Summary
Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.
Abstract
Tedavi ve aşı mevcudiyetine rağmen, tüberküloz (TB) dünyadaki en ölümcül ve yaygın bakteriyel enfeksiyonlardan biri olmaya devam etmektedir. Birkaç on yıldan bu yana, çok ve yaygın olarak ilaca dirençli suşların ani patlaması tüberkülozun kontrolü için ciddi bir tehdittir. Bu nedenle, tüberkülozun etken maddesi olan Mycobacterium tuberculosis(Mtb)için kritik olan yeni hedeflerin ve yolların belirlenmesi ve TB ilaçları olabilecek yeni kimyasalların araştırılması esastır. Bir yaklaşım, samanlıkta iğne aranmasını sağlayan büyük ölçekli kütüphanelerin genetik ve kimyasal ekranlarına uygun yöntemler kurmaktır. Bu amaçla, otomatik konfokal mikroskopi kullanarak floresan etiketli konak hücreler içinde floresan etiketli Mtb'nin tespitine dayanan fenotipik bir test geliştirdik. Bu in vitro test, Mtb'nin kolonileşme sürecinin konakçıya görüntü bazlı nicelleştirilmesine izin verir ve siRNA, kimyasal bileşik veya Mtb mutant kütüphanelerinin ekranları için uygun olan 384 kuyu mikro plaka formatı için optimize edilmiştir. Görüntüler daha sonra konak hücreler içindeki Mtb patogenezinde okuma çıkarımını sağlayan çokparametrik analiz için işlenir.
Introduction
Son yıllarda bildirilen ortaya çıkan ve yeniden ortaya çıkan bulaşıcı patojenler arasında, Mycobacterium tuberculosis (Mtb),2011 yılında 1,4 milyon ölümden ve 8,7 milyon yeni enfeksiyondan sorumlu olarak önemli bir yer tutmaktadır (Küresel tüberküloz raporu 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Multidrug tedavilerinin mevcudiyetine rağmen, enfekte insan sayısı hala artmaktadır ve çok halıya dayanıklı (MDR) ve yaygın olarak ilaca dirençli (XDR) Mtb hızla tüm dünyaya yayılmaktadır1. Ayrıca, Mtb antijenlerinin varlığı dikkate alındığında, küresel nüfusun üçte birinin Mtb tarafından gizlice enfekte olduğu düşünülmektedir. İstatistiksel olarak, on vakadan birinde, sonraki klinik semptomlarla hastalığın aktif formuna doğru evrim vardır2. Bu nedenle, Mtb ile savaşmak için acilen yeni araçlara ihtiyaç vardır. Bu kapsamda, otomatik konfokal floresan mikroskopisi3 . Tahlilin 384 kuyulu mikrotiter plakalarda otomatik görüntü alma ve analiz ile birlikte uyarlanması, orta ölçekli bileşik, siRNA ve bakteriyel mutant kütüphanelerinin Yüksek içerikli / Yüksek verimli Taramaya (HC / HTS) izin verdi. Bu fenotipik test üzerinde genom geniş bir RNAi kütüphanesinin taranması, böylece Mtb kaçakçılığı ve hücre içi replikasyonda yer alan temel konak faktörlerinin tanımlanmasını ve aynı zamanda tüberkül basil basili tarafından sömürülen konak yolların aydınlatılmasını sağladı. Bu özel fenotipik tahlilin bir diğer adaptasyonu da Mtb intra-fagozomal kalıcılık için gerekli bakteriyel faktörlerin tanımlanmasıydı. Örneğin, fagozom olgunlaşmasının tutuklanması, Mtb'nin makrofajda hayatta kalmasını ve replikasyonunu kolaylaştıran önemli mekanizmalardan biri olarak kabul edilir. Mtb nakavt mutantlarının floresan etiketli-asidik bölmelerde hücre altı lokalizasyonunun izlenmesi, sağkalım sürecinde yer alan bakteri genlerinin tanımlanmasına izin verdi4. Son olarak, Mtb'nin yüksek içerikli görüntülemesi, hücre içi bakteri üremesi gibi çeşitli fenomenleri inhibe etmek için ilaç verimliliğini ölçmek için mükemmel bir yöntem sunar3. Tamamen, bu tür yüksek verimli fenotipik test, TB'ye karşı ilaç keşfini hızlandırmaya izin verir ve bu farklı yaklaşımlarla toplanan veriler Mtbtarafından uygulanan konak manipülasyonunun daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yüksek verimli Genom çapında siRNA Taraması
Yeşil Floresan Proteini (GFP) ifade eden Mtb H37Rv ile enfeksiyon üzerine insan Tip-II pnömosit modeli A549 hücre hattında tarama yapıldı. Bu yordam Şekil 1A'daözetlenmiştir.
- 4 μM konsantrasyona ulaşmak için 1x siRNA tamponu ile ana plakalarda (96 kuyu plakaları) depolanan kurutulmuş siRNA kütüphanesini yeniden kullanın, ardından karışımın 10 μl'lik kısmını 384 kuyulu bir kız plakasına (kız plakası 1) aktarın.
- SiRNA'yı 2 kat seyreltmek için 16 kız plakası 1'e 10 μl siRNA tamponu ekleyin. siRNA resüspensiyondan sonra, plakalar soyulabilir alüminyum conta ile kapatılır ve -20 °C'de en az 6 ay ve 2-3 yıla kadar saklanabilir, ancak depolama süresi siRNA kütüphane üreticisinin önerilerine bağlı olarak değişebilir.
- 500 nM konsantrasyona ulaşmak için kız plakası 1'deki siRNA'ları kız plakası 2'ye seyreltin. siRNA resüspensiyondan sonra, plakalar soyulabilir alüminyum conta ile kapatılır ve -20 °C'de en az 6 ay ve 2-3 yıla kadar saklanabilir, ancak depolama süresi siRNA kütüphane üreticisinin önerilerine bağlı olarak değişebilir.
- Kullanmadan önce, kız plakası 2'yi oda sıcaklığında çözün.
- Kız plakası 2'den 2,5 μl siRNA alın ve 384 kuyulu bir test plakasına yerleştirin.
- Adım 1.5'te aynı 384 kuyu test plakasında, ilgili kuyularına 2.5 μl negatif ve pozitif kontrol siRNA ekleyin.
- Transfeksiyon reaktifini 1x D-PBS'de seyrelterek her kuyuda 0,1 μl transfeksiyon reaktifi sağlayacak kadar çözelti elde edin ve seyreltilmiş transfeksiyon çözeltisini oda sıcaklığında 5 dakika önceden kesin.
- Test plakasındaki her kuyuya 7,5 μl transfeksiyon reaktifi/PBS çözelti karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında askıya alınan 40 μl A549 hücresi (1.500 hücre/kuyu) ekleyin. %5 CO2içeren bir atmosferde 37 °C'de 3 günlük kuluçka süresi boyunca hücreleri koruyun. Bu hücreler her 24 saatte bir bölünür, böylece transfeksiyondan üç gün sonra yaklaşık 12.000 hücre kuyulardadır.
- İki haftalık GFP ifade eden Mtb H37Rv kültürünü D-PBS (MgCl 2 ve CaCl2'den ücretsiz) ile5dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleme ile yıkayın ve yıkamaları atın. Bu adımı 3x tekrarlayın. (GFP-Mtb H37Rv kültür koşulları için bkz. protokol 3).
- Bakteriyel peleti% 10 FBS ile desteklenmiş 10 ml RPMI 1640 ortamında askıya alın ve bakteriyel agregaların tortulanmasına izin vermek için oda sıcaklığında 1 saat dekant.
- Bakteriyel süpernatantı toplayın ve bakteri konsantrasyonu belirlemek için bir mikro plaka okuyucu kullanarakOD 600 (OD 600 0.6-0.8 arasında olmalıdır) ve GFP-floresan (RFU değeri) ölçün. Aynı koşullarda hazırlanmış başka bir kültür üzerinde denemeden önce oluşturulan RFU değeri = f (CFU değeri) gösteren bir referans regresyon çizgisi kullanarak süspansiyonun titresini hesaplayın. 5'lik çok miktarda enfeksiyona (MOI) karşılık gelen2,4 x 10 6 bakteri/ml içeren bakteri süspansiyonu hazırlayın.
- 384 kuyulu test plakasındaki ortamı çıkarın ve 25 μl taze hazırlanmış bakteri süspansiyonu ekleyin.
- 384 kuyulu test plakasını% 5 CO2içeren bir atmosferde 5 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
- Ortamı çıkarın ve hücreleri% 10 FBS 3x ile desteklenmiş RPMI ortamı ile hafifçe yıkayın.
- Kalan hücre dışı bakterileri öldürmek için, %5 CO2içeren bir atmosferde 1 saat boyunca 37 °C'de 50 μg/ml amikasin içeren 50 μl taze RPMI-FBS ortamı ile hücreleri tedavi edin.
- Orta içeren amikacin'i çıkarın ve% 10 FBS ile desteklenmiş 50 μl taze RPMI ortamı ekleyin. 384 kuyulu test plakasını% 5 CO2içeren bir atmosferde 5 gün boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
- Görüntü alımından önce, PBS'de 10 μl taze hazırlanmış 30 μg/ml DAPI ekleyin (son konsantrasyon 5 μg/ml) ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı otomatik konfokal mikroskopa yükleyin.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Pozlama parametrelerini ayarlayın. Emisyon filtresi 450 nm ile excitation lazer 405 nm ve emisyon filtresi 520 nm ile excitation lazer 488 nm kullanarak GFP floresan kullanarak DAPI floresan kaydedin.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Elde edilecek her kuyudaki kuyuları ve alanları seçin, daha sonra düzen ve alt katman parametreleri olarak adlandırılır.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - 1.20 ve 1.21 adımlarındaki parametreleri kullanarak deneme dosyasını oluşturun ve otomatik alma işlemini çalıştırın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Görüntüleri uzak sunucuya aktarın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntüleri değerlendirin. Çekirdek algılama algoritmasını kullanarak DAPI kanalından hücre çekirdeklerini ve piksel yoğunluğu özellikleri algoritmasını kullanarak GFP kanalından bakteri alanını tespit edin (Şekil 4A).
Not: Bu protokol, gen susturmasının hücre içi Mtb büyümesi üzerindeki etkisini incelemek için optimize edilmiştir. Mtb, her 20 saatte bir optimum koşullarda bölünen yavaş büyümeli bir bakteridir. Enfeksiyondan 5 gün sonra hücre dışı Mtb miktarı hücre lizizinin yokluğunda hala düşüktür ve analizin kalitesini etkilememiştir. Bu protokol, mycobacteria smegmatis ve Escherichia coli gibi yoğun olarak salınan ve yeni hücreleri enfekte edebilen hızlı büyüme bakterileri kullanılarak siRNA ekranları için uyarlanacak antibiyotik tedavisinin uzunluğu ve kuluçka süresi açısından optimize edilmelidir.
2. Yüksek verimli Bileşik Tarama
Tarama Mtb H37Rv enfekte konak hücrelerinde gerçekleştirildi. Bu yordam Şekil 1B'de özetlenmiştir.
- DMSO'da çözünen bileşik kütüphaneyi içeren 384 kuyulu ana plakaları %100 çözün. %10 FBS ile desteklenmiş 10 μl RPMI 1640 ortamı içeren 384 kuyulu kız plakalarındaki bileşiklerin 0,5 μl'sini aktarın.
- İki haftalık GFP ifade eden Mtb H37Rv kültürünü D-PBS (MgCl 2 ve CaCl2'den ücretsiz) ile5dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleme ile yıkayın ve yıkamaları atın. Bu adımı 3x yineleyin (GFP-Mtb H37Rv kültür koşulları için bkz. protokol 3).
- Bakteriyel peleti% 10 FBS ile desteklenmiş 10 ml RPMI 1640 ortamında askıya alın ve bakteriyel agregaların tortulanmasına izin vermek için oda sıcaklığında 1 saat dekant.
- Bakteriyel süpernatantı toplayın ve mikro plaka okuyucu kullanarak OD600 (OD600 0.6-0.8 arasında olmalıdır) ve GFP floresanını (RFU değeri) ölçün. Denemeden önce oluşturulan RFU değeri = f (CFU değeri) görüntüleyen bir referans regresyon çizgisi kullanarak süspansiyonun titresini hesaplayın. Tipik konsantrasyon 1 x 108 bakteri/ml'dir.
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ve50 ng/ml rekombinant insan M-CSF ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında 4 x 10 5 hücre/ml'de 6 günlük birincil insan makrofajlarını hasat edin (İnsan Periferik Kan Monosit Hücreleri saflaştırma ve makrofajların farklılaşması için bkz. Protokol 4).
- Seyreltilmiş birincil hücreleri, 1-5 arasında değişen farklı MOI'de basil ile kuluçkaya yaslanın, süspansiyonda 90 rpm'de 37 °C'de 2 saat hafif sallanarak.
- Hücre dışı bakterileri temizlemek için enfekte hücreleri 350 x g'da santrifüjleme ile yıkayın. Her santrifüj adımından sonra peletin %10 FBS ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında yeniden kullanılabilir. Bu adımı 2x tekrarlayın.
- RPMI 1640 ortamındaki enfekte hücreleri % 10 FBS ve amikacin ile 50 μg / ml'de askıya alın ve süspansiyonu 37 ° C'de 1 saat hafif sallama ile kuluçkaya yatırın.
- Amikacin içeren hücre kültürü ortamını 350 x g'da santrifüjleme ile çıkarın ve enfekte olmuş hücreleri% 10 FBS ve 50 ng / ml rekombinant insan M-CSF ile desteklenmiş eksiksiz RPMI 1640 ortamı ile yıkayın. Bir kez tekrarlayın.
- Zaten bileşik seyreltmelerin 10 μl'sini içeren 2.1 adımında aynı test plakasına 40 μl enfekte makrofaj süspansiyonu ekleyin. DMSO'nun her kuyudaki son konsantrasyonu artık % 1'e ulaştı.
- %5 CO2içeren bir atmosferde 37 °C'de 5 gün boyunca test plakalarını kuluçkaya yatırın.
- Canlı hücreleri hücre geçirgen uzak kırmızı floresan boya ile lekelenin.
- Plakayı otomatik konfokal mikroskopa yükleyin.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Pozlama parametrelerini ayarlayın. Emisyon filtresi 690 nm ile excitation lazer 640 nm ve emisyon filtresi 520 nm ile excitation lazer 488 nm kullanarak GFP floresan kullanarak uzak kırmızı floresan kaydedin.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Elde edilecek her kuyudaki kuyuları ve alanları seçin, daha sonra düzen ve alt katman parametreleri olarak adlandırılır.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - 2.14 ve 2.15 adımlarındaki parametreleri kullanarak deneme dosyasını oluşturun ve otomatik alma işlemini çalıştırın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Görüntüleri uzak sunucuya aktarın.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. - Görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntüleri değerlendirin. Piksel yoğunluğu özellikleri algoritması kullanarak uzak kırmızı kanaldan hücre alanını ve piksel yoğunluğu özellikleri algoritması(Şekil 4B)kullanarak GFP kanalından bakteri alanını algılayın.
Not: Bu protokol, floresan proteini (Bir kuyu/Bir mutant) ifade eden mutantlar tarafından bileşiklerin değiştirilmesiyle Mtb mutant kütüphanesi taraması için uyarlanabilir (Şekil 1C, ayrıca bkz. 4). Floresan mutantlar ilk olarak kuyularda tohumlanır (kuyu başına 20 μl bakteri süspansiyonu). Bakteriler daha sonra 30 μl hücre süspansiyonu ile geri kazanilir. 1 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjlemeden sonra, plaka% 5 CO2içeren bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edilir. Kuluçka süresi ve MOI teste bağlıdır. Örnek olarak, fagozom asitleştirme gibi erken hücresel olayların görselleştirilmesi için, hücreler 1-20 arasında değişen MOI ile 2 saat boyunca enfekte edilebilir. Lizozomlar% 5 CO 2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de 1.5 saat boyunca2 μM'de Lysotracker boyası kullanılarak lekelenir ve daha sonra% 10 formalin veya% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitlenir. Konfokal görüntüler, lizozom tespiti ve hücre altı yerelleştirme için uygun algoritmalara sahip görüntü analizi komut dosyaları kullanılarak elde edilir ve son olarak analiz edilir4.
3. Mikobakteri tüberkülozu ifade eden Yeşil Floresan Protein H37Rv (GFP-H37Rv) Kültür Koşulları
Uzun süreli depolama için, GFP-H37Rv D-PBS'de donduruldu (şişe başına yaklaşık 1 x10 8 mikobakteri).
- Middlebrook OADC zenginleştirmesi %10, Gliserol %0,5, Ara-80%0,05 ve Hygromycin B (50 μg/ml) ile desteklenmiş 50 ml 7H9 et suyu ortamı içeren bir Erlenmeyer şişesinde bir adet donmuş stok GFP-H37Rv şişesini yeniden depola.
- 37 °C'de 8 gün kuluçkaya yaslanın.
- GFP-H37Rv kültürünün OD600'lerini ölçün.
- GFP-H37Rv kültürünü seyrelterek OD600 = 0.1'i Middlebrook OADC zenginleştirmesi ile desteklenmiş taze 7H9 et suyu ortamında %10, Gliserol%0.5, Ara-80%0.05 ve Hygromycin B (50 μg/ml) ile destekleyin.
- Test için kullanmadan önce GFP-H37Rv'u 8 gün daha 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
4. İnsan Periferik Kan Monosit Hücreleri Tam Kan veya Buffy-coat Preparatından Arındırma
- Kan kesesini % 1 FBS içeren 1x D-PBS'de (MgCl2 ve CaCl 2'den ücretsiz)2xseyreltin.
- Monositleri 20 dakika boyunca 400 x g'da Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjleme ile izole edin.
- Yalıtılmış monositleri toplayın.
- Monositleri 3x'i oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme ile%1 FBS içeren 1x D-PBS (MgCl 2 ve CaCl2içermez) ile yıkayın.
- Hücreleri 1 x 107 hücre/ml'ye kadar konsantre edin.
- Cd14 manyetik boncukları kullanarak monositleri üreticinin protokolüne göre arındırın (bkz. Malzemeler).
- CD14-monositlerin saflaştırılmasından sonra, RPMI 1640'ta 1,5 x 106 hücre/ml'deki hücrelerin tohumlamaları% 10 FBS ve 40 ng / ml insan Makrofaj koloni uyarıcı faktörü (hM-CSF) ile tamamlanmış ve% 5 CO2içeren bir atmosferde 37 ° C'de 4 gün boyunca inkübe edilir.
- 4 gün sonra ortamı% 10 FBS ve 40 ng / ml hM-CSF ile tamamlanan ve% 5 CO 2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de 2 gün boyunca inkübe edilen taze RPMI1640ile değiştirin.
- 6 gün sonra, hücreler test için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek verimli genom çapında siRNA taraması
Mtb, immün hücreleri in vitro ve diğer birkaç akciğer epitel hücresini kolonize edebilir. Örneğin, Mtb,insan tipi II pnömosilatlar için model olarak yaygın olarak kullanılan A549 epitel hücrelerini enfekte edebilir ve zarar verebilir5-7. Dectin-1, A549 hücrelerinde hücre içi mikobakteriyel büyüme üzerinde Mtb alımı, proinflamatuar yanıt ve antibakteriyel etkide yer alan bir konak hücre reseptörü olarak bildirilmiştir8. Protokol 1'de açıklanan siRNA durumu susturma verimliliğinin %85'ine yol açmıştır (veriler gösterilmemektedir). Dectin-1 ekspresyonunun siRNA ile susturülen A549 hücrelerinde hücre içi mikobakteri miktarının azalmasına yol açtı. Gerçekten de, 3 günlük susturma ve 5 günlük enfeksiyondan sonra, dectin-1 susturulmuş A549 hücrelerinde, hedeflemesiz scramble siRNA ile transfected hücrelere kıyasla enfekte hücrelerin yüzdesi iki kez azalır (Şekil 2A ve 2B). Z-skorunu tanımlamak için karıştırmaya kıyasla siRNA hedefli Dectin-1'in örnek tabanlı normalleştirmesini uyguladık. Şekil 2C'degösterildiği gibi, siRNA hedefli Dectin-1 için -15 civarında bir Z-skor ortalaması elde ettik. Dectin-1, pnömolitlerde Mtb kolonizasyonunda yer alan ve Dectin siRNA ile aynı fenotipe sahip olabilecek diğer yeni konak faktörünü keşfetmek için siRNA ekranı için pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Ekran sırasında her mikro plaka üzerinde bir kontrol olarak fenotip üzerinde etkili bir siRNA kullanımı, her plakanın normalleşmesini sağlar, bu da tüm genom ekran analizini yapmak istediğinde yararlıdır. İstatistiksel parametre Z' 0.1,siRNA tarama verilerinin doğrulanması için kabul edilebilir bir değer olan scramble ve siRNA hedefli Dectin1 üzerinde kontrol tabanlı normalleştirme kullanılarak yapıldı.
Yüksek içerikli bileşik tarama
Hücre içi bakteri üremesinde bileşik verimlilik, bir doz yanıt eğrisi (DRC) oluşturularak değerlendirilir ve referans pozitif bileşik ve negatif bileşik çözücü kontrollerine normalleştirilir. Mtb büyümesine karşı aktif olan isoniazid (INH) ve rifampicin (RIF) olmak üzere iki referans bileşiğin temsili DRC'si Şekil 3'tegösterilmiştir. Bu eğriler, GFP ekspresyonlu Mtb H37Rv suşu ile enfekte olan insan birincil makrofajlarında, enfeksiyon sonrası 5 gün sonra okuma ile elde edilir. DMSO ve INH sırasıyla% 1 ve 0.1 μg / ml nihai konsantrasyonda genellikle negatif ve pozitif kontroller olarak kullanılır ve bazal verimlilik seviyeleri sağlar (%0 ve 100) (Şekil 3A). Şekil 4B'deayrıntılı olarak açıklanan görüntü analiz sürecini takiben, otomatik konfokal mikroskop tarafından çekilen enfekte-insan makrofajlarının konfokal floresan görüntülerinden multiparametrik veriler çıkarılır. Ana bilgisayar hücrelerinde Mtb'nin hücre içi replikasyonını etkileyen aktif bileşikler, resimlerdeki hücrelerde GFP sinyalinin alanına karşılık gelen mikobakteri yükünün azalmasına yol açtı (Şekil 3B). Görüntü tabanlı analiz yazılımı kullanılarak hesaplanan hücre içi bakteri alanı ile toplam hücre alanı arasındaki oran, DRC'yi oluşturan bileşik konsantrasyon işlevinde çizilir (Şekil 3B). Bu eğriler, hem bakteri yükünü % 50 azaltmak için gereken konsantrasyonun (IC50)hem de bakteriyel replikasyonun% 99'unu inhibe etmek için gereken minimum konsantrasyonun belirlenmesine izin verir (MIC99) (Şekil 3C). Z' DMSO% 1 ve INH 0.1 μg/ ml kontrolüne dayanarak 0.49 idi. Bu Z', gerçekten 0.5'e yakın, bu tahlil doğrulamak için kabul edilebilir.
Şekil 1. Görsel Yüksek İçerik Tarama Yaklaşımları. SiRNA (A), kimyasal bileşikler (B) ve Mtb mutantlar (C) ekranları için kullanılan Mtb enfeksiyon modeli sisteminin şematik gösterimi. (A) siRNA kütüphane ekranı: hücrelere ters transfeksiyon yöntemi kullanılarak 384 kuyu plakasında 3 gün boyunca siRNA ile transkrna bulaştı. siRNA transfected hücreleri GFP-Mtb ile enfekte edildi ve% 5 CO2içeren bir atmosferde 37 ° C'de 5 gün boyunca inkübe edildi. Hücreler daha sonra boyandı ve görüntüler otomatik bir konfokal mikroskop kullanılarak toplandı. (B) Bileşikler kütüphane ekranı: bileşikler 384 kuyu plakalarında dağıtıldı. Hücre süspansiyonu ve GFP-Mtb 37 °C'de 2 saat boyunca birlikte inkübe edildi. Enfekte hücreler plakalarda tohumlandı ve% 5 CO2içeren bir atmosferde 37 ° C'de 5 gün boyunca inkübe edildi. Hücreler daha sonra boyandı ve görüntüler otomatik bir konfokal mikroskop kullanılarak toplandı. (C) Floresan-Mtb mutant kütüphanesi: floresan Mtb mutantları 384 kuyu plakasında tohumlandı ve konak hücre süspansiyonu dağıtıldı. Kuluçka süresi teste bağlı olarak değişti. Hücreler veya hücresel veziklinler otomatik görüntü alımından önce boyandı. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 2. A549 hücrelerinde Mtb kolonizasyonu üzerinde dekontin-1 susturma etkileri. (A)A549 hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri (10X hava lensi) hedeflemesiz siRNA (karıştırma) veya Dectin-1'e özgü siRNA ile trans enfekte olmuş ve 5 gün boyunca GFP-Mtb H37Rv (MOI5) ile enfekte olmuş. Ölçek çubuğu 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv'yi temsil eder yeşil ve hücreler kırmızı ile görselleştirilmiştir. Hücre sayısı(A. Hücre algılama) ve hücre içi GFP-Mtb H37Rv yükü(A. Bakteriyel alan) görüntü tabanlı analiz yazılımı kullanılarak belirlendi. (B) Scramble siRNA (mavi daireler) ve Dectin-1 siRNA'nın (kırmızı daireler) 5'inde (w1 ila w5) enfekte A549 hücrelerinin yüzdesinin grafik gösterimi. (C) Scramble siRNA ve Dectin-1 siRNA'nın Z-skor ortalamasının grafik gösterimi. (*** p-değeri < 0.0001). Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 3. İnsan makrofajlarında Mtb'ye karşı aktif referans bileşiklerinin doz yanıt eğrisi. (A ve B) 5 gün boyunca bir MOI1 ile GFP-Mtb H37Rv (yeşil) ile enfekte insan makrofajlarının (kırmızı, kırmızı floresan boya ile etiketlenmiş hücre) temsili konfokal görüntüleri (20X su lensi). Ölçek çubuğu 50 μm'dir. (A) Testte negatif kontrol olarak kullanılan DMSO%1 ile inkübe edilmiş enfekte hücrelerin görüntüleri. (B) İki referans bileşik isonazid (INH) ve rifampicin (RIF) artan konsantrasyon ile inkübe enfekte hücrelerin görüntüleri. (C) INH ve RIF doz yanıt eğrileri (DRC). Görüntü tabanlı analiz, test edilen her bileşik için DRC'nin belirlenmesine izin verdi. DRC, bileşik konsantrasyonun işlevinde (kütük ölçeği, x ekseni) hücre içi GFP-bakteriyel alan ile toplam hücre alanı (Y ekseni) arasındaki oranı temsil eder. Her grafikte, bileşik DRC negatif kontrol DMSO% 1 (% 0 inhibisyon) ve pozitif kontrol INH 0.1 μg / ml (% 100 inhibisyon) konsantrasyonunda normalleştirildi. Her bileşik için bakteriyel kolonizasyonun %50'sini (IC50)ve minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC99)INhibe etmek için gereken konsantrasyon DRC'den hesaplanmıştır. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 4. Floresan hücre içi mikobakterileri belirlemek için standart görüntü tabanlı analiz. 384 kuyu plakasından görüntüler otomatik konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Bu durumda, aynı kuyunun (alanların) 4 farklı görüntüsü kaydedildi. Daha sonra her alan, görüntü tabanlı analiz yazılımı Acapella 2.6 (Perkin Elmer) kullanılarak analiz edildi. (A) Her alan, aşağıdaki algoritma kullanılarak segmentlere ayrılmıştır: i) yerleşik bir Acapella prosedürü kullanılarak çekirdek tespiti, ii)sitoplazma tespiti, çekirdek popülasyonu esas alınarak, yerleşik bir Acapella prosedürü kullanılarak, iii) yalnızca yoğunluğu manuel olarak tanımlanmış bir eşikten daha yüksek olan pikselleri tutarak bakteri tespiti, iv) enfekte hücreleri tanımlamak için hücrelerin konumunu bakteri konumuyla birleştirmek. Dört alanın ortalaması olarak ifade edilen nihai sonuçlar, toplam bakteriyel alan, toplam hücre sayısı, enfekte hücrelerin yüzdesi ve hücre başına bakteriyel alandır (tüm enfekte hücrelerin ortalaması). (B) Her alan, aşağıdaki algoritma kullanılarak segmentlere ayrılmıştır: i)orijinal kanalın anti-median filtre kullanılarak filtrelenerek, biri bakteri (yeşil kanal) ve diğeri hücre çekirdeği ve sitoplazma (uzak kırmızı kanal) için olmak üzere iki kanal içeriyordu. ii)yalnızca yoğunluğun manuel olarak tanımlanmış bir eşikten daha yüksek olduğu pikselleri tutmak (her kanalın kendi eşiği vardır), iii) her kanal için kalan piksel sayısını saymak, iv) kanalları birleştirmek ve hücre içi bakterileri ölçmek için hem bakteriler hem de çekirdekler tarafından paylaşılan piksel sayısını saymak. Dört alanın ortalaması olarak ifade edilen nihai sonuçlar, toplam bakteri alanı, toplam hücresel alan, hücre içi bakterilerin toplam alanı ve hücre içi bakteri alanı ile hücrelerin toplam alanı arasındaki orandır. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, yüksek içerikli / Yüksek verimli ekranlar için uygun hale getiren floresan etiketli konak hücreleri enfekte etmek için GFP ifade eden bir Mtb H37Rv suşu kullanarak fenotipik bir test için gerekli yöntemleri açıklıyoruz. Bu protokol çok çeşitli bileşiklere, floresan problara ve Mtb mutantlarına uygulanabilir. Yukarıda açıklanan her protokol için, görüntü alımından önce fiksasyon ve immünolabeling adımları gerçekleştirilebilir. Görüntü elde etmek için 20X (NA 0.70) veya 60X (NA 1.2) su lensi ile donatılmış otomatik floresan konfokal mikroskop kullanıyoruz. Konfokal mikroskop 405, 488, 561 ve 640 nm heyecan lazerleri ile donatılmıştır. Yayılan floresan, 450-690 nm arasında değişen bir algılama dalga boyını kapsayan bir dizi filtre ile ilişkili 3 kamera kullanılarak yakalanır. Mikroskop ekscitasyon ve emisyon ayarlarının ayarlanması, her deneyde kullanılan boyaların veya florokromların türüne bağlıdır. Fenotipik tahliller için, DAPI veya Hoechst genellikle çekirdekleri lekelamak için 10 dakika boyunca 5 μg / ml'de kullanılır. Bununla birlikte, hücreler sitoplazma, membran veya sitoskeletonun tespiti için özel farklı floresan boyalarla da boyanabilir. Görüntü alındıktan sonra, resimler görüntü tabanlı bir analiz yazılımı kullanılarak analiz edilmelidir. Her pikselin yoğunluğuna dayalı hücre segmentasyon algoritmaları sırasıyla hücre sayısını veya hücre içi bakteri alanını belirlemek için kullanılmalıdır (bkz. Şekil 4). Oluşturulan veriler, testin sağlamlığını ve doğruluğunu doğrulamak için istatistiksel olarak temel alınan bir kabul kriterlerine göre tartılmalıdır.
Büyük ölçekli yüksek aktarım hızı ekranları zaman ve kaynak tüketen denemelerdir. Bu nedenle, tahlilin uygunluğunu önceden değerlendirmek birincil öneme sahiptir. Fenotipik ekranlardan toplanan veriler Excel gibi elektronik tablo yazılımı kullanılarak görselleştirildi ve genellikle plaka başına normalleştirildi. Hem siRNA hem de küçük moleküllü ekranlar için kullanılan en yaygın kalite ölçümleri Z'dir. Z, hem pozitif hem de negatif kontrollerin ortalama ve standart sapması ile tanımlanır9. Z, test yanıtının tam ölçekli bir örnek ekranı için uygulamasını doğrulayıp doğrulayana kadar büyük olup olmadığını ölçetir. Z aralığı negatif sonsuzluk 1'e, >0.5 çok iyi bir test olarak, >0 kabul edilebilir bir test ve <0 kabul edilemez bir tahlil. Kontrollerin gücünün Z > 0.5 ile tahlillerin doğrulanmasına izin verdiği küçük moleküllü ekranlarla karşılaştırıldığında, siRNA ekranlarının değişkenliği daha düşük olma eğiliminde olan Z'yi etkiler (genellikle 0.0-0.5 arasında)10. Gerçekten de, siRNA ekranlarının başarısı, i) hücrelere siRNA teslimatının verimliliği, ii) transfeksiyonun neden olduğu sitotoksiklik ve iii) gen susturma verimliliğinin test koşulunun optimizasyonuna bağlıdır. SiRNA, üreticinin transfection protokolünü izleyerek HeLa gibi çeşitli hücre hatlarında kolayca transkna olabilir, ancak makrofajlar da dahil olmak üzere bazı hücre hatlarında verimli siRNA transfeksiyon hala bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, kısa saç tokası RNA'larının (shRNA) viral vektör aracılı ifadesi iyi bir alternatif11temsil edebilir. Yorumlama zorluğundan kaçmak için, siRNA ekranlarından toplanan veriler, her nokta10,12için Z-puanını (Z değeri olarak da adlandırılır) tanımlamak için normal standart dağılımına göre sık sık normalleştirilir. Daha sonra, isabet örnekleri genellikle -2'den az veya +2'den fazla olan Z skoruna göre sıralandı. Son olarak, birincil ekrandaki seçilen isabetler, birincil ekranda gözlenen fenotipi doğrulamak için daha fazla çoğaltma içeren ikincil bir ekranda yeniden test edildi.
Protokolümüz ekipmanlı küçük ölçekli ekranlar için kolayca uygulanabilir. Bunu başarmak için, mikro titre plakalarında minyatürleştirme ve molekül kütüphanesinin manipülasyonu, koruma, dağıtma ve karıştırma sürecini optimize etmek içingereklidir 13. Ayrıca, mikro titre plakalarındaki test koşullarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde kontrol etmek için dağıtıcılar da dahil olmak üzere otomatik bir robotik platform kullanılması önerilir. Yüksek aktarım hızı taraması (HTS) tarafından üretilen büyük miktarda veri de veritabanı ve konfokal resmin görüntü analizi, veri depolama ve aktarım için uyarlanmış bir işlem hattı tarafından yönetilmelidir. Bu raporda sunulan tahliller Biyogüvenlik Seviye 3 tesisinde (BSL3) gerçeklendirilmiştir. BSL3'te güvenliğe sıkı sıkıya bağlı kalmak ekranların zorliğini artırır. Gerçekten de, ekranlar için gerekli birçok ekipman BSL3'te bulunmalı ve işçiyi ve çevreyi kontaminasyondan korumak için izole edilmelidir. Bu nedenle, uyarlanmış işlem hattının BSL3'e kurulumu çok fazla alan gerektiriyor. Bu nedenle, protokolümüz BSL3'ü siRNA transfeksiyon ve plakalara bileşik transfer gibi maksimum adım gerçekleştirecek şekilde geliştirilmiştir. Hücre enfeksiyonu thru image alma adımları BSL3 koşullarında gerçekleştirildi. Görüntüler daha sonra özel bir sunucuda aktarıldı ve BSL3'ün dışına analiz edildi.
Burada açıklanan fenotipik tahlil iki görüntü analizi yöntemine dayanıyordu (Şekil 4). SiRNA taraması için kullanılan ilk yöntem, enfekte hücrelerin sayısını vermek için tasarlanmıştır. Bu parametrenin gen susturma etkisini Mtb hücre içi replikasyon üzerinde etkili bir şekilde karşılaştırdığı bulunmuştur. Bununla birlikte, bileşikleri tadırken, aktif bileşikleri net bir şekilde tanımlamak için hücrelerin toplam alanına dayalı daha temel bir okuma yeterliydi. Bu ikinci yöntem daha hızlı ve uygulaması daha kolay olduğu için bileşik taramasından kaynaklanan görüntülerin analizi için tercih edildi. Daha ileri gitmek için, daha fazla floresan boya ve / veya etiketleme probu eklenebilir ve görüntü analizi komut dosyaları kolokalizasyon, çekirdek ve hücre morfolojisi, hücre ölümü, bakteri toplama ve bakteri hücre içi kaçakçılığı gibi çok yönlü veriler oluşturmak için optimize edilebilir. Hücre içi kaçakçılık veya kolokalizasyon tahlilleri için kümülatif bir değerlendirme uygulamak için Z yığınları almanın şart olduğunu belirtmek önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması bildirilmedi.
Acknowledgments
Bu çalışma için finansal destek Avrupa Topluluğu (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) ve Nord Pas de Calais Bölgesi tarafından sağlanmıştır. BICeL platformundan Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni ve Frank Lafont'un teknik yardımını minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
