Summary
Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.
Abstract
Trotz der Verfügbarkeit von Therapie und Impfstoff ist Tuberkulose (TB) nach wie vor eine der tödlichsten und am weitesten verbreiteten bakteriellen Infektionen der Welt. Seit mehreren Jahrzehnten stellt der plötzliche Ausbruch multi- und extensiv-resistenter Stämme eine ernsthafte Bedrohung für die Bekämpfung der Tuberkulose dar. Daher ist es wichtig, neue Ziele und Wege zu identifizieren, die für den Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) entscheidend sind, und nach neuartigen Chemikalien zu suchen, die zu TB-Medikamenten werden könnten. Ein Ansatz besteht darin, Methoden einzurichten, die für die genetischen und chemischen Siebs von Großbibliotheken geeignet sind und die Suche nach einer Nadel in einem Heuhaufen ermöglichen. Zu diesem Zweck entwickelten wir einen phänotypchen assay, der sich auf den Nachweis von fluoreszierend beschriftetem Mtb in fluoreszierend gekennzeichneten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie stützt. Dieser In-vitro-Assay ermöglicht eine bildbasierte Quantifizierung des Kolonisationsprozesses von Mtb in den Wirt und wurde für das 384-Well-Mikroplattenformat optimiert, das für Siebe von siRNA-, chemischen Compound- oder Mtb-Mutationsbibliotheken passt. Die Bilder werden dann für die multiparametrische Analyse verarbeitet, die eine Auslesung der Pathogenese von Mtb in Wirtszellen liefert.
Introduction
Unter den in den letzten Jahren gemeldeten neu auftretenden und wieder auftauchenden infektionserösen Krankheitserregern ist Mycobacterium tuberculosis (Mtb) für 1,4 Millionen Todesfälle und 8,7 Millionen Neuinfektionen im Jahr 2011 verantwortlich (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Trotz der Verfügbarkeit von Multidrug-Therapien ist die Zahl der Infizierten immer noch auf dem Vormarsch und multiresistent (MDR) sowie extensiv medikamentenresistent (XDR) Mtb breiten sich schnell auf der ganzen Welt aus1. Darüber hinaus ist es unter Berücksichtigung des Vorhandenseins von Mtb-Antigenen offensichtlich, dass ein Drittel der Weltbevölkerung als latent von Mtb infiziert angesehen wird. Statistisch gesehen gibt es in einem von zehn Fällen eine Entwicklung hin zur aktiven Form der Krankheit mit nachfolgenden klinischen Symptomen2. Daher sind neue Mittel zur Bekämpfung von Mtb dringend erforderlich. In diesem Zusammenhang entwickelten wir einen in vitro visuellen phänotypchen Assay, der sich auf die Überwachung der Mtb-Invasion und -Multiplikation in Wirtszellen durch automatisierte konfokale Fluoreszenzmikroskopie3stützt. Die Anpassung des Assays in 384-Well-Mikrotiterplatten in Kombination mit automatisierter Bildaufnahme und -analyse ermöglichte High-Content/High-Throughput Screening (HC/HTS) von mittelgroßen Bibliotheken von Verbindungen, siRNAs und bakteriellen Mutanten. Das Screening einer genomweiten RNAi-Bibliothek auf diesem phänotypischen Assay ermöglichte somit die Identifizierung der wichtigsten Wirtsfaktoren, die am Mtb-Handel und der intrazellulären Replikation beteiligt sind, aber auch die Aufklärung von Wirtspfaden, die vom Tuberkel-Bacillus ausgenutzt werden. Eine weitere Anpassung dieses speziellen phänotypischen Assays war die Identifizierung von bakteriellen Faktoren, die für die intraphagosomale Persistenz von Mtb unerlässlich sind. Zum Beispiel wird die Verhaftung der Phagosomenreifung als einer der wichtigsten Mechanismen betrachtet, die das Überleben und die Replikation von Mtb in Makrophagen erleichtern. Die Überwachung der subzellulären Lokalisation vonMtb-Knock-out-Mutanten in fluoreszierend-säuerlichen Kompartimenten ermöglichte die Identifizierung von bakteriellen Genen, die am Überlebensprozess beteiligt sind 4 . Schließlich bietet die hochklassige Bildgebung von Mtb auch eine ausgezeichnete Methode zur Quantifizierung der Arzneimitteleffizienz zur Hemmung verschiedener Phänomene wie intrazelluläres Bakterienwachstum3. Insgesamt ermöglicht diese Art von hochdurchsatz-phänotypischem Assay eine beschleunigte Arzneimittelentdeckung gegen TB und die von diesen verschiedenen Ansätzen gesammelten Daten tragen zu einem besseren Verständnis der von Mtbausgeübten Host-Manipulation bei.
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Protocol
1. High-Throughput Genom-wide siRNA Screening
Screening durchgeführt in einem menschlichen Typ-II-Pneumozyten Modell A549 Zelllinie nach einer Infektion mit Mtb H37Rv, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exzessiert. Dieses Verfahren ist in Abbildung 1Abeschrieben.
- Setzen Sie die getrocknete siRNA-Bibliothek, die in Mutterplatten (96-Well-Platten) mit 1x siRNA-Puffer gelagert wird, auf eine Konzentration von 4 m auf, und übertragen Sie dann 10 l des Gemischs in eine 384-Well-Tochterplatte (Tochterplatte 1).
- Fügen Sie 10 l 1x 1x siRNA Puffer in Tochterplatte 1 hinzu, um siRNA um das 2-fache zu verdünnen. Nach der siRNA-Resuspension werden platten mit abziehbarer Aluminiumdichtung versiegelt und können bei -20 °C mindestens 6 Monate und bis zu 2-3 Jahren gelagert werden, aber die Lagerzeit kann je nach den Empfehlungen des Herstellers der siRNA-Bibliothek variieren.
- SiRNAs in Tochterplatte 1 in Tochterplatte 2 verdünnen, um eine Konzentration von 500 nM zu erreichen. Nach der siRNA-Resuspension werden platten mit abziehbarer Aluminiumdichtung versiegelt und können bei -20 °C mindestens 6 Monate und bis zu 2-3 Jahren gelagert werden, aber die Lagerzeit kann je nach den Empfehlungen des Herstellers der siRNA-Bibliothek variieren.
- Vor Gebrauch auftauen Tochterplatte 2 bei Raumtemperatur.
- Nehmen Sie 2,5 l siRNA von Tochterplatte 2 und legen Sie sie in eine 384-Well-Assay-Platte.
- In der gleichen 384-Well-Assay-Platte in Schritt 1.5 fügen Sie ihren jeweiligen Brunnen 2,5 l negative und positive KontrollsiRNA hinzu.
- Verdünnen Sie das Transfektionsreagenz in 1x D-PBS, um genügend Lösung zu liefern, um 0,1 l Transfektionsreagenz in jedem Brunnen bereitzustellen, und die verdünnte Transfektionslösung bei Raumtemperatur für 5 min vorinkubieren.
- Fügen Sie jedem Brunnen in der Assayplatte 7,5 l des Transfektionsreagenz/PBS-Lösungsgemisches hinzu und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 40 l A549-Zellen (1.500 Zellen/well) hinzu, die in RPMI 1640 Medium suspendiert sind, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS). Halten Sie Zellen für eine 3-tägige Inkubationszeit bei 37 °C in einer Atmosphäre, die 5%CO2enthält. Diese Zellen teilen sich alle 24 Stunden, so dass sich etwa 12.000 Zellen drei Tage nach der Transfektion in den Brunnen befinden.
- Waschen Sie eine zwei Wochen alte GFP-ausdruckende Mtb H37Rv Kultur mit D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 5 min und entsorgen Sie die Wäsche. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. (Für GFP-Mtb H37Rv Kulturbedingungen siehe Protokoll 3).
- Setzen Sie das bakterielle Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und Dekanat für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um bakterielle Aggregate sedimentieren zu lassen.
- Sammeln Sie den bakteriellen Überstand und messen Sie OD600 (OD600 sollte zwischen 0,6-0,8 liegen) und GFP-Fluoreszenz (RFU-Wert) mit einem Mikroplattenleser, um die bakterielle Konzentration zu bestimmen. Berechnen Sie den Titer der Suspension mit einer Referenzregressionslinie, die den RFU-Wert = f (CFU-Wert) anzeigt, der vor dem Experiment an einer anderen Kultur generiert wurde, die unter den gleichen Bedingungen vorbereitet worden war. Bereiten Sie bakterielle Suspension mit 2,4 x 106 Bakterien/ml vor, was einer Infektionsvielzahl (MOI) von 5 entspricht.
- Entfernen Sie das Medium in der 384-Well-Assay-Platte und fügen Sie 25 l frisch zubereitete bakterielle Suspension hinzu.
- Inkubieren Sie die 384-Well-Assayplatte bei 37 °C für 5 Stunden in einer Atmosphäre mit 5%CO2.
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit RPMI Medium ergänzt mit 10% FBS 3x.
- Um die verbleibenden extrazellulären Bakterien abzutöten, behandeln Sie die Zellen mit 50 l frischem RPMI-FBS-Medium, das 50 g/ml Amikacin bei 37 °C für 1 Stunde in einer Atmosphäre mit 5%CO2enthält.
- Entfernen Sie das mittelhaltige Amikacin und fügen Sie 50 l frisches RPMI-Medium hinzu, das mit 10% FBS ergänzt wird. Inkubieren Sie die 384-Well-Assayplatte bei 37 °C 5 Tage lang in einer Atmosphäre, die 5%CO2enthält.
- Vor der Bildaufnahme 10 l frisch zubereitete 30 g/ml DAPI in PBS (Endkonzentration 5 g/ml) hinzufügen und 10 min bei 37 °C inkubieren.
- Laden Sie die Platte in das automatische konfokale Mikroskop.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Legen Sie die Belichtungsparameter fest. Aufnahme der DAPI-Fluoreszenz mit Anregungslaser 405 nm mit Emissionsfilter 450 nm und GFP-Fluoreszenz mit Anregungslaser 488 nm mit Emissionsfilter 520 nm.
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Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Wählen Sie die Brunnen und die Felder in jedem zu erwerbenden Brunnen aus, der dann als Layout- und Unterlayoutparameter bezeichnet wird.
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Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Generieren Sie die Experimentierdatei mit den Parametern aus den Schritten 1.20 und 1.21, und führen Sie die automatische Erfassung aus.
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Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Übertragen Sie Bilder auf den Remote-Server.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Bewerten Sie Bilder mit Bildanalysesoftware. Erkennen Sie Zellkerne aus dem DAPI-Kanal mithilfe des Kernerkennungsalgorithmus und des Bakterienbereichs aus dem GFP-Kanal mithilfe des Algorithmus für die Eigenschaften der Pixelintensität (Abbildung 4A).
Hinweis: Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Wirkung von Gen-Silencing auf das intrazelluläre Mtb-Wachstum zu untersuchen. Mtb ist ein langsam wachsendes Bakterium, das sich alle 20 Stunden unter optimalen Bedingungen teilt. Nach 5 Tagen nach der Infektion ist die Menge an extrazellulärem Mtb ohne Zelllyse immer noch gering und hatte keinen Einfluss auf die Qualität der Analyse. Dieses Protokoll muss hinsichtlich der Länge der Antibiotikabehandlung und der Inkubationszeit optimiert werden, um für siRNA-Bildschirme mit schnell wachsende Bakterien wie Mykobakterien smegmatis und Escherichia coli angepasst zu werden, die extensiv freigesetzt werden und neue Zellen infizieren können.
2. Hochdurchsatz Compound Screening
Screening an Mtb H37Rv infizierten Wirtszellen durchgeführt. Dieses Verfahren ist in Abbildung 1Bbeschrieben.
- Die 384-Well-Mutterplatten, die die in DMSO zu 100% lösliche zusammengesetzte Bibliothek enthalten, auftauen. Übertragen Sie 0,5 l der Verbindungen in 384-Well-Tochterplatten, die 10 l RPMI 1640 Medium enthalten, ergänzt mit 10% FBS.
- Waschen Sie eine zwei Wochen alte GFP-ausdruckende Mtb H37Rv Kultur mit D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 5 min und entsorgen Sie die Wäsche. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x (Für GFP-Mtb H37Rv Kulturbedingungen siehe Protokoll 3).
- Setzen Sie das bakterielle Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und Dekanat für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um bakterielle Aggregate sedimentieren zu lassen.
- Sammeln Sie den bakteriellen Überstand und messen Sie OD600 (OD600 sollte zwischen 0,6-0,8 liegen) und GFP-Fluoreszenz (RFU-Wert) mit einem Mikroplattenleser. Berechnen Sie den Titer der Suspension mit einer Referenzregressionslinie, die den RFU-Wert = f (CFU-Wert) anzeigt, der vor dem Experiment generiert wurde. Typische Konzentration beträgt 1 x 108 Bakterien/ml.
- Ernte 6 Tage alte primäre menschliche Makrophagen bei 4 x 105 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 50 ng/ml rekombinantem menschlichen M-CSF (Für menschliche periphere Blutmonozytenzellen Reinigung und Makrophagen Differenzierung siehe Protokoll 4).
- Inkubieren Sie die verdünnten Primärzellen mit Bazillen bei verschiedenen MOI, von 1-5, in Suspension mit leichtem Schütteln bei 90 Rprossen für 2 Stunden bei 37 °C.
- Waschen Sie die infizierten Zellen durch Zentrifugation bei 350 x g, um die extrazellulären Bakterien zu entfernen. Nach jedem Zentrifugationsschritt das Pellet in RPMI 1640 medium, ergänzt mit 10% FBS, wieder aufsetzen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
- Setzen Sie die infizierten Zellen in RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und Amikacin, bei 50 g/ml aus und inkubieren Sie die Suspension mit leichtem Schütteln für 1 Stunde bei 37 °C.
- Entfernen Sie das amikacinhaltige Zellkulturmedium durch Zentrifugation bei 350 x g und waschen Sie die infizierten Zellen mit dem vollständigen RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und 50 ng/ml rekombinantem humanem M-CSF. Wiederholen Sie dies einmal.
- Fügen Sie in Schritt 2.1 40 l der infizierten Makrophagensuspension in die gleiche Assayplatte ein, die bereits 10 l der zusammengesetzten Verdünnungen enthält. Die endgültige Konzentration von DMSO in jedem Brunnen hat nun 1% erreicht.
- Inkubieren Sie die Assayplatten 5 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre, die 5%CO2enthält.
- Färben Sie die lebenden Zellen mit zelldurchlässigen, weitroten Fluoreszenzfarbstoffen.
- Laden Sie die Platte in das automatische konfokale Mikroskop.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Legen Sie die Belichtungsparameter fest. Zeichnen Sie die weitrote Fluoreszenz mit Anregungslaser 640 nm mit Emissionsfilter 690 nm und GFP-Fluoreszenz mit Anregungslaser 488 nm mit Emissionsfilter 520 nm auf.
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Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Wählen Sie die Brunnen und die Felder in jedem zu erwerbenden Brunnen aus, der dann als Layout- und Unterlayoutparameter bezeichnet wird.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Generieren Sie die Experimentierdatei mit den Parametern aus den Schritten 2.14 und 2.15, und führen Sie die automatische Erfassung aus.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Übertragen Sie Bilder auf den Remote-Server.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. - Bewerten Sie Bilder mit Bildanalysesoftware. Erkennen Sie den Zellbereich aus dem rot-roten Kanal mithilfe des Algorithmus für die Pixelintensitätseigenschaften und des Bakterienbereichs aus dem GFP-Kanal mithilfe des Algorithmus für die Pixelintensitätseigenschaften (Abbildung 4B).
Hinweis: Dieses Protokoll kann für mtb mutierte Bibliothek Screening angepasst werden, indem Verbindungen durch Mutanten, die ein fluoreszierendes Protein (One well/One mutant)(Abbildung 1C, siehe auch Brodin et al. 4). Fluoreszierende Mutanten werden zuerst in Brunnen ausgesät (20 l bakterielle Suspension pro Brunnen). Die Bakterien werden dann durch 30 l Zellsuspension zurückgewonnen. Nach zentrifugieren bei 350 x g für 1 min wird die Platte bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert. Inkubationszeit und MOI hängen vom Test ab. Zum Beispiel für die Visualisierung von frühen zellulären Ereignissen wie Phagosomenversauerung, können die Zellen für 2 Stunden mit MOI im Bereich von 1-20 infiziert werden. Lysosomen werden in einer Atmosphäre mit 5 %CO2-Gehalt mit Lysotracker-Farbstoff mit 2 m bei 1,5 stunden bei 37 °C gefärbt und anschließend entweder mit 10 % Formalin oder 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Konfokale Bilder werden erfasst und schließlich mit Bildanalyseskripten mit geeigneten Algorithmen für die Lysosomenerkennung und subzelluläre Lokalisierung analysiert4.
3. Grünes fluoreszierendes Protein, das Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Kulturbedingungen ausdrückt
Zur Langzeitlagerung wurden GFP-H37Rv in D-PBS eingefroren (ca. 1 x 108 Mykobakterien pro Durchstechflasche).
- Eine gefrorene Durchstechflasche GFP-H37Rv in einem Erlenmeyerkolben mit 50 ml 7H9-Brühenmedium, ergänzt mit Middlebrook OADC-Anreicherung 10%, Glycerin 0,5%, Tween-80 0,05% und Hygromycin B (50 g/ml) wieder aufsetzen.
- 8 Tage bei 37 °C inkubieren.
- Messen Sie OD600 der GFP-H37Rv-Kultur.
- Verdünnen Sie die GFP-H37Rv-Kultur, um OD600 = 0,1 in frischem 7H9-Brühenmedium zu erhalten, ergänzt mit Middlebrook OADC-Anreicherung 10%, Glycerin 0,5%, Tween-80 0,05% und Hygromycin B (50 g/ml).
- Inkubieren Sie den GFP-H37Rv bei 37 °C für 8 Tage mehr vor der Anwendung für den Test.
4. Humane periphere Blutmonozytenzellen Reinigung aus Vollblut oder Buffy-Coat-Präparation
- Verdünnen Sie den Blutbeutel 2x in 1x D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) mit 1% FBS.
- Isolieren Sie die Monozyten durch Ficoll DichteGradientzentrifugation bei 400 x g für 20 min.
- Sammeln Sie die isolierten Monozyten.
- Waschen Sie die Monozyten 3x mit 1x D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) mit 1% FBS durch Zentrifugation bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Konzentrieren Sie die Zellen auf 1 x 107 Zellen/ml.
- Reinigen Sie Monozyten mit CD14-Magnetperlen gemäß dem Herstellerprotokoll (siehe Materialien).
- Nach der Reinigung von CD14-Monozyten werden die Zellen bei 1,5 x 106 Zellen/ml in RPMI 1640 mit 10% FBS und 40 ng/ml humanem Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (hM-CSF) ergänzt und 4 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert.
- Nach 4 Tagen das Medium durch frisches RPMI 1640 ersetzen, ergänzt durch 10% FBS und 40 ng/ml hM-CSF und 2 Tage bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert.
- Nach 6 Tagen können die Zellen für den Test verwendet werden.
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Representative Results
Genom-weites SiRNA-Screening mit hohem Durchsatz
Mtb ist in der Lage, Immunzellen in vitro sowie mehrere andere Lungenepithelzellen zu kolonisieren. Zum Beispiel ist Mtbin der Lage, A549 Epithelzellen zu infizieren und zu schädigen, die häufig als Modell für menschliche Typ-II-Pneumozyten5-7verwendet werden. Dectin-1 wurde als Wirtzellrezeptor berichtet, der an der Mtb-Aufnahme, proflammatorischen Reaktion und antibakteriellen Wirkung auf intrazelluläres mykobakterielles Wachstum in A549-Zellen8beteiligt ist. siRNA-Bedingung, die in Protokoll 1 beschrieben wurde, führte zu 85% der Silencing-Effizienz (Daten nicht gezeigt). Die Silencing Dectin-1-Expression mit siRNA führte zu einer Abnahme der intrazellulären Mykobakterienmenge in A549-Zellen. Tatsächlich wird der Prozentsatz der infizierten Zellen nach 3 Tagen Silencing und 5 Tagen Infektion in Dectin-1-stummen A549-Zellen im Vergleich zu Zellen, die mit nicht zielführendem Scramble siRNA transfiziert wurden, zweimal reduziert (Abbildungen 2A und 2B). Wir haben die stichprobenbasierte Normalisierung von siRNA gezielt Dectin-1 im Vergleich zu Scramble angewendet, um Z-Score zu definieren. Wie in Abbildung 2Cdargestellt, haben wir einen Z-Score-Durchschnitt um -15 für siRNA gezielt Dectin-1 erhalten. Dectin-1 kann als positive Kontrolle für den siRNA-Bildschirm verwendet werden, um andere neuartige Wirtsfaktoren zu entdecken, die an der Mtb-Kolonisation in Pneumozyten beteiligt sind, die den gleichen Phänotyp wie der mit der Dectin siRNA haben könnten. Die Verwendung einer siRNA, die sich auf den Phänotyp auswirkt, als Kontrolle auf jeder Mikroplatte während des Bildschirms ermöglicht die Normalisierung jeder Platte, was nützlich ist, wenn man eine ganze Genom-Screen-Analyse durchführen möchte. Der statistische Parameter Z' war 0,1 unter Verwendung einer kontrollbasierten Normalisierung auf Scramble und siRNA gezielteDectin1, die ein akzeptabler Wert für die Validierung der siRNA Screening-Daten ist.
Hochgehalt Compound Screening
Die Zusammengesetzte Effizienz des intrazellulären bakteriellen Wachstums wird durch die Festlegung einer Dosis-Reaktions-Kurve (DRC) bewertet und auf die Referenz-positive Verbindung und negative zusammengesetzte Lösungsmittelkontrollen normalisiert. Repräsentative DEMOKRATISCHE Republik Kongo von zwei Referenzverbindungen, Isoniazid (INH) und Rifampicin (RIF), aktiv gegen Mtb-Wachstum, sind in Abbildung 3dargestellt. Diese Kurven werden in menschlichen primären Makrophagen erhalten, die von einem GFP-exezierenden Mtb H37Rv-Stamm infiziert sind, mit Auslesung nach 5 Tagen nach der Infektion. DMSO und INH mit einer Endkonzentration von 1 % bzw. 0,1 g/ml werden häufig als negative und positive Kontrollen verwendet, die ein basales Wirkungsgrad (0 und 100 %) bieten. (Abbildung 3A). Im Anschluss an den in Abbildung 4Bbeschriebenen Bildanalyseprozess werden multiparametrische Daten aus konfokalen Fluoreszenzbildern infizierter-menschlicher Makrophagen extrahiert, die vom automatisierten konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden. Aktive Verbindungen, die sich auf die intrazelluläre Replikation von Mtb in Wirtszellen auswirkten, führten zu einer Abnahme der mykobakteriellen Belastung, die dem Bereich des GFP-Signals in Zellen auf Bildern entspricht (Abbildung 3B). Das Verhältnis zwischen intrazellulärer Bakterienfläche und Gesamtzellfläche, berechnet mit bildbasierter Analysesoftware, wird in Abhängigkeit von der zusammengesetzten Konzentration dargestellt, die die DRC erzeugt (Abbildung 3B). Diese Kurven ermöglichen die Bestimmung sowohl der Konzentration, die erforderlich ist, um die bakterielle Belastung um 50 % (IC50) zu verringern, als auch der minimalen Konzentration, die erforderlich ist, um 99 % der bakteriellen Replikation zu hemmen (MIC99) (Abbildung 3C). Z' basierend auf der Kontrolle DMSO 1% und der Kontrolle INH 0,1 g/ml betrug 0,49. Dieses Z', wirklich nahe 0,5, ist akzeptabel, um diesen Test zu validieren.
Abbildung 1. Visuelle Screening-Ansätze mit hohem Inhalt. Schematische Darstellung des Mtb-Infektionsmodellsystems, das für die Bildschirme siRNA (A), chemische Verbindungen (B) und Mtb-Mutationen ( C ) verwendet wird. (A) siRNA-Bibliotheksbildschirm: Die Zellen wurden 3 Tage lang mit siRNA in 384-Well-Platten mit Reverse-Transfektionsmethode transfiziert. siRNA transfizierte Zellen wurden mit GFP-Mtb infiziert und 5 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert. Die Zellen wurden dann gefärbt und Bilder mit einem automatisierten konfokalen Mikroskop gesammelt. (B) Compounds Bibliothek Bildschirm: die Verbindungen wurden in 384-Well-Platten verteilt. Zellsuspension und GFP-Mtb wurden zusammen für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Infizierte Zellen wurden in den Platten ausgesät und 5 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert. Die Zellen wurden dann gefärbt und Bilder mit einem automatisierten konfokalen Mikroskop gesammelt. (C) Fluoreszierende - Mtb-Mutantenbibliothek: Die fluoreszierenden Mtb-Mutationen wurden in 384-Well-Platten gesät und die Wirtszellsuspension verteilt. Die Inkubationszeit variierte je nach Test. Die Zellen oder Zellbläschen wurden vor der automatisierten Bildaufnahme gefärbt. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Dectin-1-Stummschaltung wirkt sich auf die Mtb-Kolonisation in A549-Zellen aus. (A) Repräsentative konfokale Bilder (10X Luftlinse) von A549-Zellen, die mit nicht zielführender siRNA (Scramble) oder mit siRNA spezifisch für Dectin-1 transfiziert und 5 Tage lang mit GFP-Mtb H37Rv (MOI5) infiziert sind. Der Maßstabsbalken stellt 200 m (A) GFP-Mtb H37Rv in Grün und die Zellen in Rot visualisiert dar. Die Anzahl der Zellen(A. Zelldetektion) und die intrazelluläre GFP-Mtb H37Rv-Last(A. Bakterienbereich) wurden mittels bildbasierter Analysesoftware ermittelt. (B) Grafische Darstellung des Prozentsatzes der infizierten A549-Zellen in 5 Replikationen (w1 bis w5) von Scramble siRNA (blaue Kreise) und Dectin-1 siRNA (rote Kreise). (C) Grafische Darstellung des Z-Score-Durchschnitts von Scramble siRNA und Dectin-1 siRNA. (*** p-Wert < 0,0001). Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Dosis-Wirkungs-Kurve von aktiven Referenzverbindungen gegen Mtb in menschlichen Makrophagen. (A und B) Repräsentative konfokale Bilder (20X Wasserlinse) von menschlichen Makrophagen (rot, mit rotem Fluoreszenzfarbstoff beschriftet) mit GFP-Mtb H37Rv (grün) mit einem MOI1 für 5 Tage infiziert. Der Maßstabsbalken entspricht 50 m. (A) Bilder von infizierten Zellen, die mit DMSO 1% als Negativkontrolle im Test verwendet werden. (B) Bilder von infizierten Zellen, die mit zunehmender Konzentration von zwei Referenzverbindungen isonazid (INH) und Rifampicin (RIF) inkubiert werden. (C) Dosis-Wirkungs-Kurven (DRC) von INH und RIF. Die bildbasierte Analyse ermöglichte die Bestimmung des DRK für jede getestete Verbindung. Die Demokratische Republik Kongo stellt das Verhältnis zwischen intrazellulärer GFP-Bakterienfläche und Gesamtzellfläche (Y-Achse) in Abhängigkeit von der zusammengesetzten Konzentration (Log-Skala, x-Achse) dar. In jedem Graphen wurde die DRC der Verbindung auf die der Negativkontrolle DMSO 1% (0% Hemmung) und der Positivkontrolle INH in einer Konzentration von 0,1 g/ml (100% Hemmung) normalisiert. Für jede Verbindung wurden die Konzentration, die erforderlich ist, um 50% der bakteriellen Besiedlung (IC50) zu hemmen, und die minimale hemmende Konzentration (MIC99) aus der Demokratischen Republik Kongo berechnet. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Standard-bildbasierte Analyse zur Bestimmung fluoreszierender intrazellulärer Mykobakterien. Bilder von 384-Well-Platten wurden mit einem automatisierten konfokalen Mikroskop aufgenommen. In diesem Fall wurden 4 verschiedene Bilder desselben Brunnens (Felder) aufgenommen. Jedes Feld wurde dann mit der bildbasierten Analysesoftware Acapella 2.6 (Perkin Elmer) analysiert. (A) Jedes Feld enthielt zwei Kanäle (zwei Farben), einen für die Bakterien (grün) und einen für die Zellkerne (blauer Kanal), die mit dem folgenden Algorithmus segmentiert wurden: i) Kernerkennung mit einem eingebauten Acapella-Verfahren, ii) Zytoplasma-Nachweis, basierend auf der Kernpopulation, mit einem eingebauten Acapella-Verfahren, iii) Bakteriennachweis, indem nur Pixel beibehalten werden, deren Intensität höher ist als ein manuell definierter Schwellenwert, iv) sich die Position der verschmelzenden Zellen mit der Position der Bakterien verschmelzen, um infizierte Zellen zu identifizieren. Die endgültigen Ergebnisse, ausgedrückt als Durchschnitt der vier Felder, sind die gesamte Bakterienfläche, die Gesamtzahl der Zellen, der Prozentsatz der infizierten Zellen und die Bakterienfläche pro Zelle (Durchschnitt aller infizierten Zellen). (B) Jedes Feld enthielt zwei Kanäle, einen für die Bakterien (grüner Kanal) und einen für die Zellkerne und das Zytoplasma (far-red channel), die mit dem folgenden Algorithmus segmentiert wurden: i) Filterung des ursprünglichen Kanals mit einem Anti-Median-Filter, ii) nur Pixel beibehalten, deren Intensität höher ist als ein manuell definierter Schwellenwert (jeder Kanal hat seinen eigenen Schwellenwert), iii) die verbleibende Anzahl von Pixeln für jeden Kanal zählen, iv) die Kanäle zusammenführen und die Anzahl der Pixel zählen, die von Bakterien und Kernen gemeinsam genutzt werden, um intrazelluläre Bakterien zu quantifizieren. Die endgültigen Ergebnisse, ausgedrückt als Durchschnitt der vier Felder, sind die gesamte Bakterienfläche, die gesamte zelluläre Fläche, die Gesamtfläche der intrazellulären Bakterien und das Verhältnis zwischen intrazellulärer Bakterienfläche und Gesamtfläche der Zellen. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
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Discussion
Wir beschreiben hier die Methoden, die für einen phänotypischen Test mit einem GFP-exezierenden Mtb H37Rv-Stamm erforderlich sind, um fluoreszierend markierte Wirtszellen zu infizieren, was ihn für Bildschirme mit hohem Gehalt/Hohem Durchsatz geeignet macht. Dieses Protokoll könnte auf eine breite Palette von Verbindungen, Fluoreszenzsonden und Mtb-Mutationen angewendet werden. Für jedes oben beschriebene Protokoll können fixierende und immunkende Schritte vor der Bildaufnahme durchgeführt werden. Wir verwenden ein automatisiertes fluoreszierendes Konfokalmikroskop, das mit einer 20X (NA 0.70) oder 60X (NA 1.2) Wasserlinse ausgestattet ist, um Bilder zu erfassen. Das Konfokalmikroskop ist mit Anregungslasern 405, 488, 561 und 640 nm ausgestattet. Die emittierte Fluoreszenz wird mit 3 Kameras erfasst, die mit einer Reihe von Filtern verbunden sind, die eine Erfassungswellenlänge von 450-690 nm abdecken. Es ist wichtig zu beachten, dass die Einstellung der Anregung und Der Emissionseinstellungen des Mikroskops von der Art der Farbstoffe oder Fluorchrome abhängt, die in jedem Experiment verwendet werden. Für phänotypische Assays werden DAPI oder Hoechst häufig bei 5 g/ml für 10 min verwendet, um Kerne zu färben. Zellen können jedoch auch mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt werden, die speziell für den Nachweis von Zytoplasma, Membran oder Zytoskelett spezifisch sind. Nach der Bildaufnahme sollten Bilder mit einer bildbasierten Analysesoftware analysiert werden. Zellsegmentierungsalgorithmen, die auf der Intensität jedes Pixels basieren, sollten verwendet werden, um die Anzahl der Zellen bzw. den intrazellulären Bakterienbereich zu ermitteln (siehe Abbildung 4). Die generierten Daten sollten anhand eines statistisch basierten Akzeptanzkriteriums abgewogen werden, um die Robustheit und Genauigkeit des Assays zu validieren.
Großflächige Hochdurchsatz-Bildschirme sind zeit- und ressourcenschonende Experimente. Daher ist es von größter Bedeutung, vorher die Eignung des Assays zu beurteilen. Die von phänotypischen Bildschirmen gesammelten Daten wurden mit Tabellenkalkulationssoftware wie Excel visualisiert und im Allgemeinen pro Platte normalisiert. Die gebräuchlichsten Qualitätsmetriken, die sowohl für siRNA- als auch für Kleinmolekül-Bildschirme verwendet werden, sind die Z. Das Z wird mit Mittelwert und Standardabweichung von positiven und negativen Kontrollen9definiert. Das Z quantifiziert, ob die Assay-Antwort groß genug ist, um ihre Anwendung für einen vollständigen Bildschirm von Proben zu validieren. Die Reichweite des Z ist negativ unendlich bis 1, mit >0.5 als sehr guter Test, >0 ein akzeptabler Test und <0 ein inakzeptabler Test. Im Vergleich zu den kleinmolekularen Bildschirmen, bei denen die Stärke der Steuerungen die Validierung des Assays mit Z > 0,5 ermöglicht, wirkt sich die Variabilität von siRNA-Bildschirmen auf die Z aus, die tendenziell niedriger sind (häufig zwischen 0,0-0,5)10. Tatsächlich hängt der Erfolg von siRNA-Bildschirmen von der Optimierung von i) der Effizienz der siRNA-Abgabe in die Zellen ab, ii) die durch die Transfektion induzierte Zytotoxizität und iii) die Assay-Bedingung für die Effizienz des Gen-Silencings. Die siRNA kann leicht in verschiedene Zelllinien transfiziert werden, wie HeLa, nach dem Transfektionsprotokoll des Herstellers, aber effiziente siRNA-Transfektion in einigen Zelllinien einschließlich Makrophagen bleibt eine Herausforderung. Dennoch könnte die virale vektorvermittelte Expression von kurzhaarigen RNAs (shRNA) eine gute Alternative darstellen11. Um der Schwierigkeit der Interpretation zu entgehen, werden die von siRNA-Bildschirmen gesammelten Daten häufig relativ zur normalen Standardverteilung normalisiert, um den Z-Wert (auch Z-Wert genannt) für jeden Punkt10,12zu definieren. Dann wurden Trefferstichproben nach dem Z-Score gewertet, der in der Regel unter -2 oder mehr als +2 liegt. Schließlich wurden ausgewählte Treffer im primären Bildschirm in einem sekundären Bildschirm mit weiteren Replikationen erneut getestet, um den im primären Bildschirm beobachteten Phänotyp zu bestätigen.
Unser Protokoll könnte problemlos für kleine Bildschirme mit Geräten angewendet werden. Um dies zu erreichen, sind die Assay-Miniaturisierung in den Mikro-Titerplatten und die Manipulation der Bibliothek von Molekülen erforderlich, um den Prozess der Konservierung, Abgabe und Vermischung zu optimieren13. Darüber hinaus wird empfohlen, eine automatisierte Roboterplattform einschließlich Dispensern zu verwenden, um die Assay-Bedingungen in den Mikrotiterplatten präzise und reproduzierbar zu steuern. Die riesige Datenmenge, die durch das Hochdurchsatz-Screening (HTS) erzeugt wird, sollte auch über eine Datenbank und eine angepasste Pipeline für die Bildanalyse des konfokalen Bildes, die Datenspeicherung und -übertragung verwaltet werden. Die in diesem Bericht vorgestellten Assays wurden in der Biosafety Level 3-Anlage (BSL3) durchgeführt. Die strikte Einhaltung der Sicherheit in BSL3 erhöht die Schwierigkeit der Bildschirme. Tatsächlich müssen viele Geräte, die für die Siebe benötigt werden, in BSL3 verfügbar sein und isoliert sein, um den Arbeitnehmer und die Umwelt vor Verunreinigungen zu schützen. Daher erforderte die Installation der angepassten Rohrleitung in BSL3 viel Platz. Aus diesem Grund wurde unser Protokoll entwickelt, um ein Maximum von Schritten aus dem BSL3 wie siRNA-Transfektion und Zusammengesetztentransfer auf die Platten durchgeführt zu haben. Die Zellinfektion durch Bildaufnahme wurden unter BSL3-Bedingungen durchgeführt. Die Bilder wurden dann in einem dedizierten Server übertragen und aus dem BSL3 analysiert.
Der hier beschriebene phänosepic Assay basierte auf zwei Methoden der Bildanalyse (Abbildung 4). Die erste Methode, die für das siRNA-Screening verwendet wurde, wurde entwickelt, um die Anzahl der infizierten Zellen zu geben. Dieser Parameter wurde gefunden, um die Wirkung der Gen-Silencing auf Mtb intrazelluläre Replikation effizient zu vergleichen. Beim Screening von Verbindungen reichte jedoch eine grundlegendere Auslesung auf der Grundlage der Gesamtfläche der Zellen aus, um Wirkstoffe eindeutig zu identifizieren. Da diese zweite Methode schneller und einfacher umzusetzen ist, wurde sie für die Analyse von Bildern bevorzugt, die sich aus dem Screening von Verbindungen ergeben. Um noch weiter zu gehen, könnten weitere fluoreszierende Farbstoffe und/oder Etikettiersonen hinzugefügt und Bildanalyseskripte optimiert werden, um multiparametrische Daten wie Kolokalisierung, Kerne und Zellmorphologie, Zelltod, bakterielle Aggregation sowie intrazellulären Handel mit den Bakterien zu generieren. Es ist wichtig zu beachten, dass es für intrazelluläre Handels- oder Kolokalisierungstests unerlässlich ist, Z-Stacks zu erhalten, um eine kumulative Bewertung anzuwenden.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.
Acknowledgments
Finanzielle Unterstützung für diese Arbeiten wurden von der Europäischen Gemeinschaft (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), der Agence Nationale de Recherche, der Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed BioMed) und der Region Nord Pas de Calais gewährt. Wir danken der technischen Unterstützung von Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni und Frank Lafont von der Plattform BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
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