Summary
Здесь мы описываем фенотипическое анализ, применимый к высокой пропускной способности / высокое содержание экранов малых помех синтетической РНК (siRNA), химическое соединение, и Mycobacterium туберкулеза мутант библиотек. Этот метод опирается на обнаружение флуоресцентно помечены Mycobacterium туберкулеза в флуоресцентно помечены клетки-хозяина с использованием автоматизированной конфокальные микроскопии.
Abstract
Несмотря на наличие терапии и вакцины, туберкулез (ТБ) остается одной из самых смертоносных и распространенных бактериальных инфекций в мире. На протяжении нескольких десятилетий внезапный всплеск штаммов с множественной и широко лекарственной устойчивостью представляет собой серьезную угрозу для борьбы с туберкулезом. Поэтому необходимо определить новые целевые показатели и пути, критически важные для причинного агента туберкулеза, микобактерий туберкулеза(МТБ),и найти новые химические вещества, которые могут стать противотуберкулезными препаратами. Один из подходов заключается в разработке методов, подходящих для генетических и химических экранов крупномасштабных библиотек, позволяющих искать иголку в стоге сена. С этой целью мы разработали фенотипический анализ, опираясь на обнаружение флуоресцентно помечены Mtb в флуоресцентно помечены принимающих клеток с использованием автоматизированной конфокалипической микроскопии. Этот анализ in vitro позволяет количественно оценить процесс колонизации Mtb в хост и был оптимизирован для формата микроплюса 384-ну, который является правильным для экранов siRNA-, химического соединения- или Mtb мутант-библиотек. Изображения затем обрабатываются для мультипараметрического анализа, который обеспечивает считыв вывод о патогенеза Mtb в клетках-хозяинах.
Introduction
Среди новых и вновь возникающих инфекционных патогенов, зарегистрированных в последние годы, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) занимает видное место, отвечая за 1,4 миллиона смертей и 8,7 миллиона новых инфекций в 2011 году (Глобальный доклад о туберкулезе 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Несмотря на наличие мультимедикаментозной терапии, число инфицированных людей по-прежнему растет, и мультимедикаментозная устойчивость (МЛУ), а также широко устойчивый к лекарственным средствам (XDR) Mtb быстро распространяется по всемумиру 1. Кроме того, принимая во внимание наличие Mtb антигенов, очевидно, что одна треть мирового населения считается скрыто инфицированных Mtb. Статистически, в одном случае из десяти, есть эволюция к активной форме заболевания с последующими клиническими симптомами2. Поэтому срочно нужны новые средства борьбы с МТБ. В этом контексте мы разработали визуальный фенотипический анализ in vitro, опираясь на мониторинг вторжения Mtb и умножения в клетки-хозяина с помощью автоматизированной конфокальные микроскопиифлуоресценции 3. Адаптация анализа в 384-хорошо микротитр пластин в сочетании с автоматизированным приобретением изображений и анализа, позволило высокого содержания / высокой пропускной способности скрининга (HC / HTS) средних библиотек соединений, siRNAs и бактериальных мутантов. Таким образом, скрининг широкой библиотеки РНК генома на этом фенотипической анализе позволил выяснению ключевых факторов, связанных с торговлей Mtb и внутриклеточной репликацией, а также выяснение путей хозяина, эксплуатируемых бактериорной бациллой. Еще одна адаптация этого конкретного фенотипического анализа была для выявления бактериальных факторов, необходимых для Mtb внутрифагосомальной настойчивости. Например, арест фагосомного созревания рассматривается как один из основных механизмов, который облегчает выживание и репликацию Mtb в макрофаге. Мониторинг субклеточной локализации вырубающих мутантов Mtb в флуоресцентно помеченных кислотных отсеках позволил выясовывания бактериальных генов, участвующих в процессевыживания 4. Наконец, высокосодержимая визуализация Mtb также предлагает отличный метод количественной оценки эффективности препарата для ингибирования различных явлений, таких как внутриклеточный ростбактерий 3. В целом, этот тип высокой пропускной способности фенотипического анализа позволяет ускорить открытие препарата против туберкулеза и данные, собранные этими различными подходами способствуют лучшему пониманию хозяина манипуляции, оказываемой Mtb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Высокой пропускной способностью генома всей siRNA скрининга
Скрининг проводится в человеке Тип-II пневмоцитов модели A549 клеточной линии при инфекции СМТБ H37Rv выражая зеленый флуоресцентный белок (GFP). Эта процедура изложена на рисунке 1A.
- Resuspend высушенной библиотеки siRNA, которая хранится в материнских пластин (96-хорошо пластин) с 1x siRNA буфера для достижения концентрации 4 МКМ, а затем передать 10 мкл смеси в 384-ну дочь пластины (дочь пластины 1).
- Добавьте 10 мкл буфера 1x siRNA в дочери пластины 1, чтобы разбавить siRNA в 2 раза. После повторного сиУСПЕНЗИЯ пластины запечатываются очищенным алюминиевым уплотнением и могут храниться при -20 градусах цельсия не менее 6 месяцев и до 2-3 лет, но время хранения может варьироваться в зависимости от рекомендаций производителя библиотеки siRNA.
- Разбавить siRNAs в дочери пластины 1 в дочь пластины 2 для достижения концентрации 500 нМ. После повторного сиУСПЕНЗИЯ пластины запечатываются очищенным алюминиевым уплотнением и могут храниться при -20 градусах цельсия не менее 6 месяцев и до 2-3 лет, но время хранения может варьироваться в зависимости от рекомендаций производителя библиотеки siRNA.
- Перед использованием оттаивать дочку пластины 2 при комнатной температуре.
- Возьмите 2,5 мкл siRNA из дочери пластины 2 и поместите в 384-ну анализ пластины.
- В той же 384-хорошо анализ пластины в шаге 1,5, добавить 2,5 мкл отрицательной и положительной siRNA контроля в своих соответствующих скважин.
- Разбавить реагент трансфекции в 1x D-PBS, чтобы дать достаточное решение, чтобы обеспечить 0,1 мкл трансфекции реагент в каждой хорошо и preincubate разбавленного раствора трансфекции при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавьте 7,5 мл смеси раствора трансфекции/PBS в каждую хорошо в анализной пластине и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 40 мкл клеток A549 (1500 клеток/хорошо), подвешенных в rpMI 1640 средних, дополненных 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS). Поддерживайте клетки в течение 3-дневного инкубационный период при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% CO2. Эти клетки делятся каждые 24 часа, таким образом, около 12000 клеток находятся в колодцах через три дня после трансфекции.
- Вымойте двухнедельный GFP-выражение Mtb H37Rv культуры с D-PBS (бесплатно от MgCl2 и CaCl2) центрифугации на 4000 х г в течение 5 минут и отказаться от моет. Повторите этот шаг 3x. (Для GFP-Mtb H37Rv условия культуры см. Протокол 3).
- Приостановить бактериальные гранулы в 10 мл RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и декант в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы бактериальные агрегаты в осадок.
- Соберите бактериальный супернатант иизмерьте OD 600 (OD600 должно быть между 0.6-0.8) и GFP-флуоресценцией (значение РФС) с помощью микроплемента для определения бактериальной концентрации. Рассчитайте тариф подвески с помощью эталонной регрессионные линии, отображающие значение RFU q f (CFU value), которое было создано до эксперимента по другой культуре, которая была подготовлена в тех же условиях. Подготовка бактериальной суспензии, содержащей 2,4х 10 6 бактерий / мл, что соответствует множественности инфекции (МВД) 5.
- Удалите среду в 384-хорошо анализ пластины и добавить 25 мкл свежеприготовленной бактериальной суспензии.
- Инкубировать 384-хорошо анализ пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 5 часов в атмосфере, содержащей 5% CO2.
- Удалите среду и аккуратно промыть клетки с RPMI среды дополняется 10% FBS 3x.
- Чтобы убить оставшиеся внеклеточные бактерии, обработать клетки с 50 мкл свежей среды RPMI-FBS, содержащей 50 мкг/мл амикацина при 37 градусов по Цельсию в течение 1 часа в атмосфере, содержащей 5% CO2.
- Удалите среднесодержащие амикацин и добавьте 50 мкл свежей среды RPMI, дополненной 10% FBS. Инкубировать 384-хорошо анализ пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 5 дней в атмосфере, содержащей 5% CO2.
- Перед приобретением изображения добавьте 10 мкл свежеприготовленных 30 мкг/мл ДАПИ в PBS (окончательная концентрация 5 мкг/мл) и инкубировать в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
- Загрузите пластину в автоматизированный конфокальный микроскоп.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Установите параметры экспозиции. Запись DAPI флуоресценции с использованием возбуждения лазер 405 нм с фильтром выбросов 450 нм и GFP флуоресценции с помощью возбуждения лазер 488 нм с фильтром выбросов 520 нм.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Выберите скважины и поля в каждой скважине, которые будут приобретены, что затем называется параметрами планировки и сублейла.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Создайте файл эксперимента, используя параметры из шагов 1.20 и 1.21, и запустите автоматическое приобретение.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Передача изображений на удаленный сервер.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Оценка изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Обнаружить ядра клеток из канала DAPI с помощью алгоритма обнаружения ядер и бактериальной области канала GFP с помощью алгоритма интенсивности пикселей(рисунок 4A).
Примечание: Этот протокол оптимизирован для изучения влияния глушиния генов на внутриклеточный рост Mtb. Mtb является медленной бактерией роста, которая делит каждые 20 часов в оптимальных условиях. После 5 дней после заражения количество внеклеточного Mtb по-прежнему низко при отсутствии клеточного лиза и не влияет на качество анализа. Этот протокол должен быть оптимизирован с точки зрения продолжительности лечения антибиотиками и инкубации время, которое будет адаптировано для siRNA экранов с использованием быстрорастущих бактерий, таких как Mycobacteria smegmatis и Escherichia coli, которые широко освобождены и могут инфицировать новые клетки.
2. Высоко пропускной состав скрининга
Скрининг проводится на Mtb H37Rv инфицированных клеток-хозяина. Эта процедура изложена на рисунке 1B.
- Оттепель 384-ну матери пластин, содержащих соединение библиотеки solubilized в DMSO 100%. Передача 0,5 мкл соединений в 384-ну дочери пластин, содержащих 10 мкл RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS.
- Вымойте двухнедельный GFP-выражение Mtb H37Rv культуры с D-PBS (бесплатно от MgCl2 и CaCl2) центрифугации на 4000 х г в течение 5 минут и отказаться от моет. Повторите этот шаг 3x (для GFP-Mtb H37Rv условия культуры см. Протокол 3).
- Приостановить бактериальные гранулы в 10 мл RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и декант в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы бактериальные агрегаты в осадок.
- Соберите бактериальный супернатант иизмерьте OD 600 (OD600 должно быть между 0,6-0,8) и GFP-флуоресценцией (значение РФС) с помощью микроплемента. Рассчитайте тариф подвески с помощью эталонной регрессионные линии, отображающие значение RFU q f (значение CFU), которое было создано до эксперимента. Типичная концентрация 1 х 108 бактерий/мл.
- Урожай 6-дневный первичный человеческий макрофаги на 4 х 105 клеток / мл в RPMI 1640 среды дополняется 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 50 нг / мл рекомбинантных человека M-CSF (Для человека периферической крови моноцитов клетки очистки и макрофагов дифференциации см. Протокол 4).
- Инкубировать разбавленные первичные клетки с бациллы в различных МВД, начиная от 1-5, в подвеске с легкой тряской при 90 об / мин в течение 2 часов при 37 градусов по Цельсию.
- Вымойте инфицированные клетки центрифугированием при 350 x g, чтобы удалить внеклеточные бактерии. После каждого шага центрифугации, повторно гранулы в RPMI 1640 среднего дополняется 10% FBS. Повторите этот шаг 2x.
- Приостановить инфицированные клетки в RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и амикацин на 50 мкг /мл и инкубировать подвеску с легкой тряски в течение 1 часа при 37 градусов по Цельсию.
- Удалите клеточно-культурную среду, содержащую амикацин путем центрифугации на уровне 350 х г, и промыть инфицированные клетки с полным RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и 50 нг / мл рекомбинантных человека M-CSF. Повторите один раз.
- Добавьте 40 мкл инфицированной подвески макрофагов в ту же ассную пластину в шаге 2.1, которая уже содержит 10 мкл разбавления соединения. Окончательная концентрация ДМСО в каждой из них в настоящее время достигла 1%.
- Инкубировать анализ пластин в течение 5 дней при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2.
- Пятно живых клеток с клеточной проницаемой далеко-красный флуоресцентный краситель.
- Загрузите пластину в автоматизированный конфокальный микроскоп.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Установите параметры экспозиции. Запись далеко-красной флуоресценции с использованием возбуждающей лазера 640 нм с эмиссионным фильтром 690 нм и флуоресценцией GFP с использованием возбуждающей лазера 488 нм с эмиссионным фильтром 520 нм.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Выберите скважины и поля в каждой скважине, которые будут приобретены, что затем называется параметрами планировки и сублейла.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Создайте файл эксперимента, используя параметры из шагов 2.14 и 2.15 и запустите автоматическое приобретение.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Передача изображений на удаленный сервер.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. - Оценка изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Обнаружить область ячейки от дальнего красного канала с помощью алгоритма интенсивности пикселей и бактериальной области от канала GFP с помощью алгоритма интенсивности пикселей(рисунок 4B).
Примечание: Этот протокол может быть адаптирован для Mtb мутант библиотеки скрининга путем замены соединений мутантов, выражаюющих флуоресцентный белок (один хорошо / один мутант) (Рисунок 1C, см. также Бродин и др. 4). Флуоресцентные мутанты впервые посеяны в скважинах (20 мкл бактериальной суспензии на скважину). Бактерии затем восстанавливаются на 30 мкл клеточной суспензии. После центрифугации при 350 x g в течение 1 мин, пластина инкубируется при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% CO2. Время инкубации и МВД зависят от анализа. Например, для визуализации ранних клеточных явлений, таких как фагосомное подкисление, клетки могут быть инфицированы в течение 2 часов с МВД в диапазоне от 1-20. Лисосомы окрашиваются с помощью красителя Lysotracker при 2 МКМ в течение 1,5 часов при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2, а затем фиксируются либо 10% формалином, либо 4% параформалдегидом (PFA). Конфокальные изображения приобретаются и, наконец, анализируются с помощью скриптов анализа изображений с использованием соответствующих алгоритмов обнаружения лизосом и субклеточнойлокализации 4.
3. Зеленый флуоресцентный белок Экспрессия Микобактерий туберкулеза H37Rv (GFP-H37Rv) Культурные условия
Для длительного хранения, GFP-H37Rv были заморожены в D-PBS (около 1 х10 8 микобактерий на флакон).
- Resuspend один замороженный бульон флакон GFP-H37Rv в колбе Erlenmeyer, содержащий 50 мл 7H9 бульон среды дополняется Middlebrook OADC обогащения 10%, глицерол 0,5%, Tween-80 0,05%, и Гигромицин B (50 мкг/мл).
- Инкубация 8 дней при 37 градусах Цельсия.
- Измерьте OD 600 культуры GFP-H37Rv.
- Разбавить GFP-H37Rvкультуры для получения OD 600 и 0,1 в свежем 7H9 бульон среды дополняется Middlebrook OADC обогащения 10%, глицерол 0,5%, Tween-80 0,05% и гигромицин B (50 мкг/мл).
- Инкубировать GFP-H37Rv при 37 градусов по Цельсию в течение 8 дней больше, прежде чем использовать для анализа.
4. Человеческие периферические клетки крови моноцитов очистки от цельной крови или Баффи пальто Подготовка
- Разбавить мешок крови 2x в 1x D-PBS (без MgCl2 и CaCl2), содержащий 1% FBS.
- Изолировать моноциты по градифицации градиента плотности Ficoll на 400 х г в течение 20 мин.
- Соберите изолированные моноциты.
- Вымойте моноциты 3x с 1x D-PBS (бесплатно от MgCl2 и CaCl2), содержащий 1% FBS центрифугации при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Сосредоточьте клетки до 1 х 107 клеток/мл.
- Очистка моноцитов с помощью CD14-магнитных бусин в соответствии с протоколом производителя (см. Материалы).
- После очистки CD14-моноцитов, семена клеток на 1,5 х10 6 клеток / мл в RPMI 1640 дополняется 10% FBS и 40 нг / мл человека Макрофаги Колонии Стимулирующий фактор (hM-CSF) и инкубируется в течение 4 дней при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2.
- Через 4 дня замените носитель свежим RPMI 1640, дополненным 10% FBS и 40 ng/ml hM-CSF и инкубированным в течение 2 дней при 37 градусах в атмосфере, содержащей 5% CO2.
- Через 6 дней, клетки могут быть использованы для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Скрининг siRNA по всему геному с высокой пропускной способностью
Mtb способен колонизировать иммунные клетки в пробирке, а также несколько других клеток эпителия легких. Например, Mtbспособен инфицировать и повредить эпителиальные клетки A549, которые обычно используются в качестве модели для пневмоцитов типа ЧЕЛОВЕКА II5-7. Dectin-1 было сообщено как рецептор клетки хозяина, участие в поглощении Mtb, провоспалительный ответ и антибактериальное воздействие на внутриклеточный микобактериальный рост в клетках A5498. siRNA состояние, описанное в Протоколе 1 привело к 85% эффективности глушивания (данные не показаны). Замалчивание экспрессии Dectin-1 с siRNA привело к уменьшению количества внутриклеточных микобактерий в клетках A549. Действительно, после 3 дней замалчивания и 5 дней инфекции, процент инфицированных клеток уменьшается в два раза в Dectin-1 замолчать A549 клеток по сравнению с клетками, трансфицированными с нецелевых схватки siRNA (Цифры 2A и 2B). Мы применили выборку на основе нормализации siRNA целевых Dectin-1 по сравнению с карабкаться, чтобы определить- оценка. Как показано на рисунке 2C, мы получили в среднем около -15 для siRNA целевых Dectin-1. Dectin-1 может быть использован в качестве положительного контроля для экрана siRNA, чтобы обнаружить другие новые принимающий фактор, участвующий в колонизации Mtb в пневмоцитах, которые могли бы иметь тот же фенотип, что и с Dectin siRNA. Использование siRNA, влияя на фенотип в качестве контроля на каждой микроплюе во время экрана, позволяет нормализовать каждую пластину, что полезно, когда человек хочет выполнить анализ всего генома экрана. Статистический параметр No был 0,1 с использованием контроля на основе нормализации на схватке и siRNA целевых Dectin1, что является приемлемым значением для проверки данных скрининга siRNA.
Скрининг соединений с высоким содержанием
Эффективность соединения на внутриклеточном бактериальном росте оценивается путем установления кривой реакции дозы (ДРК) и нормализуется для эталонного положительного соединения и отрицательного контроля растворителя соединения. Представитель ДРК двух эталонных соединений, изониазида (INH) и рифампицина (RIF), активных против роста Mtb показаны на рисунке 3. Эти кривые получены в первичных макрофагах человека, инфицированных штаммом MTB H37Rv, выражающих GFP, с считыванием через 5 дней после заражения. DMSO и INH при конечной концентрации соответственно 1% и 0,1 мкг/мл обычно используются в качестве отрицательного и позитивного контроля, обеспечивая базальные уровни эффективности (0 и 100%) (Рисунок 3A). После процесса анализа изображений, подробно описанного на рисунке 4B,мультипараметрические данные извлекаются из конфокальных флуоресцентных изображений инфицированных человеческих макрофагов, полученных с помощью автоматизированного конфокального микроскопа. Активные соединения, влияющие на внутриклеточную репликацию Mtb в клетках-хозяинах, привели к снижению микобактериальной нагрузки, что соответствует области сигнала GFP в клетках на снимках(рисунок 3B). Соотношение между внутриклеточной бактериальной областью и общей площадью клеток, рассчитанное с использованием программного обеспечения для анализа изображений, построено в функции концентрации соединения, котораягенерирует ДРК (рисунок 3B). Эти кривые позволяют определить как концентрацию, необходимую для снижения бактериальной нагрузки на 50% (IC50), так и минимальную концентрацию, необходимую для ингибирования 99% бактериальной репликации (MIC99) (Рисунок 3C). на основе контроля DMSO 1% и контроля INH 0,1 мкг/мл составил 0,49. Это q', действительно близко к 0.5, приемлемо для проверки этого анализа.
Рисунок 1. Визуальные подходы к скринингу высокого содержания. Схематическое представление системы модели инфекции Mtb используемой для siRNA (A), химическихсоединений( B ) и мутантов Mtb (C) экранов. (A) siRNA библиотечный экран: клетки были трансфицированы с siRNA в течение 3 дней в 384-хорошо пластин с использованием метода обратной трансфекции. siRNA трансфицированные клетки были инфицированы GFP-Mtb и инкубировали в течение 5 дней при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2. Клетки были затем окрашены и изображения были собраны с помощью автоматизированного конфокального микроскопа. (B)Подворья библиотечного экрана: соединения были распределены в 384-хорошо пластин. Подвеска клетки и GFP-Mtb были инкубированы совместно на 2 часа на 37 C. Зараженные клетки были посеяны в пластинах и инкубировали в течение 5 дней при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2. Клетки были затем окрашены и изображения были собраны с помощью автоматизированного конфокального микроскопа. (C) Флуоресцентные-Mtb мутант библиотеки: флуоресцентные Mtb мутантов были посеяны в 384-хорошо пластин и подвески клетки-хозяина была распространена. Время инкубации варьировалось в зависимости от анализа. Клетки или клеточные пузырьки были окрашены до автоматического получения изображения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 2. Замалчивание Dectin-1 влияет на колонизацию Mtb в клетках A549. (A) Представитель конфокальные изображения (10X воздушный объектив) A549 клеток трансфицированы с нецелевых siRNA (скрембл) или с siRNA специфическим для Dectin-1 и инфицированных GFP-Mtb H37Rv (MOI5) в течение 5 дней. Планка шкалы представляет 200 мкм (A) GFP-Mtb H37Rv были визуализированы зеленым цветом, а клетки красным цветом. Количество ячеек (обнаружениеклеток A. Cell) и внутриклеточная нагрузка GFP-Mtb H37Rv(область A. Bacterial) определялись с помощью программного обеспечения для анализа изображений. (B) Графическое представление процента инфицированных клеток A549 в 5 репликациях (w1 до w5) Scramble siRNA (синие круги) и Dectin-1 siRNA (красные круги). (C) Графическое представление среднего балла Scramble siRNA и Dectin-1 siRNA. (значение p-значения < 0.0001). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 3. Кривая реакции дозы активных эталонных соединений против Mtb в человеческих макрофагах. (A и B) Представитель конфокальные изображения (20X воды объектив) человека макрофагов (красный, клетка помечена красным флуоресцентным красителем) инфицированных GFP-Mtb H37Rv (зеленый) с MOI1 в течение 5 дней. Планка шкалы составляет 50 мкм. (A)Изображения инфицированных клеток, инкубированных с DMSO 1% используется в качестве отрицательного контроля в анализе. (B) Изображения инфицированных клеток, инкубированных с увеличением концентрации двух эталонных соединений изоназид (INH) и рифампицин (RIF). (C) Кривые дозы ответа (ДРК) INH и RIF. Анализ на основе изображений позволил определить ДРК для каждого испытанного соединения. ДРК представляет собой соотношение между внутриклеточной GFP-бактериальной областью и общей площадью клеток (Y оси), в функции концентрации соединения (шкала журнала, x-axis). На каждом графике ДРК соединения нормализовалась до отрицательного контроля ДМСО 1% (0% ингибирование) и положительного контроля ИНГ при концентрации 0,1 мкг/мл (100% ингибирование). Для каждого соединения, концентрация, необходимая для ингибирования 50% бактериальной колонизации (IC50)и минимальной ингибирующей концентрации (MIC99) были рассчитаны из ДРК. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 4. Стандартный анализ изображений для определения флуоресцентных внутриклеточных микобактерий. Изображения с пластин 384-х колодец были получены с помощью автоматизированного конфокального микроскопа. В этом случае было зарегистрировано 4 различных изображения одного и того же хорошо (поля). Затем каждое поле анализировалось с помощью программного обеспечения для анализа изображений Acapella 2.6 (Перкин Элмер). (A)Каждое поле содержало два канала (два цвета), один для бактерий (зеленый) и один для ядер клеток (синий канал), которые были сегментированы с помощью следующего алгоритма: i) обнаружение ядер с помощью встроенной процедуры Acapella, ii) обнаружение цитоплазмы, основанной на популяции ядер, с использованием встроенной процедуры Acapella, iii) обнаружения бактерий, сохраняя только пиксели, интенсивность которых выше, чем вручную определенный порог, iv) слияние позиции клеток с бактериями положение для выявления инфицированных клеток. Окончательные результаты, выраженные в среднем из четырех полей, являются общей бактериальной области, общее количество клеток, процент инфицированных клеток и бактериальной области на клетку (в среднем всех инфицированных клеток). (B)Каждое поле содержало два канала, один для бактерий (зеленый канал) и один для ядер клеток и цитоплазмы (фар-красный канал), которые были сегментированы с помощью следующего алгоритма: i) фильтрации исходного канала с помощью анти-медианного фильтра, ii) сохранение только пикселей, интенсивность которых выше, чем вручную определенный порог (каждый канал имеет свой собственный порог), iii) подсчет оставшегося количества пикселей для каждого канала, iv) слияние каналов и подсчет количества пикселей, разделяемых бактериями и ядрами для количественной оценки внутриклеточных бактерий. Окончательные результаты, выраженные в среднем из четырех полей, являются общей бактериальной области, общей клеточной площади, общей площади внутриклеточных бактерий и соотношение между внутриклеточной бактериальной области и общей площади клеток. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем здесь методы, необходимые для фенотипического анализа с помощью GFP-экспрессинг Mtb H37Rv штамм заразить флуоресцентно помечены клетки-хозяина, что делает его подходящим для высокого содержания / высокой пропускной способности экранов. Этот протокол может быть применен к широкому кругу соединений, флуоресцентных зондов и Mtb мутантов. Для каждого описанного выше протокола можно было бы выработать шаги по фиксации и иммунолабелям до получения изображений. Мы используем автоматизированный флуоресцентный конфокальный микроскоп, оснащенный 20X (NA 0.70) или 60X (NA 1.2) водяной объектив для получения изображений. Конфокальный микроскоп оснащен 405, 488, 561 и 640 нм возбуждающей лазеров. Излучаемая флуоресценция запечатлена с помощью 3 камер, связанных с набором фильтров, покрывающих длину волны обнаружения от 450-690 нм. Важно отметить, что корректировка параметров возбуждения микроскопа и выбросов зависит от типа красителей или фторхромов, используемых в каждом эксперименте. Для фенотипических анализов, DAPI или Hoechst обычно используются при 5 мкг/мл в течение 10 мин, чтобы окрашивать ядра. Тем не менее, клетки также могут быть окрашены различными флуоресцентными красителями, специфичными для обнаружения цитоплазмы, мембраны или цитоскелета. После получения изображения фотографии должны анализироваться с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Алгоритмы сегментации клеток, основанные на интенсивности каждого пикселя, должны использоваться соответственно для определения количества клеток или внутриклеточной бактериальной области (см. рисунок 4). Полученные данные следует взвешивать со статистически обоснованными критериями принятия для проверки надежности и точности анализа.
Крупномасштабные высококапутные экраны — это трудоемкие и ресурсосужающие эксперименты. Поэтому крайне важно заранее оценить пригодность анализа. Данные, собранные с фенотипических экранов, визуализировались с помощью программного обеспечения электронной таблицы, как Excel, и в целом нормализовались на тарелку. Наиболее распространенными показателями качества, используемыми как для siRNA, так и для малом молекул- экранов, является q. Й определяется средним и стандартным отклонением как положительного, так и отрицательного контроля9. В no количественно определяется, достаточно ли большой ответ на анализ, чтобы проверить его применение для полномасштабного экрана образцов. Диапазон no 1 отрицательный до 1, с >0.5 как очень хороший анализ, >0 приемлемый анализ и <0 неприемлемый анализ. По сравнению с маломекулярными экранами, для которых прочность элементов управления позволяет валидацию анализа с помощью q > 0.5, изменчивость экранов siRNA влияет на q, которые, как правило, ниже (часто между 0.0-0.5)10. Действительно, успех siRNA экранов зависит от оптимизации i) эффективность доставки siRNA в клетки, ii) цитотоксии, вызванной трансфекции и iii) анализ условий для эффективности глушителя генов. SiRNA можно легко transfected в различных линиях клетки, such as HeLa, следуя за протоколом transfection изготовило, но эффективная transfection siRNA в некоторых линиях клетки включая макрофаги все еще остает возможностью. Тем не менее, вирусный вектор-опосредованное выражение коротких РНК шпильки (shRNA) может представлять собой хорошуюальтернативу 11. Чтобы избежать трудностей интерпретации, данные, собранные с экранов siRNA, часто нормализуются по сравнению с обычным стандартным распределением для определения значения «З-балл» (также называемого «З-значение»)для каждой точки 10,12. Затем, хит-образцы были ранжированы в соответствии с no-счет, который обычно принадлежит менее чем к -2 или более, чем No 2. Наконец, выбранные хиты на первичном экране были повторно протестированы на вторичном экране, включая больше репликаций, чтобы подтвердить фенотип, наблюдаемый на первичном экране.
Наш протокол можно легко применить для маломасштабных экранов с оборудованием. Для этого необходимо прорицание в микротитерных пластинах и манипуляция библиотекой молекул для оптимизации процесса консервации, дозирования исмешивания 13. Кроме того, рекомендуется использовать автоматизированную роботизированную платформу, включая дозаторы, для точного и воспроизводимого контроля условий анализа в микро-тейтерных пластинах. Огромный объем данных, полученных в результате высокой пропускной способности скрининга (ГТС), должен также управляться базой данных и адаптированным конвейером для анализа изображений конфокального изображения, хранения и передачи данных. Анализы, представленные в настоящем докладе, были проведены на объекте уровня биобезопасности 3 (BSL3). Строгое соблюдение безопасности в BSL3 увеличивает сложность экранов. Действительно, многие оборудование, необходимое для экранов должны быть доступны в BSL3 и изолированы для защиты работника и окружающей среды от загрязнения. Поэтому установка адаптированного трубопровода в BSL3 потребовала большого пространства. По этой причине, наш протокол был разработан, чтобы иметь максимум шагов, выполненных из BSL3, как siRNA трансфекции и соединения передачи пластин. Клеточная инфекция через шаги по приобретению изображений были выполнены в условиях BSL3. Изображения затем были переданы на специальном сервере и проанализированы из BSL3.
Фенотипический анализ, описанный здесь, был основан на двух методах анализа изображений(рисунок 4). Первый метод, используемый для скрининга siRNA, был разработан, чтобы дать количество инфицированных клеток. Было установлено, что этот параметр эффективно сравнивает влияние глушивания генов на внутриклеточную репликацию Mtb. Однако при скрининге соединений достаточно более элементарного считыва, основанного на общей площади клеток, чтобы четко определить активные соединения. Поскольку этот второй метод быстрее и проще в реализации, он был предпочтительнее для анализа изображений, возникающих в результате скрининга соединений. Чтобы пойти дальше, флуоресцентные красители и / или маркировки зондов могут быть добавлены и сценарии анализа изображений могут быть оптимизированы для создания мультипараметрических данных, таких как колокализация, ядра и морфологии клеток, гибель клеток, бактериальной агрегации, а также внутриклеточного оборота бактерий. Важно отметить, что для анализа внутриклеточной торговли людьми или колокализации необходимо получить стеки для того, чтобы провести кумулятивную оценку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не заявлен.
Acknowledgments
Финансовую поддержку этой работе оказали Европейское сообщество (ERC-STG INTRACELLTB Grant n' 260901, MM4TB Grant n' 260872), Национальное агентство Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) и регион Норд Па-де-Кале. Мы с благодарностью признаем техническую помощь Гаспара Делойсона, Элизабет Веркмайстер, Антонино Бонджованни и Фрэнка Лафонта с платформы BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
