Summary
Протокол для распространения диссоциированных высококачественных глиомы хирургических образцов в сыворотке свободной нейросферы среды для выбора для клеток с фенотипом стволовых клеток рака. Для образцов, которые не растут как нейросферы, предлагается альтернативный протокол. Описана парафиновая техника встраивания для поддержания 3D нейросферной архитектуры иммуноцитохимии.
Abstract
Глиобластомы, наиболее распространенная и агрессивная форма астроцитомы, огнеупорны к терапии и молекулярно неоднородны. Способность создавать клеточные культуры, которые сохраняют геномный профиль родительских опухолей, для использования в конкретных моделях in vitro и in vivo пациента, имеет потенциал, чтобы революционизировать доклинческое развитие новых методов лечения глиобластомы с учетом молекулярных характеристик каждой опухоли.
Начиная со свежих высококачественных опухолей астроцитомы, разобщенных на одиночные клетки, мы используем нейросферный анализ в качестве метода обогащения клеток, представляя фенотип раковых стволовых клеток, включая экспрессию маркеров нервных стволовых клеток, долгосрочное самообувечивание in vitroи способность формировать ортопедические опухоли ксенотрансплантата. Этот метод был ранее предложен, и в настоящее время используется несколькими следователями. Основываясь на нашем опыте диссоциации и культивирования 125 образцов глиобластомы, мы пришли к подробному протоколу, который мы представляем здесь, подходящему для рутинного культивирования нейросферы высокосортных астроцитом и крупномасштабного расширения опухолевых клеток для доклиничных исследований. Мы сообщаем об эффективности успешных долгосрочных культур, использующих этот протокол, и предлагаем доступные альтернативы для культивирования диссоциированных клеток глиобластомы, которые не могут расти как нейросферы. Мы также подробно описываем протокол сохранения 3D-архитектуры нейросферы для иммуногистохимии. Клеточные культуры, обогащенные ЦСЗ, способные генерировать ортопедические модели ксенотрансплантата, которые сохраняют молекулярные подписи и неоднородность ГБМ, становятся все более популярными для изучения биологии ГБМ и для усовершенствования дизайна доклинкативного тестирования потенциальных методов лечения.
Introduction
Глиобластома (ГБМ), астроцитома IV степени ВОЗ, является наиболее распространенной и агрессивной первичной опухолью мозга. Разнообразные фенотипы развития принимаются опухолевыми клетками ГБМ, включая клетки, экспонирующие характеристики «раковых стволовых клеток» (CSC), такие как экспрессия маркеров нервной стволовой клетки (NSC), долгосрочное самообувещение и потенциал, чтобы привести к более дифференцированным клеткам, выражаюющим астроцитные маркеры и образующим основнуючасть опухоли 1-3. Хотя еще необходимо разъяснение в отношении молекулярной идентичности CSC и клинических последствий, основное внимание в настоящее время работы уделяется оперативному определению CSC: долгосрочное самообувещение in vitro и способность дифференцировать и воспроизвести исходную опухоль при ортопедической имплантации у грызунов с ослабленным иммунитетом.
Клетки глиобластомы были культурны в течение десятилетий в традиционной среде, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и несколько высоких проходов коммерчески доступны сыворотки культурных линий клеток GBM являются опухолевые у ослабленных иммунитетом грызунов, но есть значительное геномное и молекулярное расхождение отпервоначальной опухоли 4, ограничивая их использование в качестве клинически значимых моделей. Совсем недавно, клетки со стеблем / прародителем фенотип реагировать на EGF и bFGF были определены в GBMs2. Впоследствии, диссоциированные образцы опухоли GBM были обучены в безотхвочнойсреде 3, первоначально сформулированной для отбора и расширения нервных стволовых клеток из мозга взрослогомлекопитающего 5. Эти культурные условия препятствуют росту большинства ненеопластических и более дифференцированных популяций опухолевых клеток, в то время как в пользу роста стволовых клеток и клеток-предшественников, как плавающие многоклеточные сфероиды,или нейросферы 3, имитируя поведение взрослых млекопитающих нервных стволовыхклеток 5. Всеобъемлющее бок о бок сравнение первичных клеток ГБМ, культурных либо в нейросферной среде, дополненной факторами роста (NMGF), либо в традиционной среде роста, дополненной 10% FBS, выяснилось, что нейросферы ГБМ были опухолевые, представлены многолинейные дифференциации потенциал, и сохранили генотип оригинальной опухоли, в отличие от 10% FBS культур, которые не были опухолевые на низких проходах и значительно отличается от первоначальных опухолей в концепроходов 4.
Изоляция CSC от диссоциированных опухолей GBM путем сортировки клеток на основе выражения мяукотного маркера CSC CD133 такжебыла предложена 6,7 , нодальнейшаяработа показала, что фенотип CSC не окончательно связан свыражением таких маркеров 8-10, уменьшая первоначальный энтузиазм к этой стратегии, в то время как новые маркеры все еще тестируются10. Отсутствие на сегодняшний день проверенного набора маркеров, определяющих CSC, наряду с целью крупномасштабного усиления этих клеток для доклиновой исследования, делает использование сортировки клеток нецелесообразным для обычных культур, обогащенных CSC. КЛЕТКИ GBM выбранные способностью вырасти как нейросферы в NMGF неизменно выражают нервные маркеры стволовой клетки. Мы заметили, что Sox2 и nestin повсеместно выражены в нейросферных культурах, в то время как белок CD133 присутствует в подмножестве нейросфер GBM (неопубликованные данные иссылка 11).
Несколько лабораторий проводят нейросферных культур из опухолей глиобластомы, используя тот же общий подход энзиматической диссоциации и культивирования в сыворотке свободной среде дополненыфакторами роста 3,4,11-14, в то время как другие коллеги сообщили о попытках расти долгосрочные культуры нейросферы из образцов GBM безуспешно. Общий метод энзиматической диссоциации и нейросферной культуры глиом высокого класса, представленный здесь, аналогичен тому, что было изложено в вышеуказанных публикациях. Мы оптимизировали протокол на основе нашего опыта разобщения и культивирования более 100 образцов GBM. Эффективность получения долгосрочных нейросферных культур из свежих образцов GBM, применяющих представленный здесь протокол, составляет более 40%, что похоже на несколько отчетов, показывающихданные об эффективности 3,15,что приводит к исследованию альтернативных протоколов, таких как культивирование клеток постоянно или с перерывами в безотхвочной среде в присутствии EGF и bFGF в качестве монослой на поверхностях, покрытых ECM-белком16,17. Нейросферные культуры по-прежнему являются наиболее проверенным и все более популярным подходом к сохранению ГБМ опухолевых молекулярных характеристик и опухолевыхпотенциал 3,4,11-14, таким образом, наш подход заключается в попытке нейросферных культур во-первых, в то время как сопутствующие тестирования альтернативных методов для культивирования GBM клеток, которые не в состоянии сформировать долгосрочные самообновляющиеся нейросферы (Рисунок 1), чтобы увеличить представление опухолей GBM, которые могут быть использованы в животных моделях. Здесь мы представляем протокол для культивирования нейросфер от ГБМ. Для клеток, которые не образуют нейросферы, мы показываем простую модификацию в среде роста, как первая попытка культуры опухолевых клеток из ненейросферы формирования ГБМ, с многообещающими результатами и до сих пор проходит обширную проверку.
Protocol
1. Одноклеточная подвеска от свежей хирургической глиобластомы Specimen для нейросферной культуры
- С письменного согласия пациентов и в соответствии с институциональными руководящими принципами, собирать образцы опухоли для клеточной культуры сразу после операции по ресекции высокого класса глиомы.
- Подтвердите диагноз образца опухоли гистопатологией. Немедленно транспортируют образец из комнаты операции в ламинарный поток ткани культуры капота, для обработки в течение 1 часа после операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для операций в отдаленном месте, разрезать образец опухоли на более мелкие фрагменты и поместить в трубку, содержащую DMEM/F12 (держать на льду). Опухоль может быть обработана через несколько часов после операции. - Начиная с 200-500 мг ткани (оптимально), фарш образца опухоли с помощью скальпеля лезвие, и передачи в 15 мл трубки, содержащей 10 мл DMEM/F12 сыворотки свободной среде. Смешайте путем инвертирования несколько раз, пусть опухоли части осадка по гравитации, удалить средний, и повторить по мере необходимости.
- Подготовье решение для диссоциации энзиматических тканей и остановите решение свежим.
- Решение для диссоциации энзиматической ткани: 5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА, 2,5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) без кальция и магния, 2,5 мл раствора коллагеназы IV (2000 U/ml в HBSS с кальцием и магнием).
- Стоп-решение: 5 мл раствора ингибитора трипсина, 5 мл DMEM/F12, 2 мл 5000 U/ml DNAse I (сделано в HBSS без кальция и магния).
- Удалить средний и добавить энзиматические ткани диссоциации решение фарш опухоли образца, используя 2 мл на каждые 0,5 г ткани. Аккуратно перемешать путем инвертирования.
- Инкубировать ткани в растворе при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры тканей под вращением в течение 30 мин.
- Тритурат с 2 мл пипетки и остановить пищеварение или вернуться в инкубатор еще 15-30 мин инкубации в зависимости от уровня пищеварения.
- Остановите пищеварение, добавив 2 тома Stop Solution и тритурата механически с 5 мл серологического пипетки.
- Отфильтруй непереваренный материал через 40 мкм клеточного ситечко. Пеллет клетки на 800 х г в течение 5 мин в комнате темп, а затем мыть 3x в 10 мл DMEM/F12.
- Повторное производство последней клеточной гранулы в 5 мл DMEM/F12.
- Медленно слой клеточной суспензии более 5 мл лимфолита-М и гранулы на 1300 х г в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Перенесите слой интерфейса, содержащий нуклеированные ячейки, в трубку 15 мл, содержащую 10 мл DMEM/F12.
- Пеллет клетки при температуре 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите стирку с DMEM/F12 2x больше.
- Cryopreserve в результате одиночных клеток для дальнейшего использования путем повторного использования гранулы в восстановление клеток замораживания среднего, aliquoting в криовиалы, медленное замораживание, и хранение в жидком азоте.
- Для культуры, повторного перерасхода клеток в нейросфере Средний дополнен факторы роста (NMGF), и пластины при относительно низкой плотности (<1 х10 5 клеток / мл) в очередной T25 ткани культуры колбы в стандартных условиях, 5% CO2, 37 КК, увлажненной культуры ткани инкубатора (Рисунок 1A).
- Подготовка NMGF по следующему рецепту
За 500 мл DMEM/F12 Решение по акциям том окончательная концентрация N2 дополнение (10x) 5 мл 1x 250 мг/мл раствора бульона BSA 1 мл 0,5 мг/мл 10 мг/мл реагента гентамицина 1,25 мл 25 мкг/мл 100x антибиотик/антимикотический 2,5 мл 0,5x 100 мг/мл bFGF 0,1 мл 20 нг/мл 100 мг/мл EGF 0,1 мл 20 нг/мл
- Подготовка NMGF по следующему рецепту
- Передача нейросфер, которые образуются в течение 1-3 недель(рисунки 1B-E) на свежие колбы, чтобы отделить от прикрепленных клеток и мусора. Выполняем частичные изменения мультимедиа каждые 3-4 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если диссоциация ортопедической опухоли ксенотрансплантата с помощью протокола выше, шаги 1.11-1.13 могут быть опущены.
2. Глиобластома Нейросфера Культура Поддержание и вниз по течению приложений
-
Диссоциация: Мониторинг нейросферных культур и выполнять частичные изменения среды каждые 3-4 дней. Когда большинство многоклеточных нейросфер в колбе достигают 100 мкм в диаметре, отмежеваться в одноклеточную подвеску:
- Передача среды, содержащей нейросферы в 15 мл трубки, гравитационные осадки нейросферы в течение 5 мин, удалить средний и повторно использовать клеточные гранулы в 10 мл кальция и магния, свободной DPBS.
- Смешайте и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре, так как клетки отложения по гравитации.
- Удалить 7-8 мл DPBS затем отмежевать нейросферы механически с prewetted серологических пипетки.
- Пеллет диссоциированных клеток при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Пропуск :Повторное разделение диссоциированных клеток (шаг 2.1.) в NMGF и разделить на необходимое количество колб (1:3), и инкубировать при стандартных условиях. Вторичные нейросферы будут формироваться, и должны быть впоследствии разобщены для формирования высших сфер.
- Оценка долгосрочного самообнаживания: Повторите процедуру диссоциации до тех пор, пока нейросферная культура не достигнет по крайней мере 10 проходов, что эквивалентно минимум 2 месяцам в культуре.
-
Замораживание: Криопресервировать нейросферы, разобщить нейросферы (шаг 2.1.) и повторно использовать клеточные гранулы в восстановление клеток замораживание среднего, aliquot в криовиалы, медленно заморозить, и хранить в жидком азоте.
- Для культуры нейросферных клеток из замороженного бульона: разморозить клетки при 37 градусов по Цельсию и немедленно перенести в 15 мл трубки, содержащей 10 мл DMEM/F12. Смешайте трубку осторожно, а затем спина клетки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Вымойте гранулы клетки еще раз и повторно использовать клетки в NMGF и перейти к колбе культуры ткани T25.
-
Клеточная подвеска для внутричерепного имплантата в иммунокомпромиссной мыши:
- Разобщить нейросферы (шаг 2.1.) и повторно использовать клеточные гранулы в кальций- и магний свободных DPBS. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра и трипана синего исключения.
- Рассчитайте количество клеток, необходимых для имплантации, как правило, 3 х10 5 клеток / мышь, передать нужное количество клеток во флакон, и гранулы клеток на 1000 х г.
- Повторное использование клеточных гранул в объеме, соответствующем имплантату (5 мкл/мышь), осторожно нажав на трубку микроцентрифуга. Поместите подвеску клетки на лед и используйте в течение 2 часов.
3. Альтернативный протокол для культивирования опухолевых клеток глиобластомы (для случаев, когда нейросферная культура терпит неудачу)
- Дополнить NMGF среды с фетальной сыворотки крупного рогатого скота до конечной концентрации 2% FBS / NMGF.
- Начиная с клеток в культуре NMGF: Урожай жизнеспособных клеток из колбы NMGF(рисунок 1F), перерасход в 2% FBS/NMGF и пластины при относительно низкой плотности (<1х 10 5 клеток / мл) в обычной Т25 ткани культуры колбы, и культуры в стандартных условиях, 5% CO2, 37 C, увлажненной культуры ткани инкубатора (Рисунок 1G).
- Начиная с замороженных никогда не культурных клеток (шаг 1.14.): Оттепель клетки, мыть в сыворотке свободной среде и пластины в 2% FBS / NMGF и культуры, как описано в шаге 3.2. Культивирование в NMGF в течение 3 дней до передачи жизнеспособных клеток на 2% FBS/NMGF является альтернативой предварительному выбору продифференцированных клеток.
4. Морфологический и молекулярный анализ нейросфер иммуногистохимией
- Культура нейросферы до тех пор, пока большинство плавающих многоклеточных сфероидов достичь 100 мкм в диаметре.
- Удалить культуры колбы из инкубатора и сразу же гранулы нейросферы, удалить средний и добавить 10 мл DPBS, не нарушая гранулы. Удалить DPBS, повторно в 10% нейтральный буфер буферный формалин и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Пеллеты сфероиды, повторно в 30% этанола и инкубации в течение 30-45 мин.
- Заменить 30% этанола на 50% этанола, инкубировать в течение 15 мин и заменить свежим 50% этанола, инкубировать еще 30 мин.
- Повторите (шаг 4.4.) с 70% этанола.
- Замените 95% этанола два изменения 10-20 мин каждый, и повторить с абсолютным этанолом, пока сфероиды ярко-белый и конденсированных.
- Сделайте небольшой конус бумаги фильтра из бумаги объектива и поместите его в небольшую воронку в стакане. Влажная бумага объектива с абсолютным алкоголем.
- Слегка расслабьте гранулы свежим 100% этанолом, вылейте излишки этанола и вылейте сфероиды через конус бумаги объектива, убедившись, что они идут к кончику конуса. Промыть трубку с дополнительным абсолютным этанолом и залить все оставшиеся сфероиды через конус бумаги объектива.
- Снимите бумажный конус с воронки и осторожно переместите сфероиды в нижней части конуса. Сложите бумагу в квадрат и убедитесь, что сфероиды как можно более надежно закрыты.
- Перенесите упакованные нейросферы на кассету и перенесите в автоматический процессор ткани.
- Программа автоматического процессора ткани следующим образом: абсолютный этанол, 10 мин, ксилен, 15 мин (2x), парафин, 10 мин (4x).
- Удалите кассету из процессора и поместите ее на нагретую часть системы встраивания парафина. Убедитесь, что вся поверхность свободна от фрагментов, пыли или других обломков и выкачать все парафин из типсов потепления скважин. Теплый чистый парафин свободных типсов и добавить небольшое количество парафина в разогретой форме базы.
- Откройте кассету, удалите пакет и поместите его на нагретую часть системы встраивания. Тщательно откройте бумажный конус до тех пор, пока не будут видны сфероиды. Соберите как можно больше материала с помощью предварительно разоненных типсов и перенесите на жидкий парафин в базовой форме.
- Повторите, как требуется, чтобы получить как можно больше сфероидов, как это возможно. Аккуратно соскребать бумагу с довоенной чистой лезвие бритвы, которая была вытерта этанолом для сбора любых остаточных сфероидов, не получая бумагу в блок.
- Аккуратно разбейте любые сфероидные комки с теплыми типсами. Перемести сфероиды из углов в единый центральный слой. Переместите базовую форму в область охлаждения, чтобы обеспечить сфероиды на месте, добавить кассету, заполнить медленно с парафином, и охладить тщательно.
- Нейросферный парафиновый блок может быть использован для нормального сеяния и иммуногистохимии.
Representative Results
Мы применили описанный выше протокол для разобщения и культуры 125 свежих хирургических образцов глиобластомы(рисунок 1), 88 вновь диагностированных и 37 рецидивирующих опухолей ( Таблица 2 ), сутвержденным согласиемпациента и в соответствии с институциональными руководящими принципами. Эффективность протокола для установления долгосрочных нейросферных культур составила 41,6%, и аналогична для вновь диагностированных опухолей и рецидивирующих опухолей(таблица 2). Для некоторых образцов ГБМ, нейросферы образуются в первые несколько дней (Цифры 1B и 1C), в то время как для других требуется больше времени культивирования(рисунки 1D и 1E).
Эффективность формирования нейросферы не зависела исключительно от уровня некроза в тканях, о чем свидетельствуют результаты недавно диагностированной опухоли с высокой плотностью клеток (GBM1) и рецидивирующей и некротической опухоли (GBM2), обработанной в соответствии с Протоколами 1 и 2, как уступая нейросферных культур (Рисунок 2).
Тестирование опухолевых потенциал каждой нейросферной культуры у мышей с ослабленным иммунитетом является важнейшей проверкой этого подхода для обогащения КСК. Использование протокола,аналогичного ранее описанным 18нейросферам GBM1 и GBM2, было имплантировано в мозг мышей с ослабленным иммунитетом в соответствии с институциональными и руководящими принципами IACUC по уходу за животными. Опухоли ксенотрансплантата представляют морфологические характеристики ГБМ, такие как вторжение в паренхиму мозга и некроз(рисунок 2).
GBM3 был разобщен(рисунок 1A) и культурировался в нейросфернойсреде (рисунки 1D и 1E), и в 2% FBS/NMGF(цифры 1D, 1G и 1H). Монослойные клетки, обученные в 2% FBS/NMGF и нейросферных клетках, культурных в NMGF, были разобщены, и такое же количество клеток было имплантировано в обнаженную мышь, используя ту же процедуру, что и на рисунке 2. Между двумя методами преимплантной культуры (рисунки3A-C)не наблюдалось различий в выживаемости, динамике роста опухоли или морфологии. Характеристики роста опухоли не меняются до последнего прохода испытания, P20 для нейросфер, и P10 для 2% FBS / NMGF. В то время как маркеры нервных стволовых клеток, в том числе Sox2, регулируются в большинстве первичных клеток GBM, культурных в 10% FBS 3,4,11, NMGF дополнен 2% FBS позволяет сохранить выражение Sox2 (Рисунок 3D).
Нейросферы были обработаны в соответствии с Протоколом 4, и помечены СЗЕ (Рисунок 4A), анти-Sox2 антитела, показывающие ядерной локализации (Рисунок 4B), и EGFR антитела, локализация клеточных мембран (Рисунок 4C). Этот протокол был применен для доступа стимулов зависимых изменений в выражении nestin, GFAP, и маркер распространения Ki6711.
Таблица 2. Эффективность получения долгосрочных самообновяющихся нейросферных культур от ГБМ.
| патология | н | Процент образцов, дающих долгосрочные самообновяющиеся нейросферы (n) |
| Глиобластома - необработанные, первая операция | 88 | 42.0% (37) |
| Глиобластома - рецидивирующая | 37 | 40.5% (15) |
| итог | 125 | 41.6% (52) |
Рисунок 1. Клеточная культура из свежих хирургических образцов глиобластомы. Свежие опухоли обобщаются на отдельные клетки. Nucleated интерфейс ячейки от среды разделения плотности затем помойкается в NMGF. Диссоциированные нейросферы помылись в NMGF, и, как правило, через 1 день после покрытия Есть мертвые клетки, мусор, прикрепленные одиночные клетки, а иногда и деления клеток вподвеске( A ). Формирование нейросферы быстрее для некоторых случаев (B,C), и медленнее для других (D,E). Все нейросферы разобщены и replated для по крайней мере 10 проходов, 41.6% GBMs дают долгосрочные самообновляя нейросферы. Жизнеспособные GBM диссоциированные клетки, которые не могут расти какнейросферы( F ) могут быть переведены в альтернативные условия культуры, например, 2% FBS/NMGF (G, H). Бар(A), 100 мкм, применяется ко всем изображениям. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 2. Нейросфера поколения и ортопедические ксенотрансплантаты мыши из опухолей ГБМ. Образец опухоли, представляя высокую плотность клеток (GBM1) и опухоль с высоким содержанием некротических (GBM2) были разобщены и нейросферы, культурные для 10 проходов в соответствии с Протоколы 1 и 2. Иммунокомпромиссные мыши были имплантированы с 3 х10 5 диссоциированных нейросферных клеток и пожертвовал, когда умирающий. Мозги мыши были формалин фиксированной и парафин встроенных для Окрашивания ИЭ и иммуногистохимии обнаружения человеческих маркеров, человеческих митохондрий (hMit) или основных гистосовместимости класса I подразделения HLA-A (MHC-I). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 3. Аналогичный рост опухоли у мышей имплантируется внутричерепно с клетками GBM3, культурными как нейросферы в NMGF или как монослой в 2% FBS/NMGF. (A) Каплан-Мейер кривые выживания для GBM3 культурируется как нейросферы в NMGF или монослой в 2%FBS/ NMGF (оба прохода <10) не показывают никакой разницы в выживании (n'10, p'0.7174, журнал ранга тест). (B)Рост опухоли, контролируемый живой биолюминесценции изображений (BLI) не показывают существенной разницы в динамике роста опухоли между двумя группами. (C)Морфология опухоли неотличима для 4 ксенотрансплантатов GBM3, 2 культурных в NMGF и 2 культурных в 2% FBS/NMGF. MHC-I пятно, как описано на рисунке 2. Шкала, 600 мкм. (D) Западная помарка показывая выражение создателя стволовой клетки Sox2 сохраненное в 2% культурах FBS/NMGF используемых для того чтобы начать туморы xenograft (A-C). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 4. Анализ экспрессии белка в нейросферных секциях иммуногистохимией. Нейросферные культуры были формалин-фиксированные и парафин встроенных, как описано в процедуре 4, и окрашенные сH'E( A ), анти-Sox2 антитела (B), и анти-EGFR антитела (C). Субстрат DAB был использован для визуализации (B,C). Бар, 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Discussion
Правильная энзиматическая диссоциация опухолевых клеток является критическим шагом в этом протоколе. Ткань должна быть измельчена задолго до инкубации в растворе диссоциации клеток при 37 градусов по Цельсию при вращении, в течение как минимум 30 минут, когда ткань должна быть механически тритурирована и проверено расширение диссоциации. В зависимости от степени сплоченности тканей, инкубация может быть продлена еще на 15-30 мин, по мере необходимости для завершения диссоциации в одиночные клетки. Инкубация в растворе диссоциации более 1 часа не рекомендуется из-за снижения жизнеспособности клеток. Хотя оптимальное количество стартовой ткани составляет 200-500 мг, этот протокол привел к успешной нейросферы культур всего от 50 мг опухолевой ткани.
Сыворотка свободной NMGF является селективной среде, и процент неопластических клеток, включающих основную часть опухоли, а также принимающих клеток, не выживет, в то время как другие будут прикрепляться к культуре тканей лечение колбы после покрытия. Очень важно, чтобы нейросферы, которые будут образовываться в течение 1-3 недель(рисунки 1B-E) передаются в свежие колбы, чтобы отделить от дифференцированных опухолевых клеток и мусора.
Клетки GBM enzymatically dissociated и никогда не культурные (шаг 1.10) можно криоконсервированы как подпорной источник клеток к культуре в альтернативных средствах массовой информации, в случае, если нейросферная культура терпит неудачу. Мы успешно получили нейросферные культуры из таких замороженных запасов, а также монослойные клетки, растущие в 2% FBS/NMGF.
Концептуально, "раковая стволовая клетка" является работа, и эта новая область выиграют от дополнительных разъяснений, так как клинические последствия являются значительными, особенно в генерации неоднородности опухоли, пластичность, и устойчивость ктерапии 19,20. В дополнение к жизненно важному для генерации конкретных пациентов GBM животных моделей, нейросферных культур также ценны для исследований in vitro, таких как изменение в клеточной сигнализации и экспрессии генов в ответ на факторы роста, гипоксия, и фармакологическиеагенты 11,21. Мы выбрали для использования поперечных сечений формалина фиксированной и парафин встроенных нейросфер, сохраняя 3D архитектуры, для изучения экспрессии белка и пост-трансляционных модификаций иммуногистохимии11, в связи с превосходной субклеточной локализации по отношению к более распространенному методу маркировки и визуализации всей сферы.
Было показано, что не все клетки в нейросферах, полученных из мозга взрослых млекопитающих являются стволовымиклетками 22. Аналогичным образом, нейросферы, вырастаемые из опухолей ГБМ, скорее всего, не клональные, из-за наличия более дифференцированных клеток-предшественников рака и самоагрегации, как известно, происходят привысокой плотности клеток 23, что считается ограничением этого метода некоторыми. В пользу обогащения для долгосрочного самообновляющиеся стволовые клетки, в отличие от только прародителей, которые могут временно расти какнейросферы 22, первичные нейросферы разобщены для вторичного формирования нейросферы, и далее пролетали в течение как минимум 10 проходов, примерно эквивалентно 2 месяцев в непрерывной культуре, что является признаком популяции, обогащеннойстволовыми клетками 22. По нашему опыту, GBM нейросферных культур, которые достигают этой отметки может продолжать расширяться как нейросферы на неопределенный срок. Оценка опухолей имеет значение, так как мы получили успешные культуры от ГБМ и анапластических астроцитом, IV и III классов ВОЗ, соответственно, но не от глиом более низкого класса.
Наиболее распространенный метод культивирования клеток глиобластомы, в традиционной среде роста, дополненной 10% FBS, приводит к значительному геному и фенотипической дивергенции от оригинальных опухолей 4. С другой стороны, нейросферные культуры являются стабильным и долгосрочным источником клеток, представляя фенотип стволовых клетокрака 4. Нейросферный метод становится все более популярным для обогащения CSC в долгосрочных культурах для ортопедических моделей ксенотрансплантата мыши, несмотря на то, что не был успешным для всех образцов астроцитомы высокого класса, что представляет собой главную слабость этого метода. Исследования, чтобы понять, как молекулярные характеристики родительских опухолей могут повлиять на формирование нейросферы ведутся. Изучение практических альтернативных методов культуры высокого класса глиомы, а затем обширная проверка предоставляется, учитывая важные преимущества наличия пациента конкретных моделей ГБМ, как мы заранее в эпоху персонализированной медицины, подпитывается доступность "омич" информации и увеличение числа потенциальных целевых методов лечения.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Центром опухолей головного мозга Гермелина, больницей Генри Форда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
- Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
- Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
- Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
- deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
- Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
- Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
- Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
- Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
