Summary
在这里，我们描述了一种表型检测，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化合物和 结核 分枝杆菌突变库的高通量/高含量屏幕。该方法依靠使用自动共聚焦显微镜检测荧光标记的荧光结 核分枝杆菌 。
Abstract
尽管有治疗和疫苗，结核病（TB）仍然是世界上最致命和最普遍的细菌感染之一。几十年来，多重耐药菌株的突然爆发对结核病的控制构成了严重威胁。因此，必须确定新的靶点和途径，对结核病的致病剂，结核分枝杆菌（Mtb）至关重要，并寻找可能成为结核病药物的新化学物质。一种方法是建立适合大型图书馆的基因和化学屏幕的方法，以便在大海捞针。为此，我们开发了一种表型检测，依靠使用自动共焦显微镜检测荧光标记的Mtb。这种体外测定允许对Mtb的殖民化过程进行基于图像的定量，并针对 384 井微板格式进行了优化，该格式适合锡RNA、化合物或Mtb突变库的屏幕。然后对图像进行多参数分析处理，从而提供主机单元内Mtb发病机理的读取推断。
Introduction
在过去几年报告的新兴和重新出现的传染性病原体中，结核病分枝杆菌（Mtb）在2011年造成140万人死亡和870万新感染（2012年全球结核病报告，www.who.int/topics/tuberculosis/en/）中占有突出地位。尽管有多种药物疗法，感染人数仍在上升，耐多药（MDR）以及广泛耐药（XDR）Mtb正在迅速蔓延到世界各地1。 此外，在考虑Mtb抗原的存在时，很明显，全球三分之一的人口被认为是潜在的感染Mtb。 据统计，在十分之一的病例中，有1个病例正在向该病的活跃形式发展，随后出现临床症状2。因此，迫切需要新的手段来打击Mtb。在此背景下，我们开发了一种体外视觉表型检测，依靠自动共聚焦荧光显微镜3监测Mtb入侵并繁殖成宿主细胞。将检测结果与自动图像采集和分析相结合，在 384 井微晶板中进行适应，允许对化合物、硅RNA 和细菌突变体的中尺度库进行高含量/高通量筛选 （HC/HTS）。因此，在这种表型检测上筛选一个基因组宽的RNAi库，能够识别与Mtb贩运和细胞内复制有关的关键宿主因素，并能够阐明块茎杆菌利用的宿主通路。这种特殊的表型检测的另一个适应是识别细菌因素，这些细菌因素对Mtb内法戈索马尔的持久性至关重要。例如，逮捕法戈索姆成熟被认为是促进Mtb在巨噬细胞中生存和复制的主要机制之一。监测荧光标记酸性隔间中Mtb淘汰突变体的亚细胞定位，使参与生存过程的细菌基因得以识别。最后，Mtb的高含量成像也为量化药物效率提供了一个很好的方法，用于抑制细胞内细菌生长3等各种现象。总之，这种高通量表型检测可以加速对结核病的药物发现，这些不同方法收集的数据有助于更好地了解Mtb施加的宿主操纵。
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Protocol
1. 高通量全基因组硅纳筛查
在感染Mtb H37Rv表达绿色荧光蛋白（GFP）时，在人类II型肺炎细胞模型A549细胞系中进行筛查。此过程在图 1A中概述。
- 用 1x siRNA 缓冲器重新存放在母板 （96 井板） 中的干燥硅纳库，以达到 4 μM 的浓度，然后将 10 μl 的混合物转移到 384 井女儿板（女儿板 1）中。
- 在女儿板 1 中加入 10μl 的 1x siRNA 缓冲区，将 siRNA 稀释 2 倍。siRNA 悬念后，板材用可剥落的铝密封密封，可存储在 -20 °C 至少 6 个月和长达 2-3 年，但存储时间可能会因 siRNA 库制造商的建议而异。
- 将女儿板 1 中的 siRNA 稀释成女儿板 2，以达到 500 nM 的浓度。siRNA 悬念后，板材用可剥落的铝密封密封，可存储在 -20 °C 至少 6 个月和长达 2-3 年，但存储时间可能会因 siRNA 库制造商的建议而异。
- 使用前，在室温下解冻女儿板2。
- 从女儿板 2 中取 2.5μl 的 siRNA，放入 384 井检测板中。
- 在第 1.5 步的同一 384 井检测板中，在各自的井中添加 2.5μl 负和正控制 siRNA。
- 将转染试剂稀释为 1x D-PBS，以产生足够的溶液，在每口井中提供 0.1μl 变异试剂，并在室温下预孵化稀释的输血液 5 分钟。
- 在检测板中将 7.5 μl 的转染试剂/PBS 溶液混合物添加到每个井中，并在室温下孵育 30 分钟。
- 加入40μl的A549细胞（1，500个细胞/井）悬浮在RPMI 1640中等补充10%胎儿牛血清（FBS）。在含有5%CO2的大气中，将细胞保持在37°C的3天潜伏期。这些细胞每24小时分裂一次，因此大约12，000个细胞在输血后三天在井中。
- 通过离心处理4，000 x g 5分钟，用D-PBS（从MgCl2和CaCl2免费）清洗两周前的GFP表达Mtb H37Rv培养物，并丢弃洗涤。重复此步骤 3 倍（对于GFP-Mtb H37Rv 文化条件，请参阅协议 3）。
- 将细菌颗粒悬浮在 10 毫升 RPMI 1640 中等，并辅以 10% FBS，在室温下减速 1 小时，使细菌聚集物沉积物。
- 收集细菌超自然物，并使用微板读卡器测量 OD600（OD 600应在 0.6-0.8 之间）和 GFP 荧光 （RFU 值），以确定细菌浓度。使用显示 RFU 值 = f （CFU 值） 的参考回归线计算悬架的滴定器，该线是在对在相同条件下准备的另一种文化进行实验之前生成的。准备含有2.4 x 106细菌/毫升的细菌悬浮，这相当于5的多种感染（MOI）。
- 取出 384 井检测板中的介质，并加入 25 μl 的新鲜制备细菌悬浮剂。
- 在含有5%CO2的大气中，在37°C的384井检测板中孵化5小时。
- 取出介质，轻轻清洗细胞与RPMI介质补充10%FBS 3倍。
- 要杀死剩余的细胞外细菌，请在含有 5% CO 2 的大气中，在含有 5% CO2的大气中，用含有 50μg/ml 的阿米卡辛的新鲜 RPMI-FBS 介质治疗细胞，时间为 1 小时。
- 去除中等含阿米卡辛，并加入50μl的新鲜RPMI介质补充10%FBS。在含有5%CO2的大气中，在37°C下孵化384井检测板5天。
- 在图像采集之前，在 PBS 中加入 10 μl 的新鲜制备的 30 μg/ml DAPI（最终浓度 5 μg/ml），并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
- 将板加载到自动对焦显微镜中。
单击此处查看更大的图像。 - 设置曝光参数。使用激发激光 405 nm 记录 DAPI 荧光，使用发射滤光片 450 nm，使用激发激光 488 nm 记录 GFP 荧光，发射滤波器 520 nm。
单击此处查看更大的图像。
单击此处查看更大的图像。 - 选择每口油井中的油井和要收购的油田，然后称为布局和子布局参数。
单击此处查看更大的图像。
单击此处查看更大的图像。 - 使用步骤 1.20 和 1.21 中的参数生成实验文件，并运行自动采集。
单击此处查看更大的图像。
单击此处查看更大的图像。 - 将图像传输到远程服务器。
单击此处查看更大的图像。 - 使用图像分析软件评估图像。使用核检测算法从DAPI通道检测细胞核，使用像素强度属性算法（图4A）从GFP通道检测细菌区域。
注意：此协议进行了优化，以研究基因沉默对细胞内 Mtb 生长的影响。 Mtb 是一种生长缓慢的细菌，每 20 小时在最佳条件下分裂一次。感染后5天，在没有细胞裂解的情况下，细胞外 Mtb 的量仍然很低，不影响分析的质量。该协议必须优化抗生素治疗的长度和潜伏时间，以便使用快速生长的细菌，如 小分枝杆菌和大肠杆菌 ，广泛释放，可以感染新的细胞，以适应siRNA屏幕。
2. 高通量化合物筛选
在受感染的宿主细胞上进行筛查。此过程在图 1B 中概述。
- 解冻含有复合库的 384 井母板， 溶解在 DMSO 100% 中。在含有 10 μl 的 RPMI 1640 介质中，在 384 井女儿板中转移 0.5 μl 化合物，并辅以 10% FBS。
- 通过离心处理4，000 x g 5分钟，用D-PBS（从MgCl2和CaCl2免费）清洗两周前的GFP表达Mtb H37Rv培养物，并丢弃洗涤。重复此步骤 3 倍（有关GFP-Mtb H37Rv 文化条件，请参阅协议 3）。
- 将细菌颗粒悬浮在 10 毫升 RPMI 1640 中等，并辅以 10% FBS，在室温下减速 1 小时，使细菌聚集物沉积物。
- 收集细菌超自然物，并使用微板读卡器测量 OD600（OD 600应在 0.6-0.8 之间）和 GFP 荧光 （RFU 值）。使用显示 RFU 值 = f （CFU 值） 的参考回归线计算悬架的滴度，该线在实验前已生成。典型浓度为1×108细菌/毫升。
- 收获6天大的原发性人类巨噬细胞在4×10 5 细胞/毫升RPMI 1640中等补充10%胎儿牛血清（FBS）和50 ng/ml重组人类M-CSF（对于人类周围血单细胞细胞净化和巨噬细胞分化见协议4）。
- 在不同的 MOI 中用巴西利孵育稀释的原细胞，范围从 1-5，在 90 rpm 温和摇晃，在 37 °C 时 2 小时。
- 通过离心清洗受感染的细胞350 x g，去除细胞外细菌。每次离心步骤后，在RPMI 1640中等中重新吸收颗粒，并辅以10%FBS。重复此步骤2倍。
- 暂停在RPMI 1640中等感染细胞补充10%FBS和阿米卡辛在50μg/ml和孵育悬浮与轻度摇晃1小时在37°C。
- 通过离心350 x g去除含有阿米卡辛的细胞培养介质，用完整的RPMI 1640介质清洗受感染的细胞，并辅以10%FBS和50 ng/ml重组人类M-CSF。重复一次。
- 在第 2.1 步中，在同一检测板中加入 40 μl 受感染的巨噬细胞悬浮液，该板已包含 10 μl 的复合稀释。目前，每口油井的DMSO最终浓度已达1%。
- 在含有 5% CO2的大气中，在 37 °C 下孵化检测板 5 天。
- 用细胞渗透的远红荧光染料染色活细胞。
- 将板加载到自动对焦显微镜中。
单击此处查看更大的图像。 - 设置曝光参数。使用激发激光 640 nm 记录远红荧光，使用发射滤光片 690 nm，使用激发激光 488 nm 记录 GFP 荧光，发射滤波器 520 nm。
单击此处查看更大的图像。
单击此处查看更大的图像。 - 选择每口油井中的油井和要收购的油田，然后称为布局和子布局参数。
单击此处查看更大的图像。
单击此处查看更大的图像。 - 使用步骤 2.14 和 2.15 中的参数生成实验文件，并运行自动采集。
单击此处查看更大的图像。
单击此处查看更大的图像。 - 将图像传输到远程服务器。
单击此处查看更大的图像。 - 使用图像分析软件评估图像。使用像素强度属性算法检测远红色通道的细胞区域，使用像素强度属性算法（图 4B）从 GFP 通道检测细菌区域。
注意：此协议可以通过用表达荧光蛋白（一口井/一个突变体）的突变体取代化合物来适应 Mtb 突变库筛选（图 1C，另见布罗丁等人） 。4）。 荧光突变体首先在井中播种（每口井20微克细菌悬浮）。然后，细菌通过30微克的细胞悬浮恢复。在离心350 x g下1分钟后，板在含有5%CO2的大气中以37°C孵育。孵化时间和 MOI 取决于检测。例如，对于早期细胞事件（如噬菌体酸化）的可视化，这些细胞可以感染 2 小时，MOI 范围为 1-20。溶酶体在含有 5%CO 2 的大气中使用 Lysotracker 染料在 2 μM 上染色 1.5 小时，在 37 °C 处，然后用 10% 甲醛或 4% 甲醛 （PFA） 固定。使用具有适当算法的图像分析脚本获取并最终分析共焦图像，用于溶酶体检测和亚细胞本地化4。
3. 绿色荧光蛋白表达结 核杆菌 H37Rv（GFP-H37Rv）培养条件
对于长期存储，GFP-H37Rv 被冻结在 D-PBS 中（每小瓶约 1 x 108 分枝杆菌）。
- 在含有 50 毫升 7h9 肉汤介质的 Erlenmeyer 烧瓶中补充一个冷冻库存的 GFP-H37Rv 小瓶，辅以米德尔布鲁克 OADC 浓缩 10%、甘油 0.5%、Tween-80 0.05% 和 Hygromycin B（50μg/ml）。
- 在37°C孵化8天。
- 测量 GFP-H37Rv 文化的 OD600。
- 稀释 GFP-H37Rv 文化，以获得 OD600 = 0.1 在新鲜的 7H9 汤介质补充米德尔布鲁克 OADC 浓缩 10%， 甘油 0.5%， 特温 - 80 0.05% 和海格罗霉素 B （50μg/ml）.
- 在用于检测之前，在37°C下孵化GFP-H37Rv 8天以上。
4. 人类外周血单细胞细胞从全血或布菲涂层制剂中净化
- 将血袋稀释2倍于1x D-PBS（不含MgCl2 和CaCl2），包含1%FBS。
- 通过菲科尔密度梯度离心分离单核细胞400 x g 20分钟。
- 收集孤立的单核细胞。
- 用 1 倍 D-PBS（从 MgCl 2 和 CaCl2 中免费）清洗单核细胞3倍，在室温下在 400 x g 处离心 10 分钟，含有 1% FBS。
- 将细胞浓缩至 1 x 107 细胞/毫升。
- 根据制造商的协议，使用 CD14 磁珠净化单核细胞（参见材料）。
- CD14单核细胞纯化后，在RPMI 1640中以1.5×10 6 细胞/毫升的种子将细胞播种，辅以10%FBS和40 ng/ml的人类巨噬细胞群细胞刺激因子（hM-CSF），在含有5%CO2的大气中以37°C孵育4天。
- 4天后，用新鲜的RPMI 1640取代介质，辅以10%的FBS和40 ng/毫升的hM-CSF，并在含有5%CO2的大气中以37°C孵育2天。
- 6天后，细胞可用于检测。
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Representative Results
高通量全基因组硅纳筛查
Mtb 能够 在体外 和其他几个肺上皮细胞中殖民免疫细胞。例如 ，Mtb能够感染和破坏通常用作人类 II 型肺细胞5-7模型的 A549 上皮细胞。Dectin-1被报告为主机细胞受体，参与 Mtb 吸收，增生反应和抗菌作用细胞内分枝杆菌生长在A549细胞8。第 1 号协议中描述的 siRNA 条件导致 85% 的沉默效率（未显示数据）。用siRNA沉默十进制-1表达导致A549细胞细胞细胞内分枝杆菌量减少。事实上，经过3天的沉默和5天的感染后，受感染细胞的百分比在Dectin-1沉默的A549细胞中两次减少，相比之下，与非目标争夺siRNA（图2A 和 2B）传播的细胞相比。我们应用了基于样本的siRNA靶向德汀-1的规范化，相比之下，争先恐后地定义Z-分数。如 图2C所示，我们获得了锡RNA靶向德汀-1的Z-分数平均值-15左右。Dectin-1 可用作 siRNA 屏幕的正控制，以发现在肺细胞中 Mtb 殖民化中涉及的其他新颖宿主因子，这些宿主因子的表型可能与德汀锡RNA 相同。在屏幕中，使用影响表型的 siRNA 作为对每个微板的控制，可以使每个板正常化，当想要执行全基因组屏幕分析时，这很有用。统计参数 Z'是 0.1 使用基于争夺和 siRNA 靶向 Dectin1 的控制正常化，这是 siRNA 筛选数据验证的可接受值。
高含量复合筛选
通过建立剂量反应曲线 （DRC） 来评估细胞内细菌生长的化合物效率，并标准化为参考正化合物和负复合溶剂控制。代表刚果民主共和国的两种参考化合物，伊索尼亚齐德（INH）和里芬平（RIF），积极反对 Mtb 增长显示在 图3。这些曲线在感染GFP表达 Mtb H37Rv菌株的人类原发性巨噬细胞中获得，感染后5天后读出。DMSO 和 INH 的最终浓度分别为 1% 和 0.1 μg/ml，通常用作负对照和正控，提供基础效率水平 （0 和 100%）（图3A） 。在 图4B中详细描述的图像分析过程后，从自动共聚焦显微镜拍摄的受感染人类巨噬细胞的共聚焦荧光图像中提取多参数数据。影响 Mtb 在宿主细胞中的细胞内复制的活性化合物导致分枝体负荷的减少，这相当于图片上细胞中GFP信号的区域（图3B）。细胞内细菌区与总细胞面积之间的比率，使用基于图像的分析软件计算，以复合浓度的功能绘制，产生刚果民主共和国（图3B）。这些曲线可以确定减少细菌负荷所需的浓度 50% （IC50）和抑制 99% 的细菌复制所需的最小浓度 （MIC99） （图 3C）。Z'基于控制DMSO 1%，控制 INH 0.1μg/ml 为 0.49。此 Z'，非常接近 0.5，可以验证此检测。
图1。视觉高内容筛选方法。用于锡RNA（A）、化合物（B）和Mtb突变体（C）屏幕的Mtb感染模型系统的示意图表示。（A） siRNA 库屏幕：细胞在 384 井板中使用反向传输方法与 siRNA 变电 3 天。siRNA转感染细胞感染了GFP-Mtb，并在含有5%CO2的大气中以37°C孵育了5天。然后，这些细胞被染色，图像被使用自动共聚焦显微镜收集。（B） 化合物库屏幕：化合物分布在384井板中。细胞悬架和GFP-Mtb在37°C下一起孵育2小时。 受感染的细胞在板中播种，在含有5%CO2的大气中以37°C孵育5天。然后，这些细胞被染色，图像被使用自动共聚焦显微镜收集。（C） 荧光-Mtb突变库：荧光Mtb突变体在384井板中播种，并分配主机细胞悬架。孵化时间因检测而异。细胞或细胞网状网状物在自动图像采集前被染色。单击此处查看更大的图像。
图2。德汀-1沉默对A549细胞的Mtb殖民化有影响。（A） A549细胞的代表共焦图像（10倍空气透镜）与非定向硅纳（混频）或锡RNA特定于德汀-1，并感染了GFP-Mtb H37Rv（MOI5）5天。比例杆表示 200μm （A）GFP-Mtb H37Rv 以绿色可视化，细胞为红色。使用基于图像的分析软件确定细胞数量（A.细胞检测）和细胞内 GFP-Mtb H37Rv 负载（A.细菌区）。（B） 在 Scramble siRNA （蓝色圆圈） 和德汀 - 1 siRNA （红圆） 的 5 个复制品 （w1 到 w5） 中，受感染的 A549 细胞的百分比的图形表示。（C） 乱思思纳和德廷 -1 西纳的 Z 得分平均值的图形表示。（***价值<0.0001）。单击此处查看更大的图像。
图3。人类巨噬细胞中对Mtb的活性参考化合物的剂量响应曲线。（A和B） 具有代表性的人类巨噬细胞（红色、带有红色荧光染料标记的细胞）的凸起图像（20 倍水透镜）感染了 GFP-Mtb H37Rv（绿色），带有 MOI1 5 天。比例栏表示 50μm。（A） 用DMSO 1%孵育的受感染细胞图像在检测中用作负控制。（B） 随着两种参考化合物异种素 （INH） 和里芬平 （RIF） 浓度的增加而孵育的受感染细胞的图像。（C） INH 和 RIF 的剂量响应曲线 （DRC）。基于图像的分析允许对测试的每种化合物进行刚果民主共和国的确定。DRC 表示细胞内 GFP 细菌区与总细胞区 （Y 轴）之间的化合物浓度（日志比例、x 轴）之间的比率。在每张图中，化合物的刚果民主共和国标准化为负控制 DMSO 1% （0% 抑制）和浓度为 0.1μg/ml （100% 抑制） 的正控制 INH。对于每种化合物，从刚果民主共和国计算出抑制细菌殖民化（IC50）和最低抑制浓度（MIC99）所需的浓度。单击此处查看更大的图像。
图4。基于图像的标准分析，以确定荧光细胞内分枝杆菌。 使用自动共聚焦显微镜从 384 井板获取图像。在这种情况下，记录了同一油井（场）的4张不同图像。然后使用基于图像的分析软件阿卡佩拉 2.6 （珀金埃尔默） 分析每个字段。（A） 每个字段包含两个通道（两种颜色），一种用于细菌（绿色），另一种用于细胞核（蓝色通道），使用以下算法进行细分 ：i） 使用内置的阿卡佩拉程序进行核检测， ii） 细胞质检测，基于细胞核种群，使用内置的阿卡佩拉程序 ，iii）细菌检测，只保持强度高于手动定义阈值的像素 ，iv）将细胞位置与细菌位置合并以确定受感染的细胞。最终结果，表示为四个领域的平均值，是细菌总面积，细胞总数，受感染细胞的百分比和每个细胞的细菌面积（所有受感染细胞的平均值）。（B） 每个字段包含两个通道，一个用于细菌（绿色通道），一个用于细胞核和细胞质（远红通道），使用以下算法进行细分 ：i） 使用防中位数过滤器过滤原始通道， ii） 只保留强度高于手动定义阈值的像素（每个通道都有自己的阈值 ），iii）计算每个通道的剩余像素数 ，iv）合并通道并计算细菌和核共享的像素数量，以量化细胞内细菌。最终结果，表示为四个领域的平均值，是细菌总面积、细胞总面积、细胞内细菌总面积以及细胞内细菌面积与细胞总面积之间的比率。 单击此处查看更大的图像。
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Discussion
我们在这里描述使用 GFP 表达 Mtb H37Rv 菌株感染荧光标记主机单元所需的表型检测方法，使其适合高含量/高通量屏幕。该协议可应用于广泛的化合物、荧光探头和 Mtb 突变体。对于上述每个协议，可以在图像采集之前执行固定和免疫标记步骤。我们使用配备 20X （NA 0.70） 或 60X （NA 1.2） 水透镜的自动荧光同焦显微镜来获取图像。共焦显微镜配备了405、488、561和640纳米激发激光器。发射的荧光是使用3个摄像头捕获的，这些摄像机与一组覆盖450-690 nm的检测波长的过滤器相关。需要注意的是，显微镜激发和发射设置的调整取决于每个实验中使用的染料或荧光素的类型。对于表型检测，DAPI 或 Hoechst 通常以 5 μg/ml 的速度使用，持续 10 分钟以弄脏核。然而，细胞也可以染色不同的荧光染料，专门用于检测细胞质，膜或细胞细胞细胞。图像采集后，应使用基于图像的分析软件对图片进行分析。应使用基于每个像素强度的细胞分割算法，分别确定细胞数量或细胞内细菌区域（见 图 4）。生成的数据应与基于统计的接受标准进行权衡，以验证分析的稳健性和准确性。
大型高通量屏幕是耗时、耗油的实验。因此，事先评估测定是否合适至关重要。从表型屏幕收集的数据使用 Excel 等电子表格软件可视化，并且通常每个板正常化。用于 siRNA 和小分子屏幕的最常见质量指标是 Z。Z 的定义是正控和负控的均值和标准偏差9。Z 量化检测响应是否足够大，以验证其对样本全范围屏幕的应用。Z 的范围为负无穷大到 1，> 0.5 作为非常好的检测，> 0 是可接受的检测，< 0 是不可接受的检测。与控制强度允许用 Z > 0.5 验证检测的小分子屏幕相比，siRNA 屏幕的变异性对 Z 的影响较低（通常在 0.0-0.5 之间）10。事实上，siRNA屏幕的成功取决于 i）将硅RNA输送到细胞中的效率的优化 ，ii）转染引起的细胞毒性 ，iii）基因沉默效率的检测条件。siRNA可以很容易地在各种细胞系中传播，如 HeLa，遵循制造商的转染协议，但某些细胞系（包括巨噬细胞）中有效的 siRNA 转染仍然是一个挑战。然而，病毒载体介质表达短发夹RNA（shRNA）可以代表一个很好的替代11。为了避免解释的困难，从 siRNA 屏幕收集的数据通常与正常标准分布相对正常化，以定义每个点10，12的 Z 分数（也称为 Z 值）。然后，命中样本根据通常属于 -2 或超过 +2 的 Z 分数进行排名。最后，在主屏幕上选定的点击率在第二个屏幕上重新测试，包括更多的复制，以确认在主屏幕上观察到的表型。
我们的协议可以很容易地应用于带设备的小屏幕。为此，需要对微滴板进行微缩微缩和分子库的操作，以优化13个分子的保存、分配和混合过程。此外，建议使用自动机器人平台，包括分配器，以便准确和可重复地控制微滴定板中的检测条件。高吞吐量筛选 （HTS） 产生的大量数据也应由数据库和用于对共焦图片、数据存储和传输进行图像分析的调整管道进行管理。本报告中提出的检测结果在生物安全 3 级设施 （BSL3） 中执行。BSL3 中对安全的严格遵守增加了屏幕的难度。事实上，屏幕所需的许多设备必须以 BSL3 提供，并隔离以保护工人和环境免受污染。因此，在BSL3中安装经过改装的管道需要大量的空间。因此，我们的协议被开发为具有最大步骤执行的BSL3，如siRNA转染和复合转移到板。通过图像采集步骤进行的细胞感染是在BSL3条件下进行的。然后，这些图像在专用服务器中传输，并从 BSL3 中分析出来。
此处描述的表型分析基于两种图像分析方法（图 4）。第一种方法，用于siRNA筛查，旨在提供受感染细胞的数量。该参数可有效地比较基因沉默对 Mtb 细胞内复制的影响。然而，在筛选化合物时，基于细胞总面积的更基本的读取足以清楚地识别活性化合物。由于第二种方法更快、更容易实现，因此最好分析化合物筛选产生的图像。为了更进一步，可以添加更多的荧光染料和/或标签探头，并优化图像分析脚本，以生成多参数数据，如同位素化、核和细胞形态、细胞死亡、细菌聚集以及细菌的细胞内贩运。必须指出，对于细胞内贩运或同地化测定，必须获得 Z 堆栈才能进行累积评估。
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Disclosures
未声明任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作的财政支助由欧洲共同体（ERC-STG INTRACELLTB赠款n°260901，MM4TB赠款n°260872）、国家复兴银行、联邦（12001407（D-AL）Equipex想象生物医学）和加莱地区提供。我们感谢加斯帕德·德洛伊森、伊丽莎白·韦克迈斯特、安东尼诺·邦焦瓦尼和弗兰克·拉方特从BICEL平台获得的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
