храните сформулированную CMP Solutионы в темноте.
- Пусть мышь ткани роговицы горки равновесие до комнатной температуры. Инкубируйте слайдов в 1х буфере PBS в течение 5 мин. Мышь роговицы ткани, используемые в этой демонстрации были префикс 4% параформальдегида в PBS растворе в течение 1 ч, криоконсервированных в Tissue-Tek октября среды, cryosectioned до 8 мкм толщины, и установлен на заряженные стеклах.
- Ткань окрашивание и обработки изображений
- Поместите слайды во влажной камере. Для каждого слайда, применять 0,5 мл блокирующего раствора и инкубировать слайды в течение 30 мин при комнатной температуре. Снимите блокирующий раствор промокательной слайды на бумажное полотенце.
- Применить около 100 мкл CF NB (GPO) 9 решений для покрытия тканей разделы каждого слайда. Инкубируйте слайды в течение 2 мин, чтобы позволить решение CMP проникать в ткани.
- Включите УФ-лампой. Когда лампа разогревается, подвергайте CMP-крытая ткани себестрельчатые к ультрафиолетовым светом в течение 6 мин (365 нм, ~ 8 мВт / см 2) для снятия защиты в обойме CMPS. После УФ-облучения, покрытия тканей разделы каждого слайда с куском парафильмом чтобы предотвратить высыхание. Поместите слайды в увлажненной камере и инкубируют их при 4 ° С в течение 2 часов.
- Подготовить разведение 1:3000 в DAPI раствора в 1x PBS. После окрашивания CMP, осторожно удалите парафильмом щипцами, и промокните слайды на бумажное полотенце, чтобы удалить излишки раствора CMP. Применить около 100 мкл разбавленных DAPI решений каждому ткани горкой и выдержать в течение 1 мин при комнатной температуре.
- После окрашивания, погрузиться слайды в 1x буфера PBS в окрашивания банку в течение 5 мин. Повторите эту 3x в пресной 1x PBS смыть несвязанных окрашивания агентов.
- Добавить каплю монтажной среды на участке ткани и покрыть ее покровным стеклом, избегая образования пузырьков. Положите слайды в режиме слайд-лоток картонной, чтобы защитить их от света.
- Изображение коллагеновые нити (FITC каналов) и клеточных ядер (DAPI канал) в тканях организма слайдов с помощью флуоресцентного микроскопа.
Representative Results
На рисунке 1 показан типичный результат, как фото-срабатывает IR680-Ahx-(GPO) 9 распределяет в здоровой женщины SKH1 голой мыши после 24-96 ч после инъекции. Это показывает явное накопление CMP в скелете после 24 HPI, после чего большинство из несвязанных пептидов были в значительной степени очистили. Процесс CMP гибридизации с ремоделирование коллагеновых нитей кажется относительно медленно, особенно в отличие от других зондов пептид изображений (например, RGD 16). Это, скорее всего, из-за низкой скорости складывания коллагеновой тройной спирали 17,18. Однако, как только гибридизованы, нити CMP сильно привязаны к коллагеновых тканей, а только небольшое снижение сигнала видно после 24 HPI (рис. 1). В 96 HPI, флуоресценция NIR образ мыши после удаления кожи наглядно демонстрирует скелетных поглощение IR680-AHX-(GPO) 9 в позвоночника и ребер, а также в рамках коленях, лодыжки,Запястья, и более низкие Мандибулы (рис. 2А).
В экс естественных окрашивания ткани, фото-срабатывает флюоресцентно меченные Caged CMPS специфической гибридизации денатурированные коллагеновых нитей в срезах тканей. На рисунке 3, окрашивание CMP ясно показывает прекрасные параллельные фибриллы коллагена в стромы роговицы, что демонстрирует его использование в качестве коллагена конкретного красителя.
Рисунок 1. Последовательные NIR флуоресцентные изображения из голой мыши вводят внутривенно с фото-decaged IR680-AHX-(GPO) 9 показывая скелетных поглощение в течение четырех дней. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. NIR флуоресцентные изображения из мышей, которым вводили фото-decaged IR680-AHX-(GPO) 9 (А), в клетке IR680-Ahx-NB (GPO), 9 без ультрафиолетового облучения (B), сложенные трехспирального [IR680-AHX-(GPO ) 9] 3 (С) или термически диссоциируют одножильный IR680-Ahx-(GPO), 9 (D) на 96 HPI после удаления кожи. Скелет таргетинг по СС может наблюдаться только в А и D. Сигналы флуоресценции NIR приведены в радужной масштабе. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Флуоресцентные микрофотографии СО мышираздел rneal ткани префиксом в параформальдегиде и окрашивали DAPI и фото-срабатывает CF (GPO) 9 с помощью протокола 2, показывая плотный коллагеновый стромы (окрашенный ЧМК, в зеленый цвет), а также сотовой эпителий и эндотелий (запятнана DAPI, синим цветом ) (масштаб бар: 100 мкм).
Discussion
Как видно в данном протоколе, поставка CMP проста, так как УФ-активация клетке CMPS является единственным дополнительным шагом к общим хвост протоколов инъекций вены 19. Ключ должен придать пептидные зонды в Uncaged и метастабильного однонитевого государства. Клетка группа предотвращает CMP от самосборки и привязки к коллагенов (рис. 2В), пока он не будет удален с помощью УФ-света и в этот момент СС начинает свертываться в тройной спирали. Формулировка для инъекций содержит цистеин, которые могут быстро реагировать с расщепленной клетке группы во время УФ-облучения для минимизации токсичности. Многочисленные мышей с различными штаммами (например СХ-1 и DR-1) были протестированы с использованием эту формулировку, и мы не обнаружили никаких поведенческих или других дефектов здравоохранения в этих мышей до шести месяцев. Если инъекция не следует сразу же после ультрафиолетового облучения, то CMPS будет сложить в гомотримерную тройных спиралей, которые не имеют гибридизации потенциала. 2С показывает крайний случай, когда перед инъекцией в CMPS были полностью повторно собранный в тройных спиралей на долгое время задержки (> 2 дня). Чтобы обойти эту проблему, решение CMP должны быть подготовлены в относительно низкой концентрации (например, ~ 40 мкм), и вводили мышам сразу после УФ-decaging. Из-за медленных темпов тройной спирали, сложив CMPS в разбавленных условиях (половина времени из рефолдинга:> 50 мин) и краткосрочной ультрафиолетового облучения и времени впрыска (5 ~ 7 мин общего), большинство CMPS поступают в кровоток в одно- прядь форму, когда этот протокол следует. После инъекций, CMPS, как ожидается, остаются в виде отдельных нитей-, а концентрация снижается на коэффициент 20 в общей крови, что приводит к резкому снижению скорости сборке 18. Если инъекции задерживается (например, из-за обращения с животными) и гомотримерную рефолдинг подозревается, что частично собранные пептиды могут быть возобновлена при нагревании выше 7076; C для диссоциации CMPS в одно-нитей, а затем быстрое охлаждение и инъекции. Хотя менее удобно, такие тепловые-диссоциирован CMPS также показывают ожидаемые результаты в естественных условиях, направленных (рис. 2, г).
В этой демонстрации голых мышей были использованы для визуализации флуоресценции NIR, потому что до 50% от сигнала NIR может быть заблокирован волос. При работе с шерстяными мышиных моделях (особенно те, с черными волосами), мы рекомендуем бритья мышь в интересующей области до визуализации с помощью электробритвы или удаления волос. На рисунке 1, есть ложные положительные сигналы от брюшной области животного, которое вызвано авто-флуоресценции хлорофилла в рацион животных. Такие фоновые сигналы могут быть значительно снижены за счет перехода мышь, чтобы очищенных диет примерно за 4 дня до съемки. Как видно на фиг.1 и 2А, существуют серьезные поглощений CMP в штопорэ. Поэтому, чтобы избежать артефактов в результате несовершенных инъекций в хвостовую вену, мы рекомендуем инъекционных в задней части хвоста, так что место инъекции не захватили в образе флуоресценции.
Меченый CMP позволяет адресно и визуализации определенных местах коллагена ремоделирования в естественных условиях, которые трудно обнаружить с помощью других методов. Например, ELISA на основе крови и мочи анализы чувствительны к расщепленных фрагментов коллагена телопептидных, но способ не может локализовать источник оборота коллагена, так как они предназначены растворимых антигенов. Основные ограничения естественных техники визуализации при помощи NIR помечены CMPS являются глубины проникновения затухание и тушение проксимальных объединили эритроцитов как гемоглобин является эндогенным жажду из 680/710 нм ЧМР красителей. Будущие приложения из КСС в естественных изображений включают ОФЭКТ или ПЭТ, используя CMPS меченные прямых гамма-излучающих радионуклидов или позитронов EMItters, для диагностики болезненных состояний, связанных с ремоделирование коллагена (например остеопороз, артрит, атеросклероз, и фиброз). Эти радио-меченных CMP аналоги устранит ограничения потери сигнала из-за глубины тканей и наличии объединенных эритроцитов, и позволит количественные измерения больные ткани. Кроме того, сравнительно поздно время визуализации (например, 48-96 HPI) в результате медленного связывания и оформления CMPS может сделать это трудно следить за быстрыми изменениями в коллагеновой ремоделирования. Такое ограничение можно преодолеть путем дальнейшего техники связывания кинетики и сродства CMP агентов воображения. С CMP связывается с денатурированные коллагены, которые имеют мало структуру, изображений CMP основе коллагена является дополнением к генерации второй гармоники микроскопии, которые могут только изображения коллагеновых волокон 5.
При окрашивании тканей секции с флуоресцентно помечены CMPS, мы обнаружили, что полезно для инкубацииОбразцы в УФ-активированный пептидных растворов при 4 ° С, так как тройной винтовой гибридизации облегчается при более низкой температуре 1,20. Было также установлено, что погружением слайдов в свежем буфере PBS в окрашивания банку является наиболее эффективным способом, чтобы смыть несвязанных CMPS, которая работает гораздо лучше, чем просто пипетки стиральные буферы над образцов. CMP-коллаген прядь гибридизации очень специфичен и надежный, поэтому просто окрашивание Протокол, представленные в этом видео может быть легко модифицированы для costaining дополнительные биомаркеров, а также для определения деградированных коллагенов в разделах незакрепленными ткани. Это эффективный и удобный альтернативой использованию анти-коллагеновых антител для детектирования волокнистых коллагены в различных гистологических образцов.
Disclosures
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Гилберт Грин для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана грантами от NIAMS / NIH (R01-AR060484) и DOD (W81XWH-12-1-0555), присужденной SMY, и из NIH (U24 CA92871 и U54 CA151838), заключенных с MGP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1. |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12. |
| Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
| Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
| Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
| DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
| Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
| Syringes | BD | 329461 | |
| UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
| Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
| Surgical forceps and scissors | |||
| EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
| 20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
| Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
References
- Li, Y., et al. Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).
- Perentes, J. Y., et al. et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).
- Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe. Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).
- Wang, A. Y., et al. Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity. Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).
- Bächinger, H. P., Morris, N. P. Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography. Matrix. 10, 331-338 (1990).
- Li, Y., et al. Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides. Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).
- Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions. Biopolymers. 95, 94-104 (2011).
- Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides. Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).
- Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides. J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).
- Wang, A. Y., et al. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis. Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).
- Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).
- Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds. Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).
- van Hagen, P. M., et al. Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy. Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).
- Boudko, S., et al. Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).
- Ackerman, M. S., et al. Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides. J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Brodsky, B., Persikov, A. V. Molecular structure of the collagen triple helix. Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).
