Summary
Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.
Abstract
Astrositomların en yaygın ve agresif formu olan glioblastomalar, tedaviye refrakter ve moleküler olarak heterojendir. Ebeveyn tümörlerinin genomik profilini koruyan hücre kültürlerini, hastaya özgü in vitro ve in vivo modellerinde kullanılmak üzere oluşturabilme yeteneği, her tümörün moleküler özelliklerine göre uyarlanmış glioblastoma için yeni tedavilerin preklinik gelişiminde devrim yaratma potansiyeline sahiptir.
Tek hücrelere ayrışmış taze yüksek dereceli astrositoma tümörleri ile başlayarak, nörosfer testini, nöral kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu, uzun süreli kendini yenileme in vitrove ortotopik ksinograft tümörleri oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere kanser kök hücre fenotipini sunan hücreler için bir zenginleştirme yöntemi olarak kullanıyoruz. Bu yöntem daha önce önerildi ve şimdi birkaç araştırmacı tarafından kullanılıyor. 125 glioblastoma örneğini ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak, burada sunduğumuz ayrıntılı protokole ulaştık, yüksek dereceli astrositomaların rutin nörosfer kültleme ve preklinik çalışmalar için tümörojenik hücrelerin büyük ölçekli genişlemesi için uygun. Bu protokolü kullanarak başarılı uzun vadeli kültürlerin verimliliği hakkında rapor veriyoruz ve nörosfer olarak büyümeyen ayrışmış glioblastoma hücrelerini kültleme için uygun fiyatlı alternatifler öneriyoruz. Ayrıca immünostokimya için nörosferler 3D mimarisini korumak için bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. GBM'lerin moleküler imzalarını ve heterojenliğini koruyan ortotopik ksinograft modelleri üretebilen CSC'lerde zenginleştirilmiş hücre kültürleri, GBM'lerin biyolojisinin incelenmesi ve potansiyel tedavilerin klinik öncesi testlerinin geliştirilmiş tasarımı için giderek daha popüler hale gelmektedir.
Introduction
WHO sınıf IV astrositom olan Glioblastoma (GBM), en yaygın ve agresif primer beyin tümörüdür. Nöral kök hücre (NSC) belirteçlerinin ekspresyotiği, uzun süreli kendini yenileme ve astrositik belirteçleri ifade eden vetümörünbüyük kısmını oluşturan daha farklı hücrelere yol verme potansiyeli gibi "kanser kök hücresi" (CSC) özellikleri sergileyen hücreler de dahil olmak üzere gbm tümör hücreleri tarafından çeşitli gelişimsel fenotipler benimsenmiştir. KSS moleküler kimliği ve klinik etkileri ile ilgili açıklama hala gerekli olmakla birlikte, mevcut çalışmanın odak noktası KSS'nin operasyonel tanımıdır: uzun süreli kendini yenileme in vitro ve immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde ortotopik implantasyon üzerine orijinal tümörü ayırt etme ve çoğaltma yeteneği.
Glioblastoma hücreleri on yıllardır% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren geleneksel ortamda kültürlenmiştir ve piyasada bulunan birkaç yüksek geçişli serum kültürlü GBM hücre hatları immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde tümörijeniktir, ancak orijinal tümörden önemli genomik ve moleküler ayrışma vardır4, klinik olarak ilgili modeller olarak kullanımlarını sınırlar. Daha yakın zamanda, EGF ve bFGF'ye duyarlı kök/progenitör fenotipli hücreler GBM2'detanımlanmıştır. Daha sonra, ayrışmış GBM tümör örnekleri serumsuz bir ortamda kültürlendi3, başlangıçta nöral kök hücrelerin yetişkin memeli beyninden seçimi ve genişlemesi için formüleedilmiştir 5. Bu kültür koşulları, çoğu nonneoplastik ve daha farklı tümör hücre popülasyonlarının büyümesini engellerken, kök ve progenitör hücrelerin yüzen çok hücreli sferoidler veya nörosferler olarak büyümesini destekler3, yetişkin memeli nöral kök hücrelerin davranışını takliteder 5. Büyüme faktörleri (NMGF) ile desteklenmiş nörosfer ortamında veya %10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında kültürlenen birincil GBM hücrelerinin kapsamlı bir şekilde yan yana karşılaştırılması, GBM nörosferlerinin tümörojenik olduğunu, çok satırlı farklılaşma potansiyeli sunduğunu ve düşük pasajlarda tümörijenik olmayan ve geç pasajlarda orijinal tümörlerden önemli ölçüde ayrılan% 10 FBS kültürlerinin aksine orijinal tümörün genotipini koruduğunu ortaya koydu4.
CSC'nin, putatif CSC işaretleyici CD133'ün ifadesine dayanarak hücre sıralama yoluyla ayrışmış GBM tümörlerinden izole edilmesi de önerilmiştir6,7, ancak daha fazla çalışma, CSC fenotipinin bu tür belirteçlerin ifadesiyle kesin olarak ilişkili olmadığını gösterdi8-10, bu strateji için ilk hevesi azaltırken, yeni belirteçler hala test edilmektedir10. KSS'yi tanımlayan doğrulanmış bir işaretleyici kümesinin bugüne kadarki kullanılamaması, bu hücrelerin klinik öncesi çalışmalar için büyük ölçekli amplifikasyonu hedefiyle birlikte, hücre sıralamanın rutin CSC ile zenginleştirilmiş kültürler için pratik olmayan kullanımını işlemez hale getirir. NMGF'de nörosfer olarak büyüme yeteneği ile seçilen GBM hücreleri, sinirsel kök hücre belirteçlerini her zaman ifade eder. Sox2 ve nestin'in nörosfer kültürlerinde her yerde ifade edildiğini, CD133 proteininin ise GBM nörosferlerinin bir alt kümesinde bulunduğunu gözlemledik (yayınlanmamış veriler ve referans11).
Çeşitli laboratuvarlar, büyüme faktörleri 3 ,4,11-14ile desteklenmiş serumsuz ortamda aynı genel enzmatikayrışma ve kültleme yaklaşımını kullanarak glioblastoma tümörlerinden nörosfer kültürlerini takipederken,diğer meslektaşları gbm örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürlerini başarı olmadan büyütme girişimleri bildirmektedir. Burada sunulan yüksek dereceli gliomaların enzmatik ayrışması ve nörosfer kültürü için genel yöntem, yukarıdaki yayınlarda özetlenenlere benzer. Protokolü, 100 GBM'den fazla numuneyi ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak optimize ettik. Burada sunulan protokolü uygulayan taze GBM örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürleri elde etmenin verimliliği% 40'ın üzerindedir, verimlilik verilerini gösteren birkaç raporabenzer3,15, EGF ve bFGF'nin ECMproteini 16ile kaplanmış yüzeylerde monolayer olarak serum içermeyen ortamda sürekli veya aralıklı olarak hücrelerin kültleşmesi gibi alternatif protokollerin araştırılmasına yol açmaktadır. Nörosfer kültürleri hala GBM tümörlerinin moleküler özelliklerini ve tümörijenik potansiyeli korumak için en doğrulanmış ve giderek daha popüler bir yaklaşımdır3,4,11-14, bu nedenle yaklaşımımız önce nörosfer kültürlerini denemektir, hayvan modellerinde kullanılabilecek GBM tümörlerinin temsilini artırmak için uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosferler oluşturamayan GBM hücrelerini kültleme için alternatif yöntemleri birlikte test ederken ( Şekil1). Burada GBM'lerden nörosferleri kültleme protokolü sunuyoruz. Nörosfer oluşturamayan hücreler için, büyüme ortamında basit bir değişiklik gösteriyoruz, çünkü tümörosfer olmayan hücrelerden GBM'ler oluşturan, umut verici sonuçlar veren ve hala kapsamlı doğrulamadan geçen ilk girişim olarak basit bir değişiklik gösteriyoruz.
Protocol
1. Nörosfer Kültürü için Taze Cerrahi Glioblastoma Örneğinden Tek Hücreli Süspansiyon
- Hastaların yazılı onayı ile ve kurumsal yönergelere uygun olarak, yüksek dereceli glioma rezeksiyon ameliyatından hemen sonra hücre kültürü için tümör örnekleri toplayın.
- Histopatoloji ile tümör örneğinin tanısını onaylayın. Numuneyi ameliyattan itibaren 1 saat içinde işlenmek üzere hemen operasyon odasından laminer akış dokusu kültür başlığına taşıyın.
NOT: Uzak bir bölgedeki ameliyatlar için tümör örneğini daha küçük parçalara bölün ve DMEM/F12 içeren bir tüpe yerleştirin (buzda tutun). Tümör ameliyattan birkaç saat sonra işlenebilir. - 200-500 mg doku (optimal) ile başlayarak, neşter bıçağı kullanarak tümör örneğini kıyma yapın ve 10 ml DMEM/ F12 serum içermeyen ortam içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Birkaç kez ters çevirerek karıştırın, tümör parçalarının yerçekimi ile tortulanmasını, ortamın çıkarılmasını ve gerektiğinde tekrarlanmasını bırakın.
- Enzymatic Doku Ayrıştırma Sokunu hazırlayın ve Çözeltiyi Yeni Durdurun.
- Enzymatic Doku Ayrıştırma Çözümü: 5 ml% 0.05 Tripsin-EDTA, 2.5 ml Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) kalsiyum ve magnezyum içermeyen, 2.5 ml Kollajenaz IV stok çözeltisi (kalsiyum ve magnezyumlu HBSS'de 2.000 U/ml).
- Durdurma Çözümü: 5 ml Tripsin inhibitör çözeltisi, 5 ml DMEM/F12, 2 μl 5.000 U/ml DNASE I (HBSS kalsiyum ve magnezyum içermeyen olarak üretilir).
- Ortamı çıkarın ve her 0,5 g doku için 2 ml kullanarak kıyılmış tümör örneğine Enzimatik Doku Ayrıştırma Çözeltisi ekleyin. Ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca doku inkübatörünü inkübte edin.
- 2 ml pipetle tritüre edin ve sindirimi durdurun veya sindirim seviyesine bağlı olarak 15-30 dakikalık başka bir inkübasyon için inkübatöre geri dönün.
- 2 hacim stop solution ekleyerek sindirimi durdurun ve 5 ml serolojik pipet ile mekanik olarak tritüre edin.
- Sindirilmemiş malzemeyi 40 μm hücre süzgeçten filtreleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'daki hücreleri pelet, ardından 10 ml DMEM / F12'de 3x yıkayın.
- Son hücre peletini 5 ml DMEM/F12'de yeniden sür.
- Hücre süspansiyonu yavaşça 5 ml Lenfolit-M ve pelet üzerinde 1,300 x g oda sıcaklığında 20 dakika boyunca katmanlayın.
- Çekirdeklenmiş hücreleri içeren arayüz katmanını 10 ml DMEM/F12 içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da peletin. Yıkamayı DMEM/F12 2 kat daha fazla tekrarlayın.
- Cryopreserve, elde edilen tek hücreleri, Kurtarma Hücresi Dondurma Ortamı'ndaki peletin yeniden canlandırılması, cryovials içine aliquoting, yavaş donma ve sıvı nitrojende depolanması ile daha fazla kullanım için saklayın.
- Kültüre, Büyüme Faktörleri (NMGF) ile desteklenmiş Nörosfer Ortamı'ndaki hücreleri yeniden dürtmek ve standart koşullar altında normal bir T25 doku kültürü şişesinde nispeten düşük yoğunlukta (<1 x10 5 hücre/ml) plaka, % 5 CO2, 37 °C, nemli doku kültürü inkübatörü (Şekil 1A).
- Aşağıdaki tarifi kullanarak NMGF'ye hazırlanma
500 ml DMEM/F12 için Stok çözümü hacim nihai konsantrasyon N2 takviyesi (10x) 5 ml 1x 250 mg/ml BSA stok çözümü 1 ml 0,5 mg/ml 10 mg/ml Gentamisin reaktifi 1,25 ml 25 μg/ml 100x antibiyotik/antimycotic 2,5 ml 0,5x 100 mg/ml bFGF 0,1 ml 20 ng/ml 100 mg/ml EGF 0,1 ml 20 ng/ml
- Aşağıdaki tarifi kullanarak NMGF'ye hazırlanma
- 1-3 hafta boyunca oluşan nörosferleri (Şekil 1B-E) bağlı hücrelerden ve döküntülerden ayırmak için taze şişelere aktarın. Her 3-4 günde bir kısmi medya değişiklikleri gerçekleştirin.
NOT: Yukarıdaki protokol kullanılarak ortotopik ksenograft tümörün ayrıştırılması durumunda 1.11-1.13 arası adımlar atlanabilir.
2. Glioblastoma Nörosfer Kültürü Bakımı ve Aşağı Akış Uygulamaları
-
Ayrışma: Nörosfer kültürlerini izleyin ve her 3-4 günde bir kısmi orta değişiklikler gerçekleştirin. Şişedeki çok hücreli nörosferlerin çoğu çapı 100 μm'ye ulaştığında, tek bir hücre süspansiyonuna ayrışın:
- Nörosferleri içeren ortamı 15 ml'lik bir tüpe aktarın, yerçekimi nörosferleri yaklaşık 5 dakika boyunca tortuya maruzn, ortamı çıkarın ve hücre peletini 10 ml kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden biriktirin.
- Hücreler yerçekimi tarafından çökelti olarak oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
- 7-8 ml DPBS çıkarın, ardından nörosferleri önceden yazılmış bir serolojik pipetle mekanik olarak ayrıştırın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da ayrışmış hücreleri peletle.
- Paslanma: NMGF'de ayrışmış hücreleri (adım 2.1.) yeniden biriktirin ve gerekli şişe sayısına bölün (1:3) ve standart koşullar altında kuluçkaya yatırın. sekonder nörosferler oluşacak ve daha sonra üçüncül kürelerin oluşumu için ayrışmalıdır.
- Uzun süreli kendini yenilemenin değerlendirilmesi: Nörosfer kültürü kültürde en az 2 aya eşdeğer en az 10 pasaj elde edene kadar ayrışma prosedürünü tekrarlayın.
-
Donma: Nörosferleri kriyoprezikasyon yapmak için, nörosferleri ayrıştırmak (adım 2.1.) ve hücre peletini Kurtarma Hücresi Dondurma Ortamı'nda, aliquot'u cryovials'ta, yavaş dondurmada ve sıvı nitrojende saklamak için yeniden depolayın.
- Nörosfer hücrelerini donmuş bir stoktan kültüre etmek için: hücreleri 37 ° C'de çözün ve hemen 10 ml DMEM / F12 içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Tüpü hafifçe karıştırın ve ardından hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Hücre peletini bir kez daha yıkayın ve NMGF'deki hücreleri yeniden biriktirin ve bir T25 doku kültürü şişesine aktarın.
-
İmmün sistemi baskılanmış farede intrakraniyal implant için hücre süspansiyonu:
- Nörosferleri ayrıştırın (adım 2.1.) ve hücre peletini kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden biriktirin. Hemositometre ve trypan mavi dışlama kullanarak uygulanabilir hücreleri sayın.
- İmplant için gereken hücre sayısını hesaplayın, tipik olarak 3 x 105 hücre/fare, istenen hücre sayısını bir şişeye aktarın ve hücreleri 1.000 x g'da peletlayın.
- Mikrosantrifüj tüpüne hafifçe dokunarak hücre peletini implanta (5 μl/fare) uygun bir hacimde yeniden kullanın. Hücre süspansiyonu buza yerleştirin ve 2 saat içinde kullanın.
3. Tümörojenik Glioblastoma Hücrelerinin Kült Haline Getirmede Alternatif Protokol (nörosfer kültürünün başarısız olduğu durumlar için)
- NMGF ortamını fetal sığır serumu ile %2 FBS/NMGF son konsantrasyonuna tamamlar.
- NMGF kültüründeki hücrelerden başlayarak:NMGF şişesinden (Şekil 1F) uygulanabilir hücreleri hasat edin, % 2 FBS / NMGF'de yeniden biriktirin ve normal bir T25 doku kültürü şişesinde nispeten düşük yoğunlukta (<1 x10 5 hücre / ml) plaka, ve standart koşullar altında kültür, 5% CO2, 37 ° C, nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörü (Şekil 1G).
- Donmuş hiç kültüre sahip olmayan hücrelerle başlayarak (adım 1.14.): Hücreleri çözün, serumsuz ortamda yıkayın ve % 2 FBS / NMGF'de plaka yıkayın ve adım 3.2'de açıklandığı gibi kültür. Uygulanabilir hücrelerin %2 FBS/NMGF'ye aktarılmasına kadar 3 gün boyunca NMGF'de kültleme, farklılaştırılmış hücreleri önceden seçmeye bir alternatiftir.
4. İmmünohistokinetri ile Nörosferlerin Morfolojik ve Moleküler Analizi
- Çoğu yüzen çok hücreli sferoid 100 μm çapa ulaşana kadar nörosferleri kültüre edin.
- Kültür şişelerini inkübatörden çıkarın ve hemen nörosferleri peletleyin, ortamı çıkarın ve peleni bozmadan 10 ml DPBS ekleyin. DPBS'yi çıkarın, %10 nötr tamponlu formalin içinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır.
- Küreselleri pelet, % 30 etanol resuspend ve 30-45 dakika kuluçka.
- % 30 etanolünü% 50 etanol ile değiştirin, 15 dakika kuluçkaya yatır ve taze% 50 etanol ile değiştirin, 30 dakika daha kuluçkaya yatır.
- %70 etanol ile tekrarlayın (adım 4.4.).
- Her biri 10-20 dk iki değişiklik% 95 etanol ile değiştirin ve küreseller parlak beyaz ve yoğunlaşına kadar mutlak etanol ile tekrarlayın.
- Lens kağıdından küçük bir filtre kağıdı konisi yapın ve bir beherde küçük bir huni içine yerleştirin. Lens kağıdını mutlak alkolle ıslatın.
- Peletin taze% 100 etanol ile hafifçe gevşetin, fazla etanol dökün ve küreselleri lens kağıt koniden dökün, koninin ucuna gittiklerinden emin olun. Tüpü ek mutlak etanol ile durulayın ve kalan küreselleri lens kağıdı koniden dökün.
- Kağıt konisini huniden çıkarın ve küreselleri koninin altına dikkatlice hareket ettirelim. Kağıdı bir kareye katlayın ve küresellerin mümkün olduğunca güvenli bir şekilde kapalı olduğundan emin olun.
- Paketlenmiş nörosferleri bir kasete aktarın ve otomatik bir doku işlemcisine aktarın.
- Otomatik doku işlemcisini aşağıdaki gibi programlayın: mutlak etanol, 10 dk, ksilen, 15 dk (2x), parafin, 10 dk (4x).
- Kaseti işlemciden çıkarın ve bir parafin gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Tüm yüzeyin parçalardan, tozdan veya diğer döküntülerden arındırığından emin olun ve tüm parafinleri ısıtan kuyulardan sifonlayın. Sıcak temiz parafinsiz kümesler ve ısıtılmış bir baz kalıba az miktarda parafin ekleyin.
- Kaseti açın, paketi çıkarın ve gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Sferoidler görünene kadar kağıt konisini dikkatlice açın. Önceden ısıtılan önps ile malzemenin mümkün olduğunca çoğunu toplayın ve baz kalıptaki sıvı parafinlere aktarın.
- Mümkün olduğunca çok sferoid almak için gerektiği gibi tekrarlayın. Doku kağıdını, bloğa herhangi bir kağıt almadan kalan küreselleri toplamak için etanol ile silinmiş önceden ısıtilmiş temiz bir jiletle hafifçe kazıyın.
- Sıcak kümelerle herhangi bir küresel kümeyi dikkatlice ayırın. Küreselleri köşelerden tekdüze bir merkezi katmana taşıyın. Küreselleri yerinde sabitlemek için temel kalıbı soğutma alanına taşıyın, kaseti ekleyin, parafinle yavaşça doldurun ve iyice soğutun.
- Nörosfer parafin bloğu normal kesit ve immünostokimya için kullanılabilir.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü, onaylanmış hasta onayı ile ve kurumsal yönergeler altında 125 taze cerrahi glioblastoma örneği (Şekil 1), 88 yeni tanı konmuş ve 37 tekrarlayan tümör (Tablo 2) ile ayrıştırmak ve kültüre etmek için uyguladık. Uzun vadeli nörosfer kültürleri kurma protokolünün verimliliği % 41,6 ve yeni teşhis edilen tümörler ve tekrarlayan tümörler için benzerdi (Tablo 2). Bazı GBM örnekleri için, nörosferler ilk birkaç gün içinde oluşur (Şekil 1B ve 1C), diğerleri için daha uzun kültleme süresi gereklidir (Şekil 1D ve 1E).
Nörosfer oluşumunun verimliliği, her ikisi de nörosfer kültürü kazandıran Protokol 1 ve 2'ye göre işlenen yüksek hücre yoğunluğuna (GBM1) ve tekrarlayan ve nekrotik tümörden (GBM2) elde edilen sonuçlarla örneklendir edildiği gibi, sadece dokudaki nekroz seviyesine bağlı değildi (Şekil 2).
İmmün olarak bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde her nörosfer kültürünün tümörojenik potansiyelinin test edilmesi, CSC'lerin zenginleştirilmesi için bu yaklaşımın çok önemli bir doğrulamasıdır. Daha önce açıklanan18, GBM1 ve GBM2 nörosferlerine benzer bir protokol kullanılarak, kurumsal ve IACUC hayvan bakım yönergeleri altında, bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine implante edilmiştir. Ksenograft tümörleri, beyin parankim ve nekroza invazyon gibi GBM'lerin morfolojik özelliklerini sunar (Şekil 2).
GBM3 ayrıştı (Şekil 1A) ve nörosfer ortamında kültürlendi (Şekil 1D ve 1E) ve% 2 FBS / NMGF (Şekil 1D, 1G ve 1H). %2 FBS/NMGF'de kültürlenen monolayer hücreler ve NMGF'de kültürlenen nörosfer hücreleri ayrıştırıldı ve Şekil 2'dekiyleaynı prosedür kullanılarak çıplak fareye aynı sayıda hücre yerleştirildi. İki preimplant kültür yöntemi arasında sağkalım, tümör büyüme dinamikleri veya morfolojide farklılık gözlenmedi (Şekil 3A-C). Tümör büyüme özellikleri test edilen en son pasaj, nörosferler için P20 ve% 2 FBS / NMGF için P10'a kadar değişmez. Sox2 de dahil olmak üzere nöral kök hücre belirteçleri% 10 FBS 3,4,11'de kültürlenen çoğu birincil GBM hücresinde küçültülürken, % 2 FBS ile desteklenmiş NMGF, Sox2 ekspresyonunun tutulmasına izin verir (Şekil 3D).
Nörosferler Protokol 4'e göre işlendi ve H&E (Şekil 4A), anti-Sox2 antikoru, nükleer lokalizasyon (Şekil 4B) ve EGFR antikoru, hücre zarı lokalizasyonu (Şekil 4C)ile etiketlendi. Bu protokol nestin, GFAP ve çoğalma işareti Ki6711ifadesinde uyaranlara bağlı değişikliklere erişmek için uygulanmıştır.
Tablo 2. GBM'lerden uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosfer kültürlerini türetmenin verimliliği.
| patoloji | n | Uzun süreli kendini yenileyen nörosferler sağlayan örneklerin yüzdesi (n) |
| Glioblastoma - tedavi edilmemiş, ilk ameliyat | 88 | 42.0% (37) |
| Glioblastoma - tekrarlayan | 37 | 40.5% (15) |
| toplam | 125 | 41.6% (52) |
Şekil 1. Taze glioblastoma cerrahi örneklerinden hücre kültürü. Taze tümörler enzmatik olarak tek hücreye ayrışır. Yoğunluk ayırma ortamından çekirdeklenmiş hücre arayüzü daha sonra NMGF ile kaplanır. Ayrışmış nörosferler NMGF'de kaplanır ve genellikle kaplamadan 1 gün sonra ölü hücreler, döküntüler, bağlı tek hücreler ve süspansiyondaki hücrelerin bölünmesi (A). Nörosfer oluşumu bazı vakalar için daha hızlıdır (B,C) ve diğerleri için daha yavaştır (D,E). Tüm nörosferler en az 10 pasaj için ayrıştırilir ve yeniden tabaklanır, % 41,6 GBM'ler uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosferler verir. Nörosfer (F) olarak büyümeyen canlı GBM ayrışmış hücreler alternatif kültür koşullarına aktarılabilir, örneğin% 2 FBS / NMGF (G, H). Çubuk (A), 100 μm, tüm görüntüler için geçerlidir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 2. Nörosfer üretimi ve GBM tümörlerinden ortotopik fare ksinograftları. Protokol 1 ve 2'ye göre yüksek hücre yoğunluğu (GBM1) ve yüksek nekrotik içeriğe (GBM2) sahip bir tümör örneği ayrıştırıldı ve nörosferler 1 ve 2 nolu protokollere göre 10 pasaj için kültürlendi. İmmün sistemi baskılanmış farelere 3 x 105 ayrışmış nörosfer hücresi yerleştirildi ve moribund olduğunda kurban edildi. Fare beyinleri, insan belirteçlerinin, insan mitokondrilerinin (hMit) veya büyük histocompatibility sınıfı I alt birasının (MHC-I) H&E lekeleme ve immünofizyokimya tespiti için sabit ve parafin gömülü olarak sabitlendi. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 3. NMGF'de nörosfer veya %2 FBS/NMGF'de monolayer olarak kültürlenen GBM3 hücreleri ile intrakranially implante edilen farelerde benzer tümör büyümesi. (A) NMGF'de nörosferler veya %2 FBS/NMGF'de monolayer olarak kültürlenmiş GBM3 için Kaplan-Meier sağkalım eğrileri (her iki geçiş <10) sağkalımda hiçbir fark göstermez (n=10, p=0.7174, log-rank testi). (B) Canlı biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile izlenen tümör büyümesi, iki grup arasındaki tümör büyüme dinamiklerinde anlamlı bir fark göstermez. (C) Tümör morfolojisi 4 GBM3 ksinograft, 2 kültür NMGF ve 2 kültürlü 2% FBS / NMGF için ayırt edilemez. Şekil 2için açıklandığı gibi MHC-I lekesi . Ölçek, 600 μm. (D) Kök hücre üreticisi Sox2 ekspresyonunu gösteren batı lekesi, ksinograft tümörlerini(A-C)başlatmak için kullanılan% 2 FBS / NMGF kültürlerinde tutulur. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 4. İmmünohistokmiya ile nörosfer bölümlerinde protein ekspresyonunun analizi. Nörosfer kültürleri Prosedür 4'te açıklandığı gibi formalin sabit ve parafin gömülü ve H&E (A), anti-Sox2 antikor (B) ve anti-EGFR antikor (C) ile lekelenmiştir. DAB substratı görselleştirmek için kullanıldı (B,C). Bar, 20 μm. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Discussion
Uygun enzymatik tümör hücresi ayrışması bu protokolde kritik bir adımdır. Doku, 37 °C'de hücre ayrıştırma çözeltisinde inkübasyondan önce, en az 30 dakika boyunca, dokunun mekanik olarak üçe alınması ve ayrışma uzantısının doğrulanması gerektiğinde iyice kıyılmalıdır. Doku uyum derecesine bağlı olarak, kuluçka, tek hücrelere ayrışma işlemini tamamlamak için gerektiğinde 15-30 dakika daha uzatılabilir. Hücre canlılığının azalması nedeniyle 1 saatten uzun süre ayrışma çözümünde inkübasyon önerilmez. Optimal başlangıç dokusu miktarı 200-500 mg olmasına rağmen, bu protokol 50 mg kadar az tümör dokusundan başarılı nörosfer kültürlerine yol açmıştır.
Serumsuz NMGF seçici bir ortamdır ve tümörün büyük kısmını oluşturan neoplastik hücrelerin bir yüzdesi ve konak hücreler hayatta kalamazken, diğerleri kaplamadan sonra tedavi edilen şişeye bağlanacaktır. 1-3 hafta boyunca oluşacak nörosferlerin (Şekil 1B-E) farklılaşmış tümör hücrelerinden ve döküntülerinden ayrılmak için taze şişelere aktarılması kritik öneme sahiptir.
GBM hücreleri enzimmatik olarak ayrışır ve hiçbir zaman kültüre edilmez (adım 1.10), nörosfer kültürünün başarısız olması durumunda, alternatif medyada kültüre hücrelerin yedek kaynağı olarak kriyoprezer olarak saklanabilir. Bu tür donmuş stoklardan nörosfer kültürlerinin yanı sıra% 2 FBS / NMGF'de büyüyen monolayer hücrelerden başarıyla elde ettik.
Kavramsal olarak, "kanser kök hücresi" devam eden bir çalışmadır ve bu gelişmekte olan alan ek açıklamalardan yararlanacaktır, çünkü klinik etkileri, özellikle tümör heterojenliği, plastisite ve tedaviye direnç oluşturmada önemli ölçüde19,20. Nörosfer kültürleri, hastaya özgü GBM hayvan modelleri üretmek için hayati öneme sahip olmasının yanı sıra, büyüme faktörlerine yanıt olarak hücre sinyalizasyonunda değişiklik ve gen ekspresyonu, hipoksi ve farmakolojik ajanlar11,21gibi in vitro çalışmalar için de değerlidir. Tüm küreyi etiketleme ve görüntülemenin daha yaygın yöntemi ile ilgili üstün hücre altı lokalizasyonu nedeniyle, immünofizyömi11tarafından protein ekspresyasyonu ve çeviri sonrası modifikasyonları incelemek için 3D mimariyi koruyarak formalin sabit ve parafin gömülü nörosferlerin kesitlerini kullanmayı tercih ettik.
Yetişkin memeli beyninden elde edilen nörosferlerdeki tüm hücrelerin kök hücre olmadığı gösterilmiştir22. Benzer şekilde, GBM tümörlerinden kültürlenen nörosferler, daha farklı kanser progenitör hücrelerinin varlığı ve yüksek hücre yoğunluklarında ortaya çıktığı bilinen kendi kendine toplama nedeniyle klonal değildir23Bu yöntemin bazıları tarafından bir sınırlaması olarak kabul edilir. Nörosferler22olarak geçici olarak büyüyebilen sadece progenitörlerin aksine, uzun süreli kendi kendini yenileyen kök hücreler için zenginleşmeyi tercih etmek için, birincil nörosferler ikincil nörosfer oluşumu için ayrışır ve kök hücrelerde zenginleştirilmiş bir popülasyonun göstergesi olan sürekli kültürde kabaca 2 aya eşdeğer en az 10 pasaj için daha fazla geçiş yapılır22. Deneyimlerimize göre, bu işareti elde eden GBM nörosfer kültürleri süresiz olarak nörosfer olarak genişletilmeye devam edebilir. Tümör derecesi önemlidir, çünkü sırasıyla GBM'lerden ve anaplastik astrositomalardan, WHO sınıf IV ve III'ten başarılı kültürler elde ettik, ancak alt dereceli gliomalardan elde etmedik.
Glioblastoma hücrelerini kültlemenin en yaygın yöntemi, % 10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında, orijinal tümörlerden önemli genomik ve fenotipik ayrışmaya yol açar 4. Öte yandan, nörosfer kültürleri kanser kök hücre fenotipi4sunan kararlı ve uzun vadeli bir hücre kaynağıdır. Nörosfer yöntemi, bu yöntemin ana zayıflığını temsil eden tüm yüksek dereceli astrositom örnekleri için başarılı olmamasına rağmen, ortotopik fare ksinograft modelleri için uzun vadeli kültürlerde CSC'nin zenginleştirilmesi için giderek daha popüler hale gelmiştir. Ebeveyn tümörlerinin moleküler özelliklerinin nörosfer oluşumunu nasıl etkileyebileceğini anlamaya yönelik çalışmalar devam etmektedir. "Omics" bilgilerinin erişilebilirliği ve potansiyel hedefli tedavilerin sayısının artmasıyla beslenen kişiselleştirilmiş tıp çağına ilerlerken, hastaya özgü GBM modellerine sahip olmanın önemli avantajları göz önüne alındığında, kültür yüksek dereceli gliomalara pratik alternatif yöntemlerin araştırılması ve ardından kapsamlı doğrulama verilir.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Hermelin Beyin Tümörü Merkezi, Henry Ford Hastanesi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
- Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
- Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
- Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
- deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
- Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
- Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
- Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
- Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
