Summary
Protokol for formering af dissociated høj kvalitet gliom kirurgiske prøver i serum-fri neurosfære medium til at vælge for celler med kræft stamcelle fænotype. For prøver, der ikke vokser som neurosfærer, foreslås en alternativ protokol. En paraffinindlejringsteknik til vedligeholdelse af 3D-neurosfærearkitekturen for immunokytokemi er beskrevet.
Abstract
Glioblastomas, den mest almindelige og aggressive form for astrocytoma, er ildfast til terapi, og molekylært heterogene. Evnen til at etablere cellekulturer, der bevarer den genomiske profil af forældrenes tumorer, til brug i patientspecifikke in vitro- og in vivo-modeller, har potentialet til at revolutionere den prækliniske udvikling af nye behandlinger for glioblastoma skræddersyet til de molekylære egenskaber ved hver tumor.
Begyndende med friske høj kvalitet astrocytoma tumorer dissociated i enkelt celler, vi bruger neurosfæren assay som en berigelse metode til celler præsenterer kræft stamcelle fænotype, herunder udtryk for neurale stamcelle markører, langsigtet selvfornyelse in vitro, og evnen til at danne orthotopic xenograft tumorer. Denne metode er tidligere blevet foreslået, og er nu i brug af flere efterforskere. Baseret på vores erfaring med dissociering og dyrkning af 125 glioblastoma prøver, vi ankom til den detaljerede protokol, vi præsenterer her, egnet til rutinemæssig neurosfære dyrkning af høj kvalitet astrocytomas og storstilet udvidelse af tumorigenic celler til prækliniske undersøgelser. Vi rapporterer om effektiviteten af succesfulde langsigtede kulturer ved hjælp af denne protokol og foreslår overkommelige alternativer til dyrkning af dissociated glioblastoma celler, der undlader at vokse som neurosfærer. Vi beskriver også i detaljer en protokol til bevarelse af neurosfærer 3D-arkitektur for immunhistokemi. Cellekulturer beriget med CSC'er, der er i stand til at generere ortopiske xenograft-modeller, der bevarer de molekylære signaturer og heterogenitet af GBMs, bliver stadig mere populære til studiet af GBMs biologi og til forbedret design af præklinisk testning af potentielle terapier.
Introduction
Glioblastoma (GBM), en WHO klasse IV astrocytoma, er den mest udbredte og aggressive primære hjernesvulst. Forskellige udviklingsmæssige fænotyper er vedtaget af GBM tumorceller, herunder celler udstiller "kræft stamcelle" (CSC) egenskaber, såsom udtryk for neurale stamceller (NSC) markører, langsigtet selvfornyelse, og potentialet til at give anledning til mere differentierede celler udtrykke astrocytiske markører og danner hovedparten aftumoren 1-3. Mens der stadig er behov for afklaring med hensyn til CSC's molekylære identitet og kliniske implikationer, er fokus for det nuværende arbejde på den operationelle definition af CSC: langsigtet selvfornyelse in vitro og evnen til at differentiere og reproducere den oprindelige tumor ved ortopisk implantation hos immunkompromitterede gnavere.
Glioblastoma celler er blevet dyrket i årtier i traditionelle medium, der indeholder 10% føtal kvæg serum (FBS) og flere høj passage kommercielt tilgængelige serum dyrket GBM cellelinjer er tumorigenic i immunkompromitterede gnavere, men der er betydelig genomisk og molekylær afvigelse fra den oprindelige tumor4, begrænse deres anvendelse som klinisk relevante modeller. På det seneste er celler med stamceller/stamceller af fænotypen, der reagerer på EGF og bFGF, blevet identificeret i GBMs2. Efterfølgende blev dissociated GBM tumorprøver dyrket i et serumfrit medium3, oprindeligt formuleret til udvælgelse og udvidelse af neurale stamceller fra den voksne pattedyrshjerne5. Disse kulturforhold hindrer væksten af de fleste nonneoplastiske og mere differentierede tumorcellepopulationer, mens de favoriserer væksten af stamceller og stamceller som flydende multicellulære sfæroider eller neurosfærer3, efterligner adfærden hos voksne pattedyr neurale stamceller5. Omfattende side om side sammenligning af primære GBM-celler dyrket i enten neurosfære medium suppleret med vækstfaktorer (NMGF) eller i den traditionelle vækst medium suppleret med 10% FBS, afslørede, at GBM neurosfærer var tumorigenic, præsenterede multilineage differentiering potentiale, og bevarede genotypen af den oprindelige tumor, i modsætning til de 10% FBS kulturer, som ikke var tumorigenic ved lave passager og betydeligt afveg fra de oprindelige tumorer ved sene passager4.
Isolering af CSC fra dissociated GBM tumorer ved cellesortering baseret på udtrykket af formodede CSC markør CD133 er også blevet foreslået6,7, men yderligere arbejde viste, at CSC fænotype ikke er endeligt forbundet med udtrykket af sådanne markører8-10, hvilket mindsker den oprindelige begejstring for denne strategi, mens nye markører stadig testes10. Den manglende tilgængelighed til dato af et valideret sæt markører, der definerer CSC, sammen med målet om storstilet forstærkning af disse celler til prækliniske undersøgelser, gør brugen af cellesortering upraktisk for rutinemæssige CSC-berigede kulturer. GBM-celler udvalgt af evnen til at vokse som neurosfærer i NMGF udtrykker altid neurale stamcellemarkører. Vi har observeret, at Sox2 og nestin allestedsnærværende udtrykkes i neurosfærekulturer, mens CD133-protein er til stede i en delmængde af GBM-neurosfærerne (ikke-offentliggjorte data og reference11).
Flere laboratorier forfølger neurosfærekulturer fra glioblastoma tumorer ved hjælp af den samme generelle tilgang til enzymatisk dissociation og dyrkning i serumfri medium suppleret med vækstfaktorer3,4,11-14, mens andre kolleger har rapporteret forsøg på at vokse langsigtede neurosfærekulturer fra GBM-prøver uden succes . Den generelle metode til enzymatisk dissociation og neurosfærekultur af højkvalitetsgliomer præsenteret her svarer til det, der er skitseret i ovenstående publikationer. Vi har optimeret protokollen baseret på vores erfaring med at adskille og dyrke over 100 GBM prøver. Effektiviteten af at opnå langsigtede neurosfærekulturer fra friske GBM-prøver, der anvender den protokol, der præsenteres her, er over 40%, svarende til de få rapporter, der viser effektivitetsdata3,15, hvilket fører til udforskning af alternative protokoller såsom dyrkning af celler kontinuerligt eller periodisk i serumfrit medium i nærværelse af EGF og bFGF som monolayers på overflader belagt med ECM-protein16,17. Neurosfærekulturer er stadig den mest validerede og stadig mere populære tilgang til at bevare GBM-tumorer molekylære egenskaber og tumorigenic potentiale3,4,11-14, således at vores tilgang er at forsøge neurosfærekulturer først, mens vi samtidig tester alternative metoder til dyrkning af GBM-celler, der ikke danner langsigtede selvfornyende neurosfærer ( Figur1), for at øge repræsentationen af GBM-tumorer, der kan bruges i dyremodeller. Her præsenterer vi en protokol for dyrkning af neurosfærer fra GBMs. For celler, der undlader at danne neurosfærer, viser vi en simpel modifikation i vækstmediet, som det første forsøg på at dyrke tumorigenic celler fra nonneurosphere danner GBMs, med lovende resultater og stadig under omfattende validering.
Protocol
1. Enkelt celle suspension fra friske kirurgiske Glioblastoma Specimen for Neurosphere Kultur
- Med skriftligt samtykke fra patienter og i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer, indsamle tumorprøver til cellekultur umiddelbart efter resektion kirurgi af høj kvalitet gliom.
- Bekræft diagnose af tumorprøve ved histopatologi. Straks transporteres prøven fra operationsstuen til laminar flow vævskultur hætte, til behandling inden for 1 time fra operationen.
BEMÆRK: For operationer på et fjerntliggende sted, skære tumor prøve i mindre fragmenter og sted i et rør, der indeholder DMEM/F12 (holde på is). Tumoren kan behandles flere timer efter operationen. - Begyndende med 200-500 mg væv (optimal), hakke tumorprøven ved hjælp af en skalpelblad og overføre til et 15 ml rør, der indeholder 10 ml DMEM/F12 serumfrit medium. Bland ved at vende flere gange, lad tumorstykkerne sedimentere ved tyngdekraften, fjern medium og gentag efter behov.
- Forbered enzymatisk væv dissociation løsning og Stop Solution frisk.
- Enzymatisk vævsafkoblingsopløsning: 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, 2,5 ml Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) calcium- og magnesiumfri, 2,5 ml Kollagen IV-stamopløsning (2.000 U/ml i HBSS med calcium og magnesium).
- Stopopløsning: 5 ml Trypsin-hæmmeropløsning, 5 ml DMEM/F12, 2 μl på 5.000 U/ml DNAse I (fremstillet i HBSS calcium- og magnesiumfri).
- Fjern medium og tilsæt enzymatisk væv dissociation opløsningsopløsning til hakket tumor prøve, ved hjælp af 2 ml for hver 0,5 g væv. Bland forsigtigt ved at vende.
- Vævet inkuberes ved 37 °C i en vævskulturinkubator under rotation i 30 min.
- Triturat med en 2 ml pipette og stop fordøjelsen eller vend tilbage til inkubatoren i yderligere 15-30 minutters inkubation afhængigt af fordøjelsesniveauet.
- Opfordr fordøjelsen ved at tilsætte 2 volumener Stop-opløsning og triturat mekanisk med en 5 ml serologisk pipette.
- Det ufordøjede materiale filtreres ud gennem en 40 μm cellestien. Pellet cellerne på 800 x g i 5 min på værelse temp, efterfulgt af vask 3x i 10 ml DMEM/F12.
- Den endelige cellepille blev genbrugt i 5 ml DMEM/F12.
- Lag langsomt celleaffjedringen over 5 ml Lympholyte-M og pellet ved 1.300 x g i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Grænsefladelaget, der indeholder de nukleerede celler, overføres til et 15 ml rør, der indeholder 10 ml DMEM/F12.
- Pellet cellerne ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Gentag vask med DMEM/F12 2x mere.
- Cryopreserve de resulterende enkeltceller til videre brug ved at genbruge pellet i Recovery Cell Freezing Medium, aliquoting i kryokinials, langsom frysning, og opbevaring i flydende nitrogen.
- Til kultur, genbruges cellerne i Neurosphere Medium suppleret med vækstfaktorer (NMGF), og plade ved relativt lav densitet (<1 x 105 celler / ml) i en almindelig T25 vævskultur kolbe under standardbetingelser, 5% CO2, 37 °C, befugtet væv kultur inkubator (Figur 1A).
- Forbered NMGF ved hjælp af følgende opskrift
For 500 ml of DMEM/F12 Lagerløsning lydstyrke endelig koncentration N2 tillæg (10x) 5 ml 1x 250 mg/ml BSA-stamopløsning 1 ml 0,5 mg/ml 10 mg/ml Gentamicin reagens 1,25 ml 25 μg/ml 100x antibiotikum/antimycotisk 2,5 ml 0,5 x 100 mg/ml bFGF 0,1 ml 20 ng/ml 100 mg/ml GLOBALISERINGSFONDEN 0,1 ml 20 ng/ml
- Forbered NMGF ved hjælp af følgende opskrift
- Overfør neurosfærer, der danner over 1-3 uger (Figur 1B-E) til friske kolber, for at adskille fra vedhæftede celler og snavs. Udfør delvise medieændringer hver 3-4 dage.
BEMÆRK: Hvis ortopisk xenograft tumor adskilles ved hjælp af ovenstående protokol, kan trin 1.11-1.13 udelades.
2. Glioblastoma Neurosphere Kultur Vedligeholdelse og Downstream Applications
-
Dissociation: Overvåg neurosfærens kulturer og udfør delvise mediumændringer hver 3-4 dage. Når de fleste multicellulære neurosfærer i kolben når op på 100 μm i diameter, skal du adskille dem i en enkelt cellesuspension:
- Overfør mediet, der indeholder neurosfærerne, til et 15 ml rør, tyngdekraften sediment neurosfærer i ca 5 min, fjern mediet og resuspend cellepillen i 10 ml calcium- og magnesiumfri DPBS.
- Bland og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, da cellerne sediment ved tyngdekraften.
- 7-8 ml DPBS fjernes derefter mekanisk af neurosfærerne med en forskudt serologisk pipette.
- Pellet de dissociated celler ved 800 x g i 5 min ved 4 °C.
- Gennemløb: Genbrug de dissociated celler (trin 2.1.) i NMGF og del i det nødvendige antal kolber (1:3), og inkuber under standardbetingelser. Sekundære neurosfærer vil danne, og bør efterfølgende adskilles for dannelsen af tertiære sfærer.
- Vurdering af langsigtet selvfornyelse: Gentag dissociationsproceduren, indtil neurosfærenkulturen opnår mindst 10 passager, svarende til mindst 2 måneder i kultur.
-
Frysning: For at kryopræservere neurosfærerne skal du adskille neurosfærerne (trin 2.1.) og genbruge cellepillen i Recovery Cell Freezing Medium, aliquot i kryoovier, langsom fryse og opbevare i flydende nitrogen.
- Til dyrkning af neurosfæreceller fra en frossen bestand: Tø cellerne op ved 37 °C, og overfør straks til et 15 ml rør, der indeholder 10 ml DMEM/F12. Røret blandes forsigtigt, og derefter drejes cellerne ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Vask cellepille endnu en gang og genbruge cellerne i NMGF og overføre til en T25 vævskultur kolbe.
-
Celleaffjedring for intrakranielt implantat i immunkompromitteret mus:
- Dissociter neurosfærerne (trin 2.1.) og genbrug cellepillen i calcium- og magnesiumfri DPBS. Tæl levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer og trypan blå udelukkelse.
- Beregn antallet af celler, der er nødvendige for implantatet, typisk 3 x10 5 celler/mus, overfør det ønskede antal celler til et hætteglas, og pellet cellerne ved 1.000 x g.
- Cellepellet opsuges igen i et volumen, der er egnet til implantat (5 μl/mus) ved forsigtigt at trykke på mikrocentrifugerøret. Sæt celleaffjedringen på is og brug inden for 2 timer.
3. Alternativ protokol for dyrkning af tumorigenske glioblastomaceller (i de tilfælde, hvor neurosfærekulturen mislykkes)
- Suppler NMGF-mediet med føtalt kvægserum til en endelig koncentration på 2% FBS/NMGF.
- Begyndende med celler i NMGF-dyrkning: Høst levedygtige celler fra NMGF-kolben (Figur 1F), der genudsættes i 2% FBS/NMGF og plade ved relativt lav densitet (<1 x 105 celler/ml) i en almindelig T25-vævskulturkolbe og kultur under standardbetingelser, 5% CO2, 37 °C, luftfugtet vævskulturinkubator (Figur 1G).
- Begyndende med frosne aldrig dyrkede celler (trin 1.14.): Tø cellerne op, vask i serumfrit medium og plade i 2% FBS/NMGF og kultur som beskrevet i trin 3.2. Dyrkning i NMGF i 3 dage før overførsel af levedygtige celler til 2% FBS / NMGF er et alternativ til preselect væk differentierede celler.
4. Morfologisk og molekylær analyse af neurosfærer ved immunhistokemi
- Kultur neurosfærerne, indtil de fleste flydende multicellulære sfæroider når 100 μm diameter.
- Dyrkningskolber fjernes fra inkubatoren, neurosfærerne pelletes straks, medium fjernes og tilsættes 10 ml DPBS uden at forstyrre pelletlen. Fjern DPBS, resuspend i 10% neutral buffer formalin og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Pellet sfæroiderne, genbruges i 30% ethanol og inkuberes i 30-45 min.
- Udskift 30% ethanol med 50% ethanol, inkuber i 15 min og erstatte med frisk 50% ethanol, inkuber yderligere 30 min.
- Gentag (trin 4.4.) med 70% ethanol.
- Udskift med 95% ethanol to ændringer 10-20 min hver, og gentag med absolut ethanol, indtil sfæroider er lyse hvide og kondenseret.
- Lav en lille filterpapirkegler ud af linsepapir, og læg den i en lille tragt i et bægerglas. Våd linsen papir med absolut alkohol.
- Løsn pellet lidt med frisk 100% ethanol, hæld overskydende ethanol og hæld spheroids gennem linsen papir kegle, og sørg for at de går til spidsen af keglen. Skyl røret med yderligere absolut ethanol og hæld eventuelle resterende sfæroider gennem linsen papir kegle.
- Fjern papirkeglerne fra tragten, og flyt forsigtigt spheroiderne ind i bunden af keglen. Fold papiret ind i en firkant og sørg for, at spheroids er så sikkert lukket som muligt.
- Overfør de emballerede neurosfærer til en kassette og overfør til en automatisk vævsprocessor.
- Programmer den automatiske vævsprocessor som følger: absolut ethanol, 10 min, xylen, 15 min (2x), paraffin, 10 min (4x).
- Fjern kassetten fra processoren og læg den på den opvarmede del af et paraffinindlejringssystem . Sørg for, at hele overfladen er fri for fragmenter, støv eller andet snavs, og sifon al paraffin ud af pincetopvarmningsbrøndene. Varm ren paraffin fri pincet og tilføje en lille mængde paraffin til en opvarmet base skimmel.
- Åbn kassetten, fjern pakken, og placer den på den opvarmede del af indlejringssystemet. Åbn forsigtigt papirkeglerne, indtil spheroiderne er synlige. Saml så meget af materialet som muligt med forvarmede pincet og overføre til den flydende paraffin i basen formen.
- Gentag som krævet for at hente så mange af de sfæroider som muligt. Skrab forsigtigt silkepapiret med et forvarmet rent barberblad, der er blevet tørret med ethanol for at indsamle eventuelle resterende spheroider uden at få noget papir ind i blokken.
- Opbryd forsigtigt eventuelle kugleformede klumper med varme pincet. Flyt sfæroiderne væk fra hjørnerne til et ensartet centralt lag. Flyt bundformen til køleområdet for at sikre spheroiderne på plads, tilsæt kassetten, fyld langsomt med paraffin og chill grundigt.
- Neurosfæren paraffin blok kan bruges til normal sektionsopdeling og immunohistochemistry.
Representative Results
Vi har anvendt den ovenfor beskrevne protokol til at dissociere og kultur 125 friske kirurgiske glioblastomaprøver (Figur 1), 88 nydiagnosticerede og 37 tilbagevendende tumorer (Tabel 2) med godkendt patientsamtykke og i henhold til institutionelle retningslinjer. Effektiviteten af protokollen til etablering af langsigtede neurosfærekulturer var 41,6%, og lignende for nydiagnosticerede tumorer og tilbagevendende tumorer (Tabel 2). For nogle GBM-prøver dannes neurosfærer i de første par dage (Figur 1B og 1C), mens der for andre kræves længere dyrkningstid (Figur 1D og 1E).
Effektiviteten af neurosfæredannelse var ikke udelukkende afhængig af niveauet af nekrose i vævet, som eksemplificeret ved resultaterne fra en nydiagnosticeret tumor med høj celletæthed (GBM1) og en tilbagevendende og nekrotisk tumor (GBM2), der behandles i henhold til protokol 1 og 2, der begge giver neurosfærekulturer (Figur 2).
Test af tumorigenic potentiale af hver neurosfære kultur i immunkompromitterede mus er den afgørende validering af denne tilgang til berigelse af CSC'er. Ved hjælp af en protokol svarende til tidligere beskrevet18, GBM1 og GBM2 neurosfærer blev implanteret i hjernen hos immunkompromitterede mus, under institutionelle og IACUC dyrepleje retningslinjer. Xenograft tumorer præsentere morfologiske egenskaber GBMs, såsom invasion i hjernen parenchyma og nekrose (Figur 2).
GBM3 blev dissociated (Figur 1A) og dyrket i neurosfære medium (Figur 1D og 1E), og i 2% FBS / NMGF (Figur 1D, 1G, og 1H). Monolayer celler dyrket i 2% FBS / NMGF og neurosfære celler dyrket i NMGF blev dissociated og det samme antal celler blev implanteret i nøgen mus, ved hjælp af samme procedure som i figur 2. Ingen forskelle i overlevelse, tumorvækstdynamik eller morfologi blev observeret mellem de to præimplante kulturmetoder (Figur 3A-C). Tumor vækst egenskaber ændrer sig ikke op til den seneste testet passage, P20 for neurosfærer, og P10 for 2% FBS / NMGF. Mens neurale stamcellemarkører, herunder Sox2, er nedreguleret i de fleste primære GBM-celler dyrket i 10% FBS 3,4,11, NMGF suppleret med 2% FBS giver mulighed for fastholdelse af Sox2 udtryk (Figur 3D).
Neurosfærer blev behandlet i henhold til protokol 4 og mærket med H&E (Figur 4A), anti-Sox2-antistof, der viser nuklear lokalisering (Figur 4B) og EGFR-antistof, cellemembranlokalisering (Figur 4C). Denne protokol er blevet anvendt til at få adgang til stimuli-afhængige ændringer i udtrykket af nestin, GFAP og spredningsmarkøren Ki6711.
Tabel 2. Effektivitet af at udlede langsigtede selvfornyende neurosfære kulturer fra GBMs.
| Patologi | Nielsen | Procentdel af prøver, der giver langsigtede selvfornyende neurosfærer (n) |
| Glioblastoma - ubehandlet, første operation | 88 | 42.0% (37) |
| Glioblastoma - tilbagevendende | 37 | 40.5% (15) |
| total | 125 | 41.6% (52) |
Figur 1. Cellekultur fra friske glioblastoma kirurgiske prøver. Friske tumorer er enzymatisk dissociated i enkelt celler. Nukleateret cellegrænseflade fra tæthedsseparationsmediet besprættes derefter i NMGF. Dissociated neurospheres er belagt i NMGF, og typisk 1 dag efter plating der er døde celler, snavs, vedhæftede enkeltceller, og lejlighedsvis dividere celler i suspension (A). Neurosfæredannelse er hurtigere i nogle tilfælde (B, C) og langsommere for andre (D, E). Alle neurosfærer er dissociated og replated i mindst 10 passager, 41,6% GBMs udbytte langsigtede selvfornyende neurosfærer. Levedygtige GBM dissociated celler, der undlader at vokse som neurosfærer (F) kan overføres til alternative kultur betingelser, for eksempel 2% FBS / NMGF (G, H). Søjle (A), 100 μm, gælder for alle billeder. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Neurosfære generation og ortopisk mus xenografts fra GBM tumorer. En tumorprøve med høj celletæthed (GBM1) og en tumor med højt nekrotisk indhold (GBM2) blev dissocieret og neurosfærer dyrket i 10 passager i henhold til protokol 1 og 2. Immunkompromitterede mus blev implanteret med 3 x 105 dissociated neurosphere celler og ofret, når døende. Musehjerner var formalin faste og paraffin indlejret til H &E farvning og immunohistochemistry påvisning af menneskelige markører, human mitokondrier (hMit) eller større histokompatibilitet klasse I subunit HLA-A (MHC-I). Klik her for at se større billede.
Figur 3. Lignende tumorvækst hos mus implanteret intrakranisk med GBM3-celler dyrket som neurosfærer i NMGF eller som monolag i 2% FBS / NMGF. (A) Kaplan-Meier overlevelse kurver for GBM3 dyrket som enten neurosfærer i NMGF eller monolayers i 2%FBS/ NMGF (begge passage <10) viser ingen forskel i overlevelse (n = 10, p = 0,7174, log-rank test). (B) Tumor vækst overvåges af levende bioluminescens imaging (BLI) viser ingen signifikant forskel i tumor vækst dynamik mellem de to grupper. (C) Tumormorfologi kan ikke skelnes fra 4 GBM3 xenografts, 2 dyrket i NMGF og 2 dyrket i 2% FBS / NMGF. MHC-I plet som beskrevet for figur 2. Skala, 600 μm. (D) Vestlige blot viser stamcelle maker Sox2 udtryk bevaret i 2% FBS / NMGF kulturer bruges til at indlede xenograft tumorer (A-C). Klik her for at se større billede.
Figur 4. Analyse af proteinudtryk i neurosfæresektioner ved immunohistochemisteri. Neurosfærekulturer var formalin-faste og paraffin indlejret som beskrevet i procedure 4, og plettet med H&E (A), anti-Sox2 antistof (B), og anti-EGFR antistof (C). DAB-substrat blev brugt til at visualisere (B,C). Bar, 20 μm. Klik her for at se større billede.
Discussion
Korrekt enzymatisk tumorcelle dissociation er et kritisk skridt i denne protokol. Vævet skal hakkes i et godt stykke tid inden inkubation i celleafkoblingsopløsning ved 37 °C under rotation i mindst 30 minutter, når vævet skal være mekanisk tritureret, og udvidelsen af dissociationen skal verificeres. Afhængigt af graden af vævssammenhold kan inkubationen forlænges med yderligere 15-30 min. efter behov for at fuldføre dissociation i enkelte celler. Inkubation i dissociationsopløsning i mere end 1 time anbefales ikke på grund af nedsat cellegabilitet. Selv om den optimale mængde af udgangsvæv er 200-500 mg, denne protokol har ført til en vellykket neurosfære kulturer fra så lidt som 50 mg tumorvæv.
Serumfri NMGF er et selektivt medium, og en procentdel af neoplastiske celler, der består af størstedelen af tumoren, såvel som værtsceller, vil ikke overleve, mens andre vil knytte sig til den vævskulturbehandlede kolbe efter plating. Det er afgørende, at de neurosfærer, der vil danne over 1-3 uger (Figur 1B-E) overføres til friske kolber, for at adskille fra differentierede tumorceller og snavs.
GBM-celler enzymatisk dissociated og aldrig dyrket (trin 1,10) kan kryopreserveret som en backup kilde til celler til kultur i alternative medier, hvis neurosfæren kultur mislykkes. Vi har med succes opnået neurosfærekulturer fra sådanne frosne bestande samt monolagsceller, der vokser i 2% FBS / NMGF.
Begrebsmæssigt, "kræft stamcelle" er et arbejde i gang, og dette nye område vil drage fordel af yderligere afklaring, da de kliniske konsekvenser er betydelige, især i generation af tumor heterogenitet, plasticitet, og resistens over for terapi19,20. Ud over at være afgørende for at generere patientspecifikke GBM-dyremodeller er neurosfærens kulturer også værdifulde for in vitro-undersøgelser som ændring i cellesignalering og genekspression som reaktion på vækstfaktorer, hypoxi og farmakologiske stoffer11,21. Vi har valgt at bruge tværsnit af formalin faste og paraffin indlejrede neurosfærer, bevare 3D-arkitekturen, studere proteinudtryk og postoversættelsesændringer ved immunhistokemistry11, på grund af den overlegne subcellulære lokalisering i forhold til den mere almindelige metode til mærkning og billeddannelse af hele sfæren.
Det har vist sig, at ikke alle celler i neurosfærer afledt af voksne pattedyr hjerne er stamceller22. Tilsvarende er neurosfærerne dyrket fra GBM-tumorer sandsynligvis ikke kloniske på grund af tilstedeværelsen af mere differentierede kræft stamceller og selvsammenlægning, kendt for at forekomme ved høje celletætheder23, som betragtes som en begrænsning af denne metode af nogle. For at favorisere berigelse for langsigtede selvfornyende stamceller, i modsætning til bare forfædre, der kan forbigående vokse som neurosfærer22, adskilles de primære neurosfærer for sekundær neurosfæredannelse og videre passage i mindst 10 passager, omtrent svarende til 2 måneder i kontinuerlig kultur, hvilket er en indikation af en befolkning beriget i stamceller22. Det er vores erfaring, GBM neurosfære kulturer, der opnår dette mærke kan fortsætte med at blive udvidet som neurosfærer på ubestemt tid. Tumor grade spørgsmål, da vi har opnået succesfulde kulturer fra GBMs og anaplastiske astrocytomas, WHO klasse IV og III, henholdsvis, men ikke fra lavere kvalitet gliomer.
Den mest udbredte metode til dyrkning af glioblastoma celler, i traditionelle vækstmedium suppleret med 10% FBS, fører til betydelig genomisk og fænotypisk afvigelse fra de oprindelige tumorer 4. På den anden side er neurosfærekulturer en stabil og langsigtet kilde til celler, der præsenterer kræft stamcelle fænotype4. Neurosfæren metode er blevet stadig mere populær til berigelse af CSC på lang sigt kulturer for orthotopic mus xenograft modeller, på trods af ikke at være en succes for alle høj kvalitet astrocytoma prøver, som repræsenterer den største svaghed ved denne metode. Undersøgelser for at forstå, hvordan molekylære egenskaber ved forældrenes tumorer kan påvirke neurosfæren dannelse er i gang. Udforskning af praktiske alternative metoder til kultur høj kvalitet gliomer, efterfulgt af omfattende validering er givet, i betragtning af de betydelige fordele ved at have patient specifikke GBM-modeller, som vi går ind i en æra af personlig medicin, næret af tilgængeligheden af "omics" information og øget antal potentielle målrettede behandlinger.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde er blevet finansieret af Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
- Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
- Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
- Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
- deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
- Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).
- Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
- Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
- Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
- Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
