Summary
Protokoll för förökning av dissocierade höggradiga gliom kirurgiska exemplar i serum-fria neurosfär medium att välja för celler med cancer stamcell fenotyp. För exemplar som inte växer som neurosfärer föreslås ett alternativt protokoll. En paraffin inbäddning teknik för att upprätthålla 3D neurosfär arkitektur för immunocytokemi beskrivs.
Abstract
Glioblastomas, den vanligaste och aggressiva formen av astrocytoma, är eldfasta till terapi och molekylärt heterogena. Förmågan att etablera cellkulturer som bevarar den genomiska profilen hos föräldratumörerna, för användning i patientspecifika in vitro- och in vivo-modeller, har potential att revolutionera den prekliniska utvecklingen av nya behandlingar för glioblastom som är skräddarsydda för varje tumörs molekylära egenskaper.
Från och med färska högkvalitativa astrocytoma tumörer dissociated i enstaka celler, använder vi neurosfären analys som en berikning metod för celler presenterar cancer stamcell fenotyp, inklusive uttryck av neurala stamcell markörer, långsiktiga självförnyelse in vitro, och förmågan att bilda ortopisk xenograft tumörer. Denna metod har tidigare föreslagits och används nu av flera utredare. Baserat på vår erfarenhet av att skilja och odla 125 glioblastomprover, kom vi fram till det detaljerade protokollet vi presenterar här, lämpligt för rutinmässig neurosfärodling av högkvalitativa astrocytomer och storskalig expansion av tumörogena celler för prekliniska studier. Vi rapporterar om effektiviteten av framgångsrika långsiktiga kulturer med hjälp av detta protokoll och föreslår prisvärda alternativ för odling dissociated glioblastom celler som misslyckas med att växa som neurosfärer. Vi beskriver också i detalj ett protokoll för att bevara neurosfärerna 3D arkitektur för immunohistokemi. Cellkulturer berikade i CSCs, som kan generera ortopiska xenograftmodeller som bevarar gbms molekylära signaturer och heterogenitet, blir alltmer populära för studier av GBMs biologi och för förbättrad design av preklinisk testning av potentiella terapier.
Introduction
Glioblastoma (GBM), en WHO grad IV astrocytoma, är den vanligaste och aggressiva primära hjärntumören. Olika utvecklingsmässiga fenotyper antas av GBM tumörceller, inklusive celler som uppvisar "cancer stamcell" (CSC) egenskaper, såsom uttryck för neurala stamcellsmarkörer (NSC), långsiktig självförnyelse, och potentialen att ge upphov till mer differentierade celler som uttrycker astrocytiska markörer och bildar huvuddelen av tumör1-3. Även om klargörande fortfarande behövs när det gäller CSC molekylär identitet och kliniska konsekvenser, fokus för det nuvarande arbetet ligger på den operativa definitionen av CSC: långsiktiga självförnyelse in vitro och förmågan att differentiera och reproducera den ursprungliga tumör på ortopic implantation i immunkomprometterade gnagare.
Glioblastoma celler har odlats i årtionden i traditionella medium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och flera hög passage kommersiellt tillgängliga serum odlade GBM cellinjer är tumorigenic i immunkomprometterade gnagare, men det finns betydande genomisk och molekylär divergens från den ursprungliga tumör4, begränsa deras användning som kliniskt relevanta modeller. Mer nyligen identifierades celler med stam/stamfogen fenotyp lyhörda för EGF och bFGF i GBMs2. Därefter odlades dissocierade GBM tumör prover i ett serum-fritt medium3, ursprungligen formuleras för urval och expansion av neurala stamceller från den vuxna däggdjur hjärnan5. Dessa odlingsförhållanden hindrar tillväxten av de flesta nonneoplastiska och mer differentierade tumörcellspopulationer, samtidigt som de gynnar tillväxten av stam- och stamceller som flytande multicellulära sfäroider ellerneurosfärer 3, som efterliknar beteendet hos vuxna däggdjur neurala stamceller5. Omfattande sida vid sida jämförelse av primära GBM celler odlas i antingen neurosfär medium kompletteras med tillväxtfaktorer (NMGF) eller i det traditionella tillväxtmediet kompletteras med 10% FBS, visade att GBM neurosfärer var tumorigenic, presenterade multilineage differentiering potential och bevarade genotypen av den ursprungliga tumör, i motsats till 10% FBS kulturer som inte var tumorigenic vid låga passager och avsevärt avvek från de ursprungliga tumörer vid sena passager4.
Isolering av CSC från dissociated GBM tumörer genom cell sortering baserat på uttryck av förmodade CSC markör CD133 har också föreslagits6,7, men ytterligare arbete anges att CSC fenotyp inte definitivt är associerad med uttryck av sådanamarkörer 8-10, minska den ursprungliga entusiasmen för denna strategi, medan nya markörer fortfarande testas10. Den otillgänglighet hittills av en validerad uppsättning markörer som definierar CSC, tillsammans med målet med storskalig förstärkning av dessa celler för prekliniska studier, gör användningen av cellsortering opraktisk för rutinmässiga CSC-berikade kulturer. GBM-celler som valts av förmågan att växa som neurosfärer i NMGF uttrycker alltid neurala stamcellsmarkörer. Vi har observerat att Sox2 och nestin uttrycks allestädes närvarande i neurosfärkulturer, medan CD133 protein finns i en delmängd av GBM neurosfärer (opublicerade data och referens11).
Flera laboratorier bedriver neurosfärkulturer från glioblastomtumörer med samma allmänna tillvägagångssätt för enzymatisk dissociation och odling i serumfritt medium kompletterat medtillväxtfaktorer 3,4,11-14, medan andra kollegor har rapporterat försök att växa långsiktiga neurosfärkulturer från GBM-prover utan framgång . Den allmänna metoden för enzymatisk dissociation och neurosfärkultur av höggradiga gliom som presenteras här liknar vad som har beskrivits i ovanstående publikationer. Vi har optimerat protokollet baserat på vår erfarenhet av att skilja och odla över 100 GBM-prover. Effektiviteten av att få långsiktiga neurosfärkulturer från färska GBM-prover som tillämpar protokollet som presenteras här är över 40%, liknande de få rapporter som visar effektivitetsdata3,15, vilket leder till utforskning av alternativa protokoll som odlingsceller kontinuerligt eller intermittent i serumfritt medium i närvaro av EGF och bFGF som monoskikt på ytor belagda med ECM-protein16,17. Neurosfärkulturer är fortfarande det mest validerade och alltmer populära tillvägagångssättet för att bevara GBM-tumörer molekylära egenskaper och tumörogen potential3,4,11-14, så vårt tillvägagångssätt är att försöka neurosfärkulturer först, samtidigt som vi samtidigt testar alternativa metoder för odling av GBM-celler som inte bildar långsiktiga självförnyande neurosfärer (Figur 1), för att öka representationen av GBM-tumörer som kan användas i djurmodeller. Här presenterar vi ett protokoll för odling av neurosfärer från GBMs. För celler som inte bildar neurosfärer visar vi en enkel modifiering i tillväxtmediet, som det första försöket att odla tumörogena celler från nonneurosfären som bildar GBMs, med lovande resultat och fortfarande genomgår omfattande validering.
Protocol
1. Enkelcellig suspension från färsk kirurgiskt glioblastomprov för neurosfärkultur
- Med skriftligt samtycke från patienter och i enlighet med institutionella riktlinjer, samla tumörprover för cellkultur omedelbart efter samband kirurgi av hög kvalitet gliom.
- Bekräfta diagnos av tumör prov av histopatologi. Transportera omedelbart provet från operationsrummet till laminär flödesvävnadskulturhuv, för bearbetning inom 1 timme från kirurgi.
OBS: För operationer på en avlägsen plats, skär tumörprovet i mindre fragment och placera i ett rör som innehåller DMEM/ F12 (håll på is). Tumören kan bearbetas flera timmar efter operationen. - Börja med 200-500 mg vävnad (optimal), hacka tumörprovet med ett skalpellblad och överför till ett 15 ml rör som innehåller 10 ml DMEM/F12 serumfritt medium. Blanda genom att vända flera gånger, låt tumörbitarna sedimenteras genom gravitation, ta bort medium och upprepa vid behov.
- Förbered den enzymatiska vävnadsdisociationslösningen och stoppa lösningen fräsch.
- Enzymatisk vävnadsavskisslösning: 5 ml 0,05% trypsin-EDTA, 2,5 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) kalcium- och magnesiumfri, 2,5 ml Kollagenas IV-stamlösning (2 000 U/ml i HBSS med kalcium och magnesium).
- Stopplösning: 5 ml trypsinhämmarelösning, 5 ml DMEM/F12, 2 μl 5 000 U/ml DNAs I (tillverkad i HBSS kalcium- och magnesiumfri).
- Ta bort medium och tillsätt enzymatisk vävnadsdisociationslösning till det malda tumörprovet, med 2 ml för varje 0,5 g vävnad. Blanda försiktigt genom invertering.
- Inkubera vävnaden i lösning vid 37 °C i en inkubator för vävnadskultur under rotation i 30 minuter.
- Triturera med en 2 ml pipett och stoppa matsmältningen eller återgå till inkubatorn för ytterligare 15-30 min inkubation beroende på matsmältningsnivån.
- Stoppa matsmältningen genom att tillsätta 2 volymer stopplösning och triturera mekaniskt med en 5 ml serologisk pipett.
- Filtrera bort det osmälta materialet genom en 40 μm cellsil. Pellet cellerna på 800 x g i 5 min vid rumstemperatur, följt av tvättning 3x i 10 ml DMEM/F12.
- Återanvänd den slutliga cellpelleten i 5 ml DMEM/F12.
- Skikta långsamt cellupphängningen över 5 ml lymfolyt-M och pellet vid 1 300 x g i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Överför gränssnittsskiktet som innehåller de nukleära cellerna till ett 15 ml-rör som innehåller 10 ml DMEM/F12.
- Pellet cellerna vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur. Upprepa tvätten med DMEM/F12 2x mer.
- Cryopreserve de resulterande enskilda cellerna för vidare användning genom att återanvända pelleten i Recovery Cell Freezing Medium, aliquoting i kryovials, långsam frysning och lagring i flytande kväve.
- Till kultur, återanvänd cellerna i Neurosphere Medium kompletterat med tillväxtfaktorer (NMGF) och platta med relativt låg densitet (<1 x 105 celler/ml) i en vanlig T25 vävnadskulturkolv under standardförhållanden, 5% CO2,37 °C, fuktad vävnadskulturinkubator (Figur 1A).
- Förbered NMGF med följande recept
För 500 ml DMEM/F12 Lagerlösning volym slutlig koncentration N2 tillägg (10x) 5 ml 1x 250 mg/ml BSA-stamlösning 1 ml 0,5 mg/ml 10 mg/ml Gentamicin reagens 1,25 ml 25 μg/ml 100x antibiotikum/antimykotisk 2,5 ml 0,5x 100 mg/ml bFGF 0,1 ml 20 ng/ml 100 mg/ml EGF 0,1 ml 20 ng/ml
- Förbered NMGF med följande recept
- Överför neurosfärer som bildas under 1-3 veckor (figur 1B-E) till färska flaskor, för att separera från bifogade celler och skräp. Utför partiella medieändringar var 3-4: e dag.
OBS: Om dissocierande ortopisk xenograft tumör med hjälp av protokollet ovan, steg 1.11-1.13 kan utelämnas.
2. Glioblastoma Neurosfär kultur underhåll och nedströms applikationer
-
Dissociation: Övervaka neurosfärkulturerna och utför partiella medelstora förändringar var 3-4 dagar. När de flesta multicellulära neurosfärer i kolven når 100 μm i diameter, ta avstånd från en enda cellfjädring:
- Överför mediet som innehåller neurosfärerna till ett 15 ml-rör, gravitationssediment neurosfärerna i ca 5 min, ta bort mediet och återanvänd cellpelleten i 10 ml kalcium- och magnesiumfri DPBS.
- Blanda och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur, eftersom cellerna sedimenteras av gravitationen.
- Ta bort 7-8 ml DPBS och ta sedan bort neurosfärerna mekaniskt med en förförd serologisk pipett.
- Pellet de dissocierade cellerna vid 800 x g i 5 min vid 4 °C.
- Passaging: Återanvänd de dissocierade cellerna (steg 2.1.) i NMGF och dela upp i det nödvändiga antalet flaskor (1:3) och inkubera under standardförhållanden. Sekundära neurosfärer kommer att bildas, och bör därefter dissocieras för bildandet av tertiära sfärer.
- Bedömning av långsiktig självförnyelse: Upprepa dissociationsförfarandet tills neurosfärkulturen uppnår minst 10 passager, vilket motsvarar minst 2 månader i kultur.
-
Frysning: För att kryopreservera neurosfärerna, dissociera neurosfärerna (steg 2.1.) och återanvänd cellpelleten i Recovery Cell Freezing Medium, alikvot i kryovialer, långsam frysning och lagra i flytande kväve.
- Odling av neurosfärceller från ett fryst bestånd: tina cellerna vid 37 °C och överför omedelbart till ett 15 ml-rör som innehåller 10 ml DMEM/F12. Blanda röret försiktigt och snurra sedan cellerna vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Tvätta cellpelleten en gång till och återanvänd cellerna i NMGF och överför till en T25 vävnadskulturkolv.
-
Cellupphängning för intrakraniellt implantat i immunkomprometterad mus:
- Dissociera neurosfärerna (steg 2.1.) och återanvänd cellpelleten i kalcium- och magnesiumfria DPBS. Räkna livskraftiga celler med hjälp av en hemocytometer och trypanblå uteslutning.
- Beräkna antalet celler som behövs för implantat, vanligtvis 3 x 105 celler/mus, överför önskat antal celler till en flaska och pellet cellerna vid 1 000 x g.
- Återanvänd cellpelleten i en volym som är lämplig för implantat (5 μl/mus) genom att försiktigt knacka på mikrocentrifugröret. Placera cellfjädringen på is och använd den inom 2 timmar.
3. Alternativt protokoll för odling av tumörogena glioblastomceller (för de fall där neurosfärkulturen misslyckas)
- Komplettera NMGF-mediet med fetala nötkreatur serum till en slutlig koncentration av 2% FBS/NMGF.
- Börja med celler i NMGF-odling:Skörda livskraftiga celler från NMGF-kolven(figur 1F),återanvänd i 2% FBS/NMGF och platta med relativt låg densitet (<1 x 105 celler/ml) i en vanlig T25 vävnadskulturkolv och kultur under standardförhållanden, 5% CO2,37 °C, fuktad vävnadskulturinkubator (Figur 1G).
- Börja med frysta aldrig odlade celler (steg 1.14.): Tina cellerna, tvätta i serumfritt medium och platta i 2% FBS/NMGF och kultur enligt beskrivningen i steg 3.2. Odling i NMGF i 3 dagar innan vibrerande livskraftiga celler överförs till 2% FBS/NMGF är ett alternativ för att förvälja bort differentierade celler.
4. Morfologisk och molekylär analys av neurosfärer av immunohistokemi
- Kultur neurosfärerna tills de flesta flytande multicellulära sfäroider når 100 μm diameter.
- Ta bort odlingskolvar från inkubatorn och pelleta omedelbart neurosfärerna, ta bort medium och tillsätt 10 ml DPBS utan att störa pelleten. Ta bort DPBS, återanvänd i 10% neutral buffrad formalin och inkubera i 20 min vid rumstemperatur.
- Pellet sfäroiderna, återanvänd i 30% etanol och inkubera i 30-45 min.
- Ersätt 30% etanol med 50% etanol, inkubera i 15 min och ersätt med färsk 50% etanol, inkubera ytterligare 30 min.
- Upprepa (steg 4.4.) med 70% etanol.
- Ersätt med 95% etanol två förändringar 10-20 min vardera, och upprepa med absolut etanol tills sfäroider är ljusvita och kondenserade.
- Gör en liten filterpapperskot av linspapper och placera den i en liten tratt i en bägare. Blöt linspapperet med absolut alkohol.
- Lossa pelleten något med färsk 100% etanol, häll av överflödig etanol och häll sfäroiderna genom linspapperskonen och se till att de går till spetsen av konen. Skölj röret med extra absolut etanol och häll eventuella återstående sfäroider genom linspapperskonen.
- Ta bort papperskonen från tratten och flytta försiktigt sfäroiderna till botten av konen. Vik papperet i en kvadrat och se till att sfäroiderna är så säkert inneslutna som möjligt.
- Överför de förpackade neurosfärerna till en kassett och överför till en automatisk vävnadsprocessor.
- Programmera den automatiska vävnadsprocessorn enligt följande: absolut etanol, 10 min, xylen, 15 min (2x), paraffin, 10 min (4x).
- Ta bort kassetten från processorn och placera den på den uppvärmda delen av ett paraffininbäddningssystem . Se till att hela ytan är fri från fragment, damm eller annat skräp och sug ut all paraffin från tången som värmer brunnar. Varm ren paraffinfri tång och tillsätt en liten mängd paraffin till en uppvärmd basform.
- Öppna kassetten, ta bort paketet och placera det på den uppvärmda delen av inbäddningssystemet. Öppna försiktigt papperskonen tills sfäroiderna är synliga. Samla så mycket av materialet som möjligt med förvärmde tångar och överför till flytande paraffin i basformen.
- Upprepa efter behov för att hämta så många av sfäroiderna som möjligt. Skrapa försiktigt vävnadspapperet med ett förvärmt rent rakblad som har torkats med etanol för att samla upp eventuella restsfäroider utan att få något papper i blocket.
- Bryt försiktigt upp eventuella sfäroidklumpar med varma tångar. Flytta sfäroiderna bort från hörnen till ett enhetligt centralt lager. Flytta basformen till kylområdet för att säkra sfäroiderna på plats, tillsätt kassetten, fyll långsamt med paraffin och kyl noggrant.
- Neurosfärparaffinblocket kan användas för normal sektionering och immunohistokemi.
Representative Results
Vi har tillämpat protokollet som beskrivs ovan för att skilja och odla 125 färska kirurgiska glioblastom exemplar (Figur 1),88 nyligen diagnostiseras och 37 återkommande tumörer (Tabell 2), med godkänt patient samtycke och enligt institutionella riktlinjer. Effektiviteten i protokollet för att upprätta långsiktiga neurosfär kulturer var 41,6%, och liknande för nydiagnostiserade tumörer och återkommande tumörer (Tabell 2). För vissa GBM-prover bildas neurosfärer under de första dagarna (figurerna 1B och 1C), medan det för andra krävs längre odlingstid (figurerna 1D och 1E).
Effektiviteten av neurosfärbildning var inte uteslutande beroende av nivån av nekros i vävnaden, vilket exemplifieras av resultaten från en nyligen diagnostiserad tumör med hög celltäthet (GBM1) och en återkommande och nekrotisk tumör (GBM2) behandlas enligt protokoll 1 och 2, båda ger neurosfärkulturer (Figur 2).
Testning av den tumorigenic potentialen hos varje neurosfär kultur i immunkomprometterade möss är den avgörande valideringen av detta tillvägagångssätt för berikning av CSCs. Med hjälp av ett protokoll somliknar tidigare beskrivna 18,GBM1 och GBM2 neurosfärer implanterades i hjärnan hos immunkomprometterade möss, enligt institutionella och IACUC djurvård riktlinjer. Xenograft tumörer presenterar morfologiska egenskaper hos GBMs, såsom invasion i hjärnan parenkym och nekros (Figur 2).
GBM3 var dissociated (Figur 1A) och odlas i neurosfär medium (figurerna 1D och 1E), och i 2% FBS / NMGF (Figurerna 1D, 1G och 1H). Monolayerceller odlade i 2% FBS/NMGF och neurosfärceller odlade i NMGF var dissocierade och samma antal celler implanterades i naken mus, med samma förfarande som i figur 2. Inga skillnader i överlevnad, tumör tillväxt dynamik eller morfologi observerades mellan de två preimplant kultur metoder (figur 3A-C). Tumör tillväxt egenskaper ändras inte upp till den senaste passagen testas, P20 för neurosfärer och P10 för 2% FBS/NMGF. Medan neurala stamcellsmarkörer, inklusive Sox2, är nedreglerade i de flesta primära GBM-celler odlade i 10% FBS 3,4,11, NMGF kompletterat med 2% FBS möjliggör kvarhållande av Sox2 uttryck (Figur 3D).
Neurosfärer bearbetades enligt protokoll 4 och märktes med H&E (figur 4A), anti-Sox2-antikroppar, som visar nukleär lokalisering (figur 4B) och EGFR-antikropp, cellmembranlokalisering (Figur 4C). Detta protokoll har tillämpats för att få tillgång till stimuli-beroende ändringar i uttrycket av nestin, GFAP och spridningsmarkören Ki6711.
Tabell 2. Effektivitet i härleda långsiktiga självförnyande neurosfärkulturer från GBMs.
| patologi | N. | Procentandel prover som ger långsiktiga självförnyande neurosfärer (n) |
| Glioblastom - obehandlat, första operationen | 88 | 42.0% (37) |
| Glioblastom - återkommande | 37 | 40.5% (15) |
| total | 125 | 41.6% (52) |
Figur 1. Cellkultur från färska glioblastom kirurgiska exemplar. Färska tumörer är enzymatiskt dissociated i enstaka celler. Nukleärt cellgränssnitt från densitetsseparationsmedium pläteras sedan i NMGF. Dissocierade neurosfärer pläteras i NMGF, och vanligtvis 1 dag efter plätering finns det döda celler, skräp, bifogade enstaka celler och tillfälliga delningsceller i suspension (A). Neurosfärbildning är snabbare för vissa fall (B, C), och långsammare för andra (D, E). Alla neurosfärer är dissocierade och replaterade för minst 10 passager, 41,6% GBMs ger långsiktiga självförnyande neurosfärer. Livskraftiga GBM-dissocierade celler som inte växer som neurosfärer (F) kan överföras till alternativa odlingsförhållanden, till exempel 2% FBS / NMGF (G, H). Stapel( A), 100 μm, gäller för alla bilder. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Neurosfär generation och ortopic mus xenografts från GBM tumörer. Ett tumörprov med hög celltäthet (GBM1) och en tumör med högt nekrotiskt innehåll (GBM2) var dissocierade och neurosfärer odlade för 10 passager enligt protokollen 1 och 2. Immunkomprometterade möss implanterades med 3 x10 5 dissocierade neurosfärceller och offrades när de var döende. Mus hjärnor var formalin fasta och paraffin inbäddade för H&E färgning och immunohistokemi detektion av mänskliga markörer, mänskliga mitokondrier (hMit) eller stora histocompatibility klass I underavdelning HLA-A (MHC-I). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Liknande tumörtillväxt hos möss implanterade intrakraniellt med GBM3-celler odlade som neurosfärer i NMGF eller som monoskikt i 2% FBS/ NMGF. (A) Kaplan-Meier överlevnadskurvor för GBM3 odlade som antingen neurosfärer i NMGF eller monolayers i 2%FBS/NMGF (båda passage <10) visar ingen skillnad i överlevnad (n=10, p=0,7174, log-rank test). (B) Tumörtillväxt övervakad av levande bioluminescensavbildning (BLI) visar ingen signifikant skillnad i tumörtillväxtdynamiken mellan de två grupperna. (C) Tumörmorfologi är oskiljbar för 4 GBM3 xenografts, 2 odlade i NMGF och 2 odlade i 2% FBS/NMGF. MHC-I-fläck enligt beskrivningen i figur 2. Skala, 600 μm. (D) Western blot som visar stamcellstillverkaren Sox2 uttryck behålls i 2% FBS/NMGF kulturer som används för att initiera xenograft tumörer (A-C). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Analys av proteinuttryck i neurosfärsektioner av immunohistokemi. Neurosfärkulturer var formalin-fasta och paraffin inbäddade enligt beskrivningen i förfarande 4, och färgas med H&E (A), anti-Sox2 antikroppar (B), och anti-EGFR antikroppar (C). DAB-substrat användes för att visualisera (B,C). Bar, 20 μm. Klicka här om du vill visa större bild.
Discussion
Korrekt enzymatisk tumör cell dissociation är ett kritiskt steg i detta protokoll. Vävnaden skall malas väl före inkubation i celldisociationslösning vid 37 °C under rotation, i minst 30 minuter, när vävnaden måste tritureras mekaniskt och utökningen av dissociationen kontrolleras. Beroende på graden av vävnadssammanhållning kan inkubation förlängas med ytterligare 15-30 min, efter behov för att slutföra dissociationen till enstaka celler. Inkubation i dissociationslösning längre än 1 timme rekommenderas inte på grund av minskad cell livskraft. Även om den optimala mängden startvävnad är 200-500 mg, detta protokoll har lett till framgångsrika neurosfär kulturer från så lite som 50 mg tumörvävnad.
Serumfri NMGF är ett selektivt medium, och en procentandel neoplastiska celler som utgör huvuddelen av tumören, liksom värdceller, kommer inte att överleva, medan andra kommer att fästa vid den vävnadskulturbehandlade kolven efter plätering. Det är viktigt att de neurosfärer som kommer att bildas under 1-3 veckor (figur 1B-E) överförs till färska flaskor, för att separera från differentierade tumörceller och skräp.
GBM-celler enzymatically dissociated och aldrig odlas (steg 1.10) kan cryopreserved som en backup källa av celler till kultur i alternativa medier, om neurosfärkulturen misslyckas. Vi har framgångsrikt erhållit neurosfärkulturer från sådana frysta lager, liksom monolayerceller som växer i 2% FBS / NMGF.
Konceptuellt är "cancerstamcell" ett pågående arbete och detta framväxande område kommer att dra nytta av ytterligare klargöranden, eftersom de kliniska konsekvenserna är betydande, särskilt i generationen av tumör heterogenitet, plasticitet och resistens mot terapi19,20. Förutom att vara avgörande för att generera patientspecifika GBM-djurmodeller är neurosfärkulturerna också värdefulla för in vitro-studier som förändring i cellsignalering och genuttryck som svar på tillväxtfaktorer, hypoxi och farmakologiska medel11,21. Vi har valt att använda tvärsnitt av formalin fasta och paraffin inbäddade neurosfärer, bevara 3D-arkitekturen, studera proteinuttryck och post-translationella modifieringar av immunohistokemi11, på grund av överlägsen subcellulär lokalisering i förhållande till den vanligare metoden för märkning och avbildning av hela sfären.
Det har visat sig att inte alla celler i neurosfärer som härrör från vuxna däggdjurshjärnor är stamceller22. På samma sätt är neurosfärerna som odlas från GBM-tumörer sannolikt inte kloniga, på grund av närvaron av mer differentierade cancerprogenitorceller och självaggregering, känd för att uppstå vid höga celltätheter23, vilket anses vara en begränsning av denna metod av vissa. För att gynna berikning för långsiktiga självförnyande stamceller, i motsats till bara stamceller som kan växa tillfälligt somneurosfärer 22, är de primära neurosfärerna dissocierade för sekundär neurosfärbildning och vidare passagede i minst 10 passager, ungefär motsvarande 2 månader i kontinuerlig kultur, vilket är en indikation på en befolkning berikad istamceller 22. Enligt vår erfarenhet kan GBM neurosfärkulturer som uppnår det märket fortsätta att utökas som neurosfärer på obestämd tid. Tumör kvalitet spelar roll, eftersom vi har fått framgångsrika kulturer från GBMs och anaplastic astrocytomas, WHO klass IV respektive III, men inte från lägre kvalitet gliomas.
Den vanligaste metoden för odling av glioblastomceller, i traditionellt tillväxtmedium kompletterat med 10% FBS, leder till betydande genomisk och fenotypisk divergens från de ursprungliga tumörerna 4. Å andra sidan är neurosfärkulturer en stabil och långsiktig källa till celler som presenterar cancerstamcells fenotyp4. Neurosfärmetoden har blivit alltmer populär för berikning av CSC i långsiktiga kulturer för ortopiska mus xenograft modeller, trots att inte lyckas för alla hög kvalitet astrocytoma prover, vilket representerar den största svagheten i denna metod. Studier för att förstå hur molekylära egenskaper hos föräldratumörerna kan påverka neurosfärbildningen pågår. Utforskning av praktiska alternativa metoder för kultur av hög kvalitet gliomas, följt av omfattande validering beviljas, med tanke på de viktiga fördelarna med att ha patientspecifika GBM-modeller, när vi går in i en era av personlig medicin, drivs av tillgängligheten av "omics" information och ökat antal potentiella riktade terapier.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
- Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
- Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
- Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
- deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
- Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
- Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
- Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
- Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
