Здесь мы описываем фенотипическое анализ, применимый к высокой пропускной способности / высокое содержание экранов малых помех синтетической РНК (siRNA), химическое соединение, и Mycobacterium туберкулеза мутант библиотек. Этот метод опирается на обнаружение флуоресцентно помечены Mycobacterium туберкулеза в флуоресцентно помечены клетки-хозяина с использованием автоматизированной конфокальные микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несмотря на наличие терапии и вакцины, туберкулез (ТБ) остается одной из самых смертоносных и распространенных бактериальных инфекций в мире. На протяжении нескольких десятилетий внезапный всплеск штаммов с множественной и широко лекарственной устойчивостью представляет собой серьезную угрозу для борьбы с туберкулезом. Поэтому необходимо определить новые целевые показатели и пути, критически важные для причинного агента туберкулеза, микобактерий туберкулеза(МТБ),и найти новые химические вещества, которые могут стать противотуберкулезными препаратами. Один из подходов заключается в разработке методов, подходящих для генетических и химических экранов крупномасштабных библиотек, позволяющих искать иголку в стоге сена. С этой целью мы разработали фенотипический анализ, опираясь на обнаружение флуоресцентно помечены Mtb в флуоресцентно помечены принимающих клеток с использованием автоматизированной конфокалипической микроскопии. Этот анализ in vitro позволяет количественно оценить процесс колонизации Mtb в хост и был оптимизирован для формата микроплюса 384-ну, который является правильным для экранов siRNA-, химического соединения- или Mtb мутант-библиотек. Изображения затем обрабатываются для мультипараметрического анализа, который обеспечивает считыв вывод о патогенеза Mtb в клетках-хозяинах.
Введение
Среди новых и вновь возникающих инфекционных патогенов, зарегистрированных в последние годы, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) занимает видное место, отвечая за 1,4 миллиона смертей и 8,7 миллиона новых инфекций в 2011 году (Глобальный доклад о туберкулезе 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Несмотря на наличие мультимедикаментозной терапии, число инфицированных людей по-прежнему растет, и мультимедикаментозная устойчивость (МЛУ), а также широко устойчивый к лекарственным средствам (XDR) Mtb быстро распространяется по всемумиру 1. Кроме того, принимая во внимание наличие Mtb антигенов, очевидно, что одна треть миро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Высокой пропускной способностью генома всей siRNA скрининга
Скрининг проводится в человеке Тип-II пневмоцитов модели A549 клеточной линии при инфекции СМТБ H37Rv выражая зеленый флуоресцентный белок (GFP). Эта процедура изложена на рисунке 1A.
- Resuspend высушенной библиотеки siRNA, которая хранится в материнских пластин (96-хорошо пластин) с 1x siRNA буфера для достижения концентрации 4 МКМ, а затем передать 10 мкл смеси в 384-ну дочь пластины (дочь пластины 1).
- Добавьте 10 мкл буфера 1x siRNA в дочери пластины 1, чтобы разбавить siRNA в 2 раза. После повторного сиУСПЕНЗИЯ пластины запечатываются очищ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Скрининг siRNA по всему геному с высокой пропускной способностью
Mtb способен колонизировать иммунные клетки в пробирке, а также несколько других клеток эпителия легких. Например, Mtbспособен инфицировать и повредить эпителиальные клетки A549, которые обычно используются в качестве модели для пневмоцитов типа ЧЕЛОВЕКА II5-7. Dectin-1 было сообщено как рецептор клетки хозяина, участие в поглощении Mtb, провоспалительный ответ и антибактериальное возде.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описываем здесь методы, необходимые для фенотипического анализа с помощью GFP-экспрессинг Mtb H37Rv штамм заразить флуоресцентно помечены клетки-хозяина, что делает его подходящим для высокого содержания / высокой пропускной способности экранов. Этот протокол может быть применен к широкому кругу соединений, флуоресцентных зондов и Mtb мутантов. Для каждого описанного выше протокола можно было бы выработать шаги по фиксации и иммунолабелям до получения изображений. Мы используем автоматизированный флу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не заявлен.
Благодарности
Финансовую поддержку этой работе оказали Европейское сообщество (ERC-STG INTRACELLTB Grant n' 260901, MM4TB Grant n' 260872), Национальное агентство Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) и регион Норд Па-де-Кале. Мы с благодарностью признаем техническую помощь Гаспара Делойсона, Элизабет Веркмайстер, Антонино Бонджованни и Фрэнка Лафонта с платформы BICeL.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| &микро; прозрачная пластина черная, 384-луночная | Greiner Bio-One | 781091 | 127,8/86/15 MM с крышкой, обработанная TC |
| CellCarrier 384-луночная пластина | PerkinElmer | 6007550 | черная, прозрачное дно, с крышкой, обработанная |
| TC V-образным дном белая, 384-луночная пластина | Greiner Bio-One | 781280 | |
| уплотнительная лента, дышащая, стерильная | Corning | 3345 | |
| Липофектамин RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | реагент для трансфекции |
| диметилсульфоксид | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Среда для культивирования клеток |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco' s Фосфатно-салиновый буфер |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco' s Фосфат Салин Буфер |
| Фетальная бычья сыворотка | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll для периферической очистки моноцитарных клеток крови |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Очистка CD14+ моноцитов |
| человека M-CSF, премиум гр. (1000 μ g) | Miltenyi | 130-096-493 | Макрофагальный колониестимулирующий фактор |
| LS Колонки | Miltenyi | 130-042-401 | Колонки для выделения CD14+ моноцитов |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Культура микобактерий |
| Глицерин высокой чистоты | Euromedex | 50405-EX | Культура микобактерий |
| Обогащение Middlebrook OADC | Becton-Dickinson | 211886 | Культура микобактерий |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Культура микобактерий |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Раствор для неферментативной диссоциации клеток |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Ядра красителя |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Ядерный краситель |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Краситель для ядер/цитоплазмы |
| Формалин | Sigma-Aldrich | HT5014 | Раствор для фиксации клеток |
| миРНК, нацеленный на Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Нецелевой пул миРНК | Дхармакон | D-001206-14 | |
| Рифампицин | Сигма-Олдрич | R3501 | антибиотик |
| Изониазид (INH) | Сигма-Олдрич | I3377-50G | антибиотик |
| Гигромицин B | Life Technologies | 10687-010 | антибиотик |
| Амикацин | Sigma-Aldrich | A1774 | антибиотик |
| Автоматизированный конфокальный микроскоп OPERA | PerkinElmer | Получение изображений | |
| Columbus 2.3.1 Серверная база данных | PerkinElmer | Передача, хранение и анализ данных | |
| Acapella 2.6 Программное обеспечение | PerkinElmer | Анализ на основе изображений | |
| GraphPad Программное обеспечение Prism5 | GraphPad | Статистический анализ | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
Ссылки
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of l....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Количественное определение внутриклеточных микобактерийвысокопроизводительный скринингконфокальная микроскопияэкспрессирующие GFP Mycobacteriumинфицирование клеток-хозяевскрининг библиотеки siRNAскрининг химических соединенийавтоматизированный анализ изображенийплощадь бактерий на клеткукривая зависимости «доза — ответ»
