Summary
Protokoll for forplantning av dissosierte høyverdige glioma kirurgiske prøver i serumfri nevrosfære medium for å velge for celler med kreft stamcelle fenotype. For prøver som ikke vokser som nevrosfærer, foreslås en alternativ protokoll. En parafininnbyggingsteknikk for å opprettholde 3D-nevrosfærens arkitektur for immunocytokjemi er beskrevet.
Abstract
Glioblastomer, den vanligste og aggressive formen for astrocytoma, er ildfaste mot terapi og molekylært heterogene. Evnen til å etablere cellekulturer som bevarer foreldresvulstenes genomiske profil, til bruk i pasientspesifikke in vitro- og in vivo-modeller, har potensial til å revolusjonere den prekliniske utviklingen av nye behandlinger for glioblastom skreddersydd til de molekylære egenskapene til hver svulst.
Fra og med friske høyverdige astrocytomtumorer dissosiert i enkeltceller, bruker vi nevrosfærens analyse som en berikelsesmetode for celler som presenterer kreft stamcelle fenotype, inkludert uttrykk for nevrale stamcellemarkører, langsiktig selvfornyelse in vitro, og evnen til å danne ortotopiske xenografte svulster. Denne metoden er tidligere foreslått, og er nå i bruk av flere etterforskere. Basert på vår erfaring med dissosierende og kultiverende 125 glioblastomprøver, kom vi frem til den detaljerte protokollen vi presenterer her, egnet for rutinemessig nevrosfærekultur av høyverdige astrocytomer og storskala utvidelse av tumorogene celler for prekliniske studier. Vi rapporterer om effektiviteten av vellykkede langsiktige kulturer ved hjelp av denne protokollen og foreslår rimelige alternativer for å dyrke dissosierte glioblastomceller som ikke vokser som nevrosfærer. Vi beskriver også i detalj en protokoll for å bevare nevrosfærene 3D-arkitektur for immunhiistokjemi. Cellekulturer beriket i CSC-er, som er i stand til å generere ortotopiske xenograftmodeller som bevarer molekylære signaturer og heterogenitet av GBMs, blir stadig mer populære for studiet av biologien til GBMs og for forbedret design av preklinisk testing av potensielle terapier.
Introduction
Glioblastom (GBM), en WHO grad IV astrocytoma, er den mest utbredte og aggressive primære hjernesvulsten. Ulike utviklingsfenotyper er vedtatt av GBM tumorceller, inkludert celler som viser "kreft stamcelle" (CSC) egenskaper, for eksempel uttrykk for nevrale stamcellemarkører (NSC), langsiktig selvfornyelse, og potensialet til å gi opphav til mer differensierte celler som uttrykker astrocytiske markører og danner hoveddelen av svulsten1-3. Mens avklaring fortsatt er nødvendig angående CSC molekylær identitet og kliniske implikasjoner, er fokuset i det nåværende arbeidet på den operative definisjonen av CSC: langsiktig selvfornyelse in vitro og evnen til å skille og reprodusere den opprinnelige svulsten ved ortotopisk implantasjon hos immunkompromitterte gnagere.
Glioblastomceller har blitt dyrket i flere tiår i tradisjonelt medium som inneholder 10% føtal bovint serum (FBS) og flere høyt passasje kommersielt tilgjengelige serumkulturerte GBM-cellelinjer er tumorogene i immunkompromitterte gnagere, men det er betydelig genomisk og molekylær divergens fra den opprinnelige svulsten4, noe som begrenser bruken som klinisk relevante modeller. Mer nylig ble celler med stam/stamcelle fenotype responsive til EGF og bFGF identifisert i GBMs2. Deretter ble dissosierte GBM tumorprøver dyrket i et serumfritt medium3, opprinnelig formulert for valg og utvidelse av nevrale stamceller fra den voksne pattedyrhjernen5. Disse kulturforholdene hindrer veksten av de fleste ikke-neoplastiske og mer differensierte tumorcellepopulasjoner, samtidig som de favoriserer veksten av stam- og stamceller som flytende multicellulære sfæroider, eller nevrosfærer3, etterligner oppførselen til voksne pattedyr nevrale stamceller5. Omfattende sammenligning side om side av primære GBM-celler dyrket i enten nevrosfæremedium supplert med vekstfaktorer (NMGF) eller i det tradisjonelle vekstmediet supplert med 10% FBS, avslørte at GBM-nevrosfærene var tumorigene, presenterte multilineage differensieringspotensial, og bevarte genotypen til den opprinnelige svulsten, i motsetning til de 10% FBS-kulturene som ikke var tumorogene ved lave passasjer og betydelig divergert fra de opprinnelige svulstene ved sene passasjer4.
Isolering av CSC fra dissosierte GBM-svulster etter cellesortering basert på uttrykket av putativ CSC-markør CD133 er også foreslått6,7, men videre arbeid indikerte at CSC-fenotypen ikke er definitivt forbundet med uttrykket av slike markører8-10, og reduserer den første entusiasmen for denne strategien, mens nye markører fortsatt blir testet10. Utilgjengeligheten til dags dato av et validert sett med markører som definerer CSC, sammen med målet om storskala forsterkning av disse cellene for prekliniske studier, gjør bruken av cellesortering upraktisk for rutinemessige CSC-berikede kulturer. GBM-celler valgt av evnen til å vokse som nevrosfærer i NMGF uttrykker alltid nevrale stamcellemarkører. Vi har observert at Sox2 og nestin er allestedsnærværende uttrykt i nevrosfærekulturer, mens CD133-protein er til stede i et delsett av GBM-nevrosfærene (upubliserte data og referanse11).
Flere laboratorier forfølger nevrosfærekulturer fra glioblastomtumorer ved hjelp av samme generelle tilnærming til enzymatisk dissosiasjon og kultivering i serumfritt medium supplert med vekstfaktorer3,4,11-14, mens andre kolleger har rapportert forsøk på å vokse langsiktige nevrosfærekulturer fra GBM-prøver uten suksess . Den generelle metoden for enzymatisk dissosiasjon og nevrosfærekultur av høyverdige gliomer presentert her ligner det som er skissert i de ovennevnte publikasjonene. Vi har optimalisert protokollen basert på vår erfaring med å dissosiere og dyrke over 100 GBM-prøver. Effektiviteten av å skaffe langsiktige nevrosfærekulturer fra ferske GBM-prøver som bruker protokollen som presenteres her, er over 40%, lik de få rapportene som viser effektivitetsdata3,15, noe som fører til utforskning av alternative protokoller som kultivering av celler kontinuerlig eller periodisk i serumfritt medium i nærvær av EGF og bFGF som monolayers på overflater belagt med ECM-protein16,17. Neurosphere kulturer er fortsatt den mest validerte og stadig mer populære tilnærmingen til å bevare GBM svulster molekylære egenskaper og tumorigent potensial3,4,11-14, dermed vår tilnærming er å forsøke nevrosfærer kulturer først, mens samtidig teste alternative metoder for å kultivere GBM celler som ikke klarer å danne langsiktige selvfornyende nevrosfærer ( Figur1), for å øke representasjonen av GBM svulster som kan brukes i dyremodeller. Her presenterer vi en protokoll for dyrking av nevrosfærer fra GBM-er. For celler som ikke klarer å danne nevrosfærer, viser vi en enkel modifikasjon i vekstmediet, som det første forsøket på å dyrke tumorogene celler fra ikke-urosphere som danner GBMs, med lovende resultater og fortsatt gjennomgår omfattende validering.
Protocol
1. Enkeltcellet suspensjon fra fersk kirurgisk glioblastomprøve for nevrosfærekultur
- Med skriftlig samtykke fra pasienter og i samsvar med institusjonelle retningslinjer, samle tumorprøver for cellekultur umiddelbart etter reseksjonskirurgi av høyverdig glioma.
- Bekreft diagnose av tumorprøve ved histopatologi. Transporter straks prøven fra operasjonsrommet til laminær strømningsvevskulturhette, for behandling innen 1 time fra operasjonen.
MERK: For operasjoner på et avsidesliggende sted, kutt tumorprøven i mindre fragmenter og legg den i et rør som inneholder DMEM/F12 (hold på is). Svulsten kan behandles flere timer etter operasjonen. - Starter med 200-500 mg vev (optimal), hakk svulstprøven ved hjelp av et skalpellblad, og overfør til et 15 ml rør som inneholder 10 ml DMEM / F12 serumfritt medium. Bland ved å invertere flere ganger, la svulststykkene sedimentere med tyngdekraften, fjern medium og gjenta etter behov.
- Forbered enzymatisk vev dissosiasjonsløsning og stopp løsning frisk.
- Enzymatisk vev dissosiasjonsløsning: 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, 2,5 ml Hanks balansert saltoppløsning (HBSS) kalsium- og magnesiumfri, 2,5 ml Kollagenalose IV lageroppløsning (2000 U/ml i HBSS med kalsium og magnesium).
- Stoppløsning: 5 ml Trypsinhemmeroppløsning, 5 ml DMEM/F12, 2 μl 5000 U/ml DNAse I (laget i HBSS kalsium- og magnesiumfri).
- Fjern medium og tilsett Enzymatic Tissue Dissociation Solution til hakket tumorprøve, ved hjelp av 2 ml for hvert 0,5 g vev. Bland forsiktig ved å snu.
- Inkuber vevet i oppløsning ved 37 °C i en vevskulturinkubator under rotasjon i 30 minutter.
- Triturat med en 2 ml pipette og stopp fordøyelsen eller gå tilbake til inkubatoren for en annen 15-30 min inkubasjon avhengig av fordøyelsesnivået.
- Stopp fordøyelsen ved å tilsette 2 volumer stoppløsning og trianturer mekanisk med en 5 ml serologisk pipette.
- Filtrer ut det ufordøyde materialet gjennom en 40 μm cellesil. Pellet cellene på 800 x g i 5 min ved romtemperatur, etterfulgt av vasking 3x i 10 ml DMEM / F12.
- Resuspend den endelige cellepellet i 5 ml DMEM/F12.
- Legg cellefjæringen langsomt over 5 ml Lymfolyte-M og pellets ved 1300 x g i 20 minutter ved romtemperatur.
- Overfør grensesnittlaget som inneholder nukleerte celler til et 15 ml rør som inneholder 10 ml DMEM / F12.
- Pellet cellene på 800 x g i 5 min ved romtemperatur. Gjenta vasken med DMEM/F12 2x mer.
- Cryopreserve de resulterende enkeltcellene for videre bruk ved å resuspendere pellet i Recovery Cell Freezing Medium, aliquoting i cryovials, langsom frysing, og lagring i flytende nitrogen.
- Til kultur, resuspend cellene i Neurosphere Medium supplert med vekstfaktorer (NMGF), og plate ved relativt lav tetthet (<1 x 105 celler / ml) i en vanlig T25 vev kultur kolbe under standard forhold, 5% CO2, 37 °C, fuktet vev kultur inkubator (Figur 1A).
- Forbered NMGF ved hjelp av følgende oppskrift
For 500 ml of DMEM/F12 Lagerløsning volum endelig konsentrasjon N2 tillegg (10x) 5 ml 1x 250 mg/ml BSA lagerløsning 1 ml 0,5 mg/ml 10 mg/ml Gentamicin reagens 1,25 ml 25 μg/ml 100x antibiotika/antimykotisk 2,5 ml 0,5x 100 mg/ml bFGF 0,1 ml 20 ng/ml 100 mg/ml EGF 0,1 ml 20 ng/ml
- Forbered NMGF ved hjelp av følgende oppskrift
- Overfør nevrosfærer som dannes over 1-3 uker (Figur 1B-E) til friske kolber, for å skille fra vedlagte celler og rusk. Utfør delvise medieendringer hver 3-4.
MERK: Hvis dissosierende ortotopisk xenografttumor ved hjelp av protokollen ovenfor, kan trinn 1.11-1.13 utelates.
2. Glioblastoma Neurosphere Kultur Vedlikehold og nedstrøms applikasjoner
-
Dissosiasjon: Overvåk nevrosfærens kulturer og utfør delvise middels endringer hver 3-4 dager. Når de fleste multicellulære nevrosfærer i kolben når 100 μm i diameter, dissosierer i en enkelt celle suspensjon:
- Overfør mediet som inneholder nevrosfærene til et 15 ml rør, tyngdekraftssediment nevrosfærene i ca. 5 min, fjern mediet og resuspend cellepellet i 10 ml kalsium- og magnesiumfri DPBS.
- Bland og inkuber i 10 min ved romtemperatur, da cellene sedimenterer med tyngdekraften.
- Fjern 7-8 ml DPBS og fjern deretter nevrosfærene mekanisk med en prewetted serologisk pipette.
- Pellet de dissosierte cellene ved 800 x g i 5 min ved 4 °C.
- Passaging: Resuspend de dissosierte cellene (trinn 2.1.) i NMGF og del inn i det nødvendige antall kolber (1:3), og inkuber under standardforhold. Sekundære nevrosfærer vil dannes, og bør deretter dissosieres for dannelsen av tertiære sfærer.
- Vurdering av langsiktig selvfornyelse: Gjenta dissosiasjonsprosedyren til nevrosfærens kultur oppnår minst 10 passasjer, tilsvarende minst 2 måneder i kultur.
-
Frysing: For å kryopreservere nevrosfærene, dissosiere nevrosfærene (trinn 2.1.) og resuspendere cellepellet i Recovery Cell Freezing Medium, aliquot i kryoblamer, sakte fryse og lagre i flytende nitrogen.
- For å dyrke nevrosfæreceller fra en frossen bestand: tine cellene ved 37 °C og overfør umiddelbart til et 15 ml rør som inneholder 10 ml DMEM/F12. Bland røret forsiktig og snurr deretter cellene ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Vask cellepellet en gang til og resuspend cellene i NMGF og overfør til en T25 vev kultur kolbe.
-
Cellefjæring for intrakranielt implantat i immunkompromittert mus:
- Fjern nevrosfærene (trinn 2.1.) og resuspender cellepelleten i kalsium- og magnesiumfri DPBS. Tell levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer og trypan blå ekskludering.
- Beregn antall celler som trengs for implantat, vanligvis 3 x 105 celler/mus, overfør ønsket antall celler til et hetteglass, og pellet cellene ved 1000 x g.
- Resuspend cellepellet i et volum som passer for implantat (5 μl/mus) ved å trykke forsiktig på mikrocentrifugerøret. Plasser cellefjæringen på is og bruk innen 2 timer.
3. Alternativ protokoll for culturing tumorigenic Glioblastoma Celler (for tilfeller der nevrosfæren kultur mislykkes)
- Suppler NMGF-mediet med foster bovint serum til en endelig konsentrasjon på 2% FBS / NMGF.
- Starter med celler i NMGF-kultur: Høst levedyktige celler fra NMGF-kolben (figur 1F), resuspend i 2% FBS / NMGF og plate ved relativt lav tetthet (<1 x 105 celler / ml) i en vanlig T25 vevskulturflaske, og kultur under standardforhold, 5% CO2, 37 °C, fuktet vevskulturinkubator (Figur 1G).
- Starter med frosne aldri dyrkede celler (trinn 1.14.): Tine cellene, vask i serumfritt medium og plate i 2% FBS / NMGF og kultur som beskrevet i trinn 3.2. Culturing i NMGF i 3 dager før overføring av levedyktige celler til 2% FBS / NMGF er et alternativ til å forhåndsvelge bort differensierte celler.
4. Morfologisk og molekylær analyse av nevrosfærer ved immunhiistokjemi
- Kultur nevrosfærene til de fleste flytende multicellulære sfæroider når 100 μm diameter.
- Fjern kulturflasker fra inkubatoren og pellet umiddelbart nevrosfærene, fjern medium og tilsett 10 ml DPBS uten å forstyrre pelletsen. Fjern DPBS, resuspend i 10% nøytral bufret formalin og inkuber i 20 min ved romtemperatur.
- Pellet sfæroidene, resuspend i 30% etanol og inkubere i 30-45 min.
- Erstatt 30% etanol med 50% etanol, inkuber i 15 min og erstatt med frisk 50% etanol, inkuber ytterligere 30 min.
- Gjenta (trinn 4.4.) med 70% etanol.
- Erstatt med 95% etanol to endringer 10-20 min hver, og gjenta med absolutt etanol til sfæroider er lyse hvite og kondensert.
- Lag en liten filterpapirkegle ut av linsepapir og legg den i en liten trakt i et beger. Fukt linsepapiret med absolutt alkohol.
- Løsne pelletsen litt med frisk 100% etanol, hell av overflødig etanol og hell sfæroidene gjennom linsepapirkjeglen, og sørg for at de går til spissen av kjeglen. Skyll røret med ekstra absolutt etanol og hell eventuelle gjenværende sfæroider gjennom linsepapirkjeglen.
- Fjern papirkjeglen fra trakten og flytt forsiktig sfæroidene inn i bunnen av kjeglen. Brett papiret inn i en firkant og sørg for at sfæroidene er så godt omsluttet som mulig.
- Overfør de pakkede nevrosfærene til en kassett og overfør til en automatisk vevsprosessor.
- Programmer den automatiske vevsprosessoren som følger: absolutt etanol, 10 min, xylen, 15 min (2x), paraffin, 10 min (4x).
- Fjern kassetten fra prosessoren og plasser den på den oppvarmede delen av et parafininnbyggingssystem . Pass på at hele overflaten er fri for fragmenter, støv eller annet rusk og sippe ut all parafin fra tangoppvarmingsbrønnene. Varm rene parafinfrie tang og legg til en liten mengde paraffin til en oppvarmet baseform.
- Åpne kassetten, fjern pakken og plasser den på den oppvarmede delen av innebyggingssystemet. Åpne papirkjeglen forsiktig til sfæroidene er synlige. Samle så mye av materialet som mulig med forhåndsvarslede tang og overfør til den flytende parafinen i baseformen.
- Gjenta etter behov for å hente så mange av sfæroidene som mulig. Skrap forsiktig vevspapiret med et forhåndsvarslet rent barberblad som har blitt tørket med etanol for å samle eventuelle gjenværende sfæroider uten å få noe papir inn i blokken.
- Bryt forsiktig opp eventuelle sfæroid klumper med varme tang. Flytt sfæroidene bort fra hjørnene til et ensartet sentralt lag. Flytt bunnformen til kjøleområdet for å feste sfæroidene på plass, tilsett kassetten, fyll sakte med parafin og slapp av grundig.
- Nevrosfærens parafinblokk kan brukes til normal seksjonering og immunhiistokjemi.
Representative Results
Vi har brukt protokollen beskrevet ovenfor for å dissosiere og kultur 125 ferske kirurgiske glioblastomprøver (figur 1), 88 nylig diagnostiserte og 37 tilbakevendende svulster (tabell 2), med godkjent pasientsamtykke og under institusjonelle retningslinjer. Effektiviteten av protokollen for å etablere langsiktige nevrosfærekulturer var 41,6%, og lik for nylig diagnostiserte svulster og tilbakevendende svulster (Tabell 2). For noen GBM-prøver dannes nevrosfærer i løpet av de første dagene (Figur 1B og 1C), mens det for andre kreves lengre dyrkingstid (Figur 1D og 1E).
Effektiviteten av nevrosfæredannelse var ikke utelukkende avhengig av nivået av nekrose i vevet, som eksemplifisert av resultatene fra en nylig diagnostisert svulst med høy celletetthet (GBM1) og en tilbakevendende og nekrotisk svulst (GBM2) behandlet i henhold til protokoll 1 og 2, som begge gir nevrosfærekulturer (Figur 2).
Testing av det tumorigeniske potensialet til hver nevrosfærekultur hos immunkompromitterte mus er den avgjørende valideringen av denne tilnærmingen for berikelse av CSC. Ved hjelp av en protokoll som ligner på tidligere beskrevet18, ble GBM1 og GBM2 nevrosfærer implantert i hjernen til immunkompromitterte mus, under institusjonelle og IACUC dyrepleieretningslinjer. Xenograft-svulstene presenterer morfologiske egenskaper ved GBM-er, for eksempel invasjon i hjernens parenchyma og nekrose (figur 2).
GBM3 ble dissosiert (figur 1A) og dyrket i nevrosfæremedium (figur 1D og 1E), og i 2 % FBS/NMGF (figur 1D, 1G og 1H). Monolayerceller dyrket i 2% FBS / NMGF og nevrosfæreceller dyrket i NMGF ble dissosiert og samme antall celler ble implantert i naken mus, ved hjelp av samme prosedyre som i figur 2. Det ble ikke observert forskjeller i overlevelse, tumorvekstdynamikk eller morfologi mellom de to preimplantkulturmetodene (Figur 3A-C). Tumorvekstegenskaper endres ikke opp til den siste passasjen som er testet, P20 for nevrosfærer og P10 for 2% FBS / NMGF. Mens nevrale stamcellemarkører, inkludert Sox2, er nedregulert i de fleste primære GBM-celler dyrket i 10% FBS 3,4,11, NMGF supplert med 2% FBS tillater oppbevaring av Sox2 uttrykk (Figur 3D).
Nevrosfærer ble behandlet i henhold til protokoll 4, og merket med H&E (figur 4A), anti-Sox2 antistoff, som viser kjernefysisk lokalisering (figur 4B) og EGFR-antistoff, lokalisering av cellemembran (figur 4C). Denne protokollen er brukt for å få tilgang til stimuliavhengige endringer i uttrykket av nestin, GFAP og spredningsmarkøren Ki6711.
Tabell 2. Effektivitet av å utlede langsiktige selvfornyende nevrosfærekulturer fra GBM-er.
| Patologi | N. | Prosentandel av prøver som gir langsiktige selvfornyende nevrosfærer (n) |
| Glioblastom - ubehandlet, første operasjon | 88 | 42.0% (37) |
| Glioblastom - tilbakevendende | 37 | 40.5% (15) |
| total | 125 | 41.6% (52) |
Figur 1. Cellekultur fra friske glioblastom kirurgiske prøver. Friske svulster blir enzymatisk dissosiert i enkeltceller. Nukleert cellegrensesnitt fra tetthetsseparasjonsmedium blir deretter belagt i NMGF. Dissosierte nevrosfærer er belagt i NMGF, og vanligvis 1 dag etter plating er det døde celler, rusk, vedlagte enkeltceller og sporadiske delingsceller i suspensjon (A). Nevrosfæredannelse er raskere for noen tilfeller (B, C), og langsommere for andre (D, E). Alle nevrosfærer er dissosierte og replated for minst 10 passasjer, 41,6% GBMs gir langsiktige selvfornyende nevrosfærer. Levedyktige GBM dissosierte celler som ikke vokser som nevrosfærer (F) kan overføres til alternative kulturforhold, for eksempel 2% FBS / NMGF (G, H). Stolpe (A), 100 μm, gjelder for alle bilder. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Neurosphere generasjon og ortotopiske mus xenografts fra GBM svulster. En tumorprøve som presenterer høy celletetthet (GBM1) og en svulst med høyt nekrotisk innhold (GBM2) ble dissosiert og nevrosfærer dyrket for 10 passasjer i henhold til protokoll 1 og 2. Immunkompromitterte mus ble implantert med 3 x 105 dissosierte nevrosfæreceller og ofret når de var dødelige. Musehjerner var formalinfaste og parafin innebygd for H&E farging og immunhiistokjemi deteksjon av menneskelige markører, menneskelige mitokondrier (hMit) eller stor histokompatibilitet klasse I underenhet HLA-A (MHC-I). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Lignende tumorvekst hos mus implantert intracranially med GBM3 celler dyrket som nevrosfærer i NMGF eller som monolayers i 2% FBS / NMGF. (A) Kaplan-Meier overlevelseskurver for GBM3 dyrket som enten nevrosfærer i NMGF eller monolayers i 2% FBS / NMGF (begge passasje <10) viser ingen forskjell i overlevelse (n = 10, p = 0,7174, log-rank test). (B) Tumorvekst overvåket av levende bioluminescensavbildning (BLI) viser ingen signifikant forskjell i tumorvekstdynamikk mellom de to gruppene. (C) Tumormorfologi kan ikke skilles fra 4 GBM3 xenografter, 2 dyrket i NMGF og 2 dyrket i 2% FBS/NMGF. MHC-I-flekk som beskrevet for figur 2. Skala, 600 μm. (D) Vestlig blott som viser stamcelleprodusenten Sox2 uttrykk beholdt i 2% FBS / NMGF kulturer som brukes til å initiere xenograft svulster (A-C). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 4. Analyse av proteinuttrykk i nevrosfæreseksjoner ved immunhiistokjemi. Nevrosfærekulturer ble formalin-fikset og parafin innebygd som beskrevet i prosedyre 4, og farget med H&E (A), anti-Sox2 antistoff (B) og anti-EGFR antistoff (C). DAB-substrat ble brukt til å visualisere (B, C). Bar, 20 μm. Klikk her for å vise større bilde.
Discussion
Riktig enzymatisk tumorcelledissosiasjon er et kritisk skritt i denne protokollen. Vevet må hakkes godt før inkubasjon i celledissosiasjonsoppløsning ved 37 °C under rotasjon, i minst 30 minutter, når vevet må tritureres mekanisk og forlengelsen av dissosiasjonen verifiseres. Avhengig av graden av vevssammenheft, kan inkubasjon utvides i ytterligere 15-30 minutter, etter behov for å fullføre dissosiasjon i enkeltceller. Inkubasjon i dissosiasjonsløsning i mer enn 1 time anbefales ikke på grunn av redusert celle levedyktighet. Selv om den optimale mengden startvev er 200-500 mg, har denne protokollen ført til vellykkede nevrosfærekulturer fra så lite som 50 mg tumorvev.
Serumfri NMGF er et selektivt medium, og en prosentandel av neoplastiske celler som består av hoveddelen av svulsten, samt vertsceller, vil ikke overleve, mens andre vil feste seg til vevskulturbehandlet kolbe etter plating. Det er kritisk at nevrosfærene som vil danne seg over 1-3 uker (Figur 1B-E) overføres til friske kolber, for å skille seg fra differensierte tumorceller og rusk.
GBM-celler enzymatisk dissosiert og aldri kultivert (trinn 1.10) kan kryopreserveres som en reservekilde for celler til kultur i alternative medier, i tilfelle nevrosfærens kultur mislykkes. Vi har lykkes med å skaffe nevrosfærekulturer fra slike frosne bestander, samt monolayerceller som vokser i 2% FBS / NMGF.
Konseptuelt er "kreft stamcelle" et pågående arbeid, og dette fremvoksende feltet vil dra nytte av ytterligere avklaring, siden de kliniske implikasjonene er betydelige, spesielt i genereringen av tumor heterogenitet, plastisitet og motstand mot terapi19,20. I tillegg til å være avgjørende for å generere pasientspesifikke GBM-dyremodeller, er nevrosfærens kulturer også verdifulle for in vitro-studier som endring i cellesignalering og genuttrykk som svar på vekstfaktorer, hypoksi og farmakologiske midler11,21. Vi har valgt å bruke tverrsnitt av formalin faste og paraffin innebygde nevrosfærer, bevare 3D-arkitekturen, for å studere proteinuttrykk og post-translasjonelle modifikasjoner ved immunhiistokjemi11, på grunn av overlegen subcellulær lokalisering i forhold til den mer vanlige metoden for merking og avbildning av hele sfæren.
Det har vist seg at ikke alle celler innen nevrosfærer avledet fra voksen pattedyrhjerne er stamceller22. På samme måte er nevrosfærene dyrket fra GBM svulster sannsynligvis ikke kloniske, på grunn av tilstedeværelsen av mer differensierte kreftforfedrederceller og selvaggregering, kjent for å forekomme ved høye celletettheter23, som regnes som en begrensning av denne metoden av noen. For å favorisere berikelse for langsiktige selvfornyende stamceller, i motsetning til bare forfedre som midlertidig kan vokse som nevrosfærer22, blir de primære nevrosfærene dissosiert for sekundær nevrosfæredannelse, og videre passerer i minst 10 passasjer, omtrent tilsvarende 2 måneder i kontinuerlig kultur, noe som er en indikasjon på en befolkning beriket i stamceller22. Vår erfaring er at GBM-nevrosfærekulturer som oppnår dette merket, kan fortsette å ekspandere som nevrosfærer på ubestemt tid. Tumor karakter betyr noe, siden vi har fått vellykkede kulturer fra GBMs og anaplastiske astrocytomas, WHO klasse IV og III, henholdsvis, men ikke fra lavere klasse gliomas.
Den mest utbredte metoden for å dyrke glioblastomceller, i tradisjonelt vekstmedium supplert med 10% FBS, fører til betydelig genomisk og fenotypisk divergens fra de opprinnelige svulstene 4. På den annen side er nevrosfærekulturer en stabil og langsiktig kilde til celler som presenterer kreft stamcelle fenotype4. Nevrosfæren metoden har blitt stadig mer populær for berikelse av CSC i langsiktige kulturer for ortotopiske mus xenograft modeller, til tross for ikke å lykkes for alle høyverdige astrocytomprøver, som representerer den viktigste svakheten ved denne metoden. Studier for å forstå hvordan molekylære egenskaper ved foreldresvulstene kan påvirke nevrosfærens dannelse er i gang. Utforskning av praktiske alternative metoder for å dyrke høyverdige gliomer, etterfulgt av omfattende validering, er gitt de bemerkelsesverdige fordelene ved å ha pasientspesifikke GBM-modeller, når vi går inn i en epoke med personlig medisin, drevet av tilgjengeligheten av "omics" -informasjon og økt antall potensielle målrettede terapier.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet har blitt finansiert av Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
- Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
- Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
- Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
- deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
- Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
- Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
- Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
- Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
