Summary
Här beskriver vi en fenotypisk analys som är tillämplig på höggenomströmning / höginnehållsskärmar av små-störande syntetiskt RNA (siRNA), kemisk förening och Mycobacterium tuberculosis mutant bibliotek. Denna metod förlitar sig på detektion av fluorescerande märkt Mycobacterium tuberkulos inom fluorescerande märkt värdcell med hjälp av automatiserad confocal mikroskopi.
Abstract
Trots tillgången till terapi och vaccin är tuberkulos fortfarande en av de dödligaste och mest utbredda bakterieinfektionerna i världen. Sedan flera decennier är den plötsliga sprängningen av multi- och omfattande läkemedelsresistenta stammar ett allvarligt hot mot kontrollen av tuberkulos. Därför är det viktigt att identifiera nya mål och vägar som är kritiska för tuberkulosens orsaksmedel, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) och att söka efter nya kemikalier som kan bli tbc-läkemedel. Ett tillvägagångssätt är att sätta upp metoder som är lämpliga för genetiska och kemiska skärmar i storskaliga bibliotek som möjliggör sökning av en nål i en höstack. För detta ändamål utvecklade vi en fenotypisk analys som förlitar sig på detektion av fluorescerande märkt Mtb inom fluorescerande märkta värdceller med hjälp av automatiserad konfokal mikroskopi. Denna in vitro-analys möjliggör en bildbaserad kvantifiering av koloniseringsprocessen av Mtb i värden och optimerades för 384-brunns microplate-formatet, vilket är lämpligt för skärmar av siRNA-, kemisk förening- eller Mtb-mutantbibliotek. Bilderna bearbetas sedan för multiparametrisk analys, vilket ger läs upp härdning på patogenesen vid Mtb i värdceller.
Introduction
Bland de framväxande och nya infektionspatogener som rapporterats under de senaste åren har Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en framträdande plats som ansvarar för 1,4 miljoner dödsfall och 8,7 miljoner nya infektioner 2011 (Global tuberkulosrapport 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Trots tillgången till multiresistenta behandlingar ökar fortfarande antalet smittade och multiresistenta (MDR) samt omfattande läkemedelsresistenta (XDR) Mtb sprider sig snabbt över hela världen1. Dessutom, när man tar hänsyn till förekomsten av Mtb-antigener, är det uppenbart att en tredjedel av den globala befolkningen anses vara latent infekterad av Mtb. Statistiskt sett, i ett fall av tio, finns det utveckling mot den aktiva formen av sjukdomen med efterföljande kliniska symtom2. Därför finns det ett trängande behov av nya medel för att bekämpa Mtb. I detta sammanhang utvecklade vi en in vitro visuell fenotypisk analys som förlitar sig på övervakning av Mtb invasion och multiplikation i värdceller av automatiserad confocal fluorescensmikroskopi3. Anpassningen av analysen i 384-brunns mikrotiterplattor i kombination med automatiserad bildförvärv och analys tillät screening med högt innehåll/hög genomströmning (HC/HTS) av medelstora bibliotek av föreningar, siRNAs och bakteriella mutanter. Screeningen av ett genomomfattande RNAi-bibliotek på denna fenotypiska analys möjliggjorde således identifieringen av de viktigaste värdfaktorerna som är involverade i Mtb-handel och intracellulär replikering men också klarering av värdvägar som utnyttjas av tuberkelbacilillus. En annan anpassning av denna särskilda fenotypiska analys var för identifiering av bakteriella faktorer som är väsentliga för Mtb intra-phagosomal persistens. Till exempel anses gripandet av fagolik mognad som en av de viktigaste mekanismerna som underlättar överlevnad och replikering av Mtb i makrofag. Övervakning av subcellulär lokalisering av Mtb knockout mutanter i fluorescerande märkta-sura fack tillåtna för identifiering av bakteriella gener som är involverade i överlevnadsprocessen4. Slutligen erbjuder den högkvalitativa avbildningen av Mtb också en utmärkt metod för att kvantifiera läkemedelseffektivitet för att hämma olika fenomen som intracellulär bakterietillväxt3. Sammantaget möjliggör denna typ av fenotypisk analys med hög genomströmning accelererande läkemedelsupptäckt mot tbc och de data som samlas in av dessa olika metoder bidrar till en bättre förståelse av värdmanipulationen som utövas av Mtb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genomomfattande siRNA-screening med hög genomströmning
Screening utförs i en human typ II pneumocytes modell A549 cellinje vid infektion med Mtb H37Rv uttrycker gröna fluorescerande protein (GFP). Denna procedur beskrivs i figur 1A.
- Återanvänd det torkade siRNA-biblioteket som lagras i moderplattor (96-brunnsplattor) med 1x siRNA-buffert för att nå en koncentration av 4 μM och överför sedan 10 μl av blandningen till en 384-brunns dotterplatta (dotterplatta 1).
- Tillsätt 10 μl 1x siRNA-buffert i dotterplatta 1 för att späda siRNA med 2 gånger. Efter siRNA resuspension förseglas plattorna med skalbar aluminiumtätning och kan lagras vid -20 °C minst 6 månader och upp till 2-3 år, men lagringstiden kan variera beroende på siRNA-bibliotekstillverkarens rekommendationer.
- Späd siRNAs i dotter tallrik 1 till dotter tallrik 2 för att nå en koncentration av 500 nM. Efter siRNA resuspension förseglas plattorna med skalbar aluminiumtätning och kan lagras vid -20 °C minst 6 månader och upp till 2-3 år, men lagringstiden kan variera beroende på siRNA-bibliotekstillverkarens rekommendationer.
- Före användning, tina dotterplatta 2 vid rumstemperatur.
- Ta 2,5 μl siRNA från dotterplåt 2 och placera i en 384-brunns analysplatta.
- I samma 384-brunnsanalysplatta i steg 1,5, tillsätt 2,5 μl negativ och positiv kontroll siRNA till sina respektive brunnar.
- Späd transfection reagenset i 1x D-PBS för att ge tillräckligt med lösning för att ge 0,1 μl transfection reagens i varje brunn och förinkubera den utspädda transfection lösningen vid rumstemperatur i 5 min.
- Tillsätt 7,5 μl av transfection reagens/PBS-lösningsblandningen till varje brunn i analysplattan och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 40 μl A549-celler (1 500 celler/brunn) upphängda i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% fetala nötkreatursserum (FBS). Underhåll celler under en inkubationstid på 37 °C i en atmosfär som innehåller 5 % CO2. Dessa celler delar sig var 24: e timme, så cirka 12 000 celler finns i brunnarna tre dagar efter transfektion.
- Tvätta en två veckor gammal GFP-uttryckande Mtb H37Rv kultur ut med D-PBS (fri från MgCl2 och CaCl2) genom centrifugering vid 4000 x g i 5 min och kassera tvättarna. Upprepa det här steget 3x. (För GFP-Mtb H37Rv odlingsförhållanden se protokoll 3).
- Suspendera bakteriepelleten i 10 ml RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS och dekantera i 1 timme vid rumstemperatur för att tillåta bakteriella aggregat till sediment.
- Samla bakteriellt supernatant och mät OD600 (OD600 ska vara mellan 0,6-0,8) och GFP-fluorescens (RFU-värde) med hjälp av en mikroplatta läsare för att bestämma bakteriekoncentrationen. Beräkna titern för fjädringen med hjälp av en referensregressionslinje som visar RFU-värde = f (CFU-värde) som hade genererats före experimentet på en annan kultur som hade förberetts under samma förhållanden. Förbered bakteriell suspension som innehåller 2,4 x 106 bakterier/ml, vilket motsvarar en multiplicitet av infektion (MOI) på 5.
- Ta bort mediet i 384-brunnstestet och tillsätt 25 μl nylagad bakteriesuspension.
- Inkubera 384-brunnstestplattan vid 37 °C i 5 timmar i en atmosfär som innehåller 5 % CO2.
- Ta bort mediet och tvätta försiktigt cellerna med RPMI medium kompletterat med 10% FBS 3x.
- För att döda de återstående extracellulära bakterierna, behandla cellerna med 50 μl färskt RPMI-FBS-medium som innehåller 50 μg/ml amikacin vid 37 °C i 1 timme i en atmosfär som innehåller 5 % CO2.
- Ta bort den mediumhaltiga amikacinen och tillsätt 50 μl färskt RPMI-medium kompletterat med 10% FBS. Inkubera 384-brunnstestplattan vid 37 °C i 5 dagar i en atmosfär som innehåller 5 % CO2.
- Innan bilden förvärvas, tillsätt 10 μl nyberedda 30 μg/ml DAPI i PBS (slutlig koncentration 5 μg/ml) och inkubera i 10 min vid 37 °C.
- Ladda plattan i automatiserat konfokalt mikroskop.
Klicka här om du vill visa större bild. - Ställ in exponeringsparametrarna. Registrera DAPI fluorescens med excitationslaser 405 nm med emissionsfilter 450 nm och GFP fluorescens med excitationslaser 488 nm med emissionsfilter 520 nm.
Klicka här om du vill visa större bild.
Klicka här om du vill visa större bild. - Markera de brunnar och fält i varje brunn som ska förvärvas, som sedan kallas layout- och underlayoutparametrar.
Klicka här om du vill visa större bild.
Klicka här om du vill visa större bild. - Generera experimentfilen med hjälp av parametrarna från steg 1.20 och 1.21 och kör det automatiska förvärvet.
Klicka här om du vill visa större bild.
Klicka här om du vill visa större bild. - Överför avbildningar till fjärrservern.
Klicka här om du vill visa större bild. - Utvärdera bilder med hjälp av bildanalysprogramvara. Detektera cellkärnor från DAPI-kanalen med hjälp av algoritmen för detektering av atomkärnor och bakterieområdet från GFP-kanalen med hjälp av algoritmen för pixelintensitetsegenskaper (Figur 4A).
Obs: Detta protokoll är optimerat för att studera effekten av gensilencing på den intracellulära Mtb tillväxten. Mtb är en långsamt växande bakterie som delar var 20:e timme under optimala förhållanden. Efter 5 dagar efter infektion är mängden extracellulär Mtb fortfarande låg i avsaknad av celllys och påverkade inte analysens kvalitet. Detta protokoll måste optimeras när det gäller längden på antibiotikabehandling och inkubationstid som ska anpassas för siRNA-skärmar med snabbväxande bakterier som Mycobacteria smegmatis och Escherichia coli som frigörs i stor utsträckning och kan infektera nya celler.
2. Screening av höggenomströmningsförening
Screening utförd på Mtb H37Rv infekterade värdceller. Denna procedur beskrivs i figur 1B.
- Tina de 384-brunniga moderplattorna som innehåller det sammansatta biblioteket lösligt i DMSO 100%. Överför 0,5 μl av föreningarna i 384-brunns dotterplattor som innehåller 10 μl RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS.
- Tvätta en två veckor gammal GFP-uttryckande Mtb H37Rv kultur ut med D-PBS (fri från MgCl2 och CaCl2) genom centrifugering vid 4000 x g i 5 min och kassera tvättarna. Upprepa det här steget 3x (För GFP-Mtb H37Rv odlingsförhållanden se protokoll 3).
- Suspendera bakteriepelleten i 10 ml RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS och dekantera i 1 timme vid rumstemperatur för att tillåta bakteriella aggregat till sediment.
- Samla bakteriellt supernatant och mät OD600 (OD600 ska vara mellan 0,6-0,8) och GFP-fluorescens (RFU-värde) med hjälp av en mikroplatta läsare. Beräkna titern för fjädringen med hjälp av en referensregressionslinje som visar RFU-värde = f (CFU-värde) som hade genererats före experimentet. Typisk koncentration är 1 x 108 bakterier/ml.
- Skörda 6 dagar gamla primära humana makrofager vid 4 x 105 celler/ml i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 50 ng/ml rekombinant human M-CSF (För humant perifert blod Monocyt celler rening och makrofager differentiering se protokoll 4).
- Inkubera de utspädda primärcellerna med bacilli vid olika MOI, från 1-5, i suspension med mild skakning vid 90 varv/min i 2 timmar vid 37 °C.
- Tvätta de infekterade cellerna med centrifugering vid 350 x g för att avlägsna de extracellulära bakterierna. Efter varje centrifugationssteg, återanvänd pelleten i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS. Upprepa det här steget 2x.
- Suspendera de infekterade cellerna i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS och amikacin vid 50 μg/ml och inkubera suspensionen med mild skakning i 1 timme vid 37 °C.
- Ta bort cellkulturmediet som innehåller amikacin genom centrifugering vid 350 x g och tvätta de infekterade cellerna med komplett RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS och 50 ng/ml rekombinant mänsklig M-CSF. Upprepa en gång.
- Tillsätt 40 μl av de infekterade makrofager suspensionen i samma analysplatta i steg 2.1, som redan innehåller 10 μl av de sammansatta utspädningarna. Den slutliga koncentrationen av DMSO i varje brunn har nu nått 1%.
- Inkubera analysplattorna i 5 dagar vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5 % CO2.
- Färga levande celler med cellpermeant långt röd fluorescerande färgämne.
- Ladda plattan i automatiserat konfokalt mikroskop.
Klicka här om du vill visa större bild. - Ställ in exponeringsparametrarna. Registrera långröd fluorescens med excitationslaser 640 nm med emissionsfilter 690 nm och GFP fluorescens med excitationslaser 488 nm med emissionsfilter 520 nm.
Klicka här om du vill visa större bild.
Klicka här om du vill visa större bild. - Markera de brunnar och fält i varje brunn som ska förvärvas, som sedan kallas layout- och underlayoutparametrar.
Klicka här om du vill visa större bild.
Klicka här om du vill visa större bild. - Generera experimentfilen med hjälp av parametrarna från steg 2.14 och 2.15 och kör det automatiska förvärvet.
Klicka här om du vill visa större bild.
Klicka här om du vill visa större bild. - Överför avbildningar till fjärrservern.
Klicka här om du vill visa större bild. - Utvärdera bilder med hjälp av bildanalysprogramvara. Detektera cellområdet från den långröda kanalen med hjälp av pixelintensitetsegenskaper algoritm och bakterieområde från GFP-kanalen med hjälp av pixelintensitetsegenskaper algoritm (Bild 4B).
Obs: Detta protokoll kan anpassas för Mtb mutant bibliotek screening genom att ersätta föreningar med mutanter som uttrycker ett fluorescerande protein (En brunn / En mutant) (Figur 1C, se även Brodin et al. 4). Fluorescerande mutanter sås först i brunnar (20 μl bakteriell suspension per brunn). Bakterier återvinns sedan med 30 μl cellsuspension. Efter centrifugering vid 350 x g i 1 min inkuberas plattan vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5 % CO2. Inkubationstiden och MOI beror på analysen. Som ett exempel, för visualisering av tidiga cellulära händelser som fagosome försurning, cellerna kan infekteras i 2 timmar med MOI sträcker sig från 1-20. Lysosomer färgas med Lysotracker färgämne vid 2 μM i 1,5 timmar vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5% CO2 och sedan fixeras med antingen 10% formalin eller 4% paraformaldehyd (PFA). Konfokala bilder förvärvas och analyseras slutligen med hjälp av bildanalysskript med lämpliga algoritmer för lysosomdetektering och subcellulärlokalisering 4.
3. Grönt fluorescerande protein som uttrycker mykobakterie tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Kulturförhållanden
För långtidslagring frystes GFP-H37Rv i D-PBS (cirka 1 x 108 mykobakterier per injektionsflaska).
- Återanvänd en flaska med fryst lager av GFP-H37Rv i en Erlenmeyerkolv som innehåller 50 ml 7H9 buljongmedium kompletterat med Middlebrook OADC-berikning 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% och Hygromycin B (50 μg/ml).
- Inkubera 8 dagar vid 37 °C.
- Mät OD600 av GFP-H37Rv-kulturen.
- Späd GFP-H37Rv-kulturen för att erhålla OD600 = 0,1 i färskt 7H9 buljongmedium kompletterat med Middlebrook OADC-anrikning 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% och Hygromycin B (50 μg/ml).
- Inkubera GFP-H37Rv vid 37 °C i 8 dagar till före användning för analysen.
4. Humant perifert blod Monocytceller Rening från helblod eller buffy-coat förberedelse
- Späd blodpåsen 2x i 1x D-PBS (fri från MgCl2 och CaCl2)som innehåller 1% FBS.
- Isolera monocyterna med Ficoll-densitetsgradientcentrifugering vid 400 x g i 20 min.
- Samla de isolerade monocyterna.
- Tvätta monocyterna 3x med 1x D-PBS (fri från MgCl2 och CaCl2) som innehåller 1% FBS genom centrifugering vid 400 x g i 10 min vid rumstemperatur.
- Koncentrera cellerna upp till 1 x 107 cell/ml.
- Rena monocyter med CD14-magnetiska pärlor enligt tillverkarens protokoll (se Material).
- Efter CD14-monocyter rening, så cellerna på 1,5 x 106 cell/ml i RPMI 1640 kompletteras med 10% FBS och 40 ng/ml av mänskliga makrofager koloni stimulerande faktor (hM-CSF) och inkuberas i 4 dagar vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5% CO2.
- Efter 4 dagar ersätt mediet med färsk RPMI 1640 kompletterat med 10% FBS och 40 ng/ml hM-CSF och inkuberat i 2 dagar vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5% CO2.
- Efter 6 dagar kan cellerna användas för analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genomomfattande siRNA-screening med hög genomströmning
Mtb kan kolonisera immunceller in vitro samt flera andra lungepitela celler. Till exempel kan Mtbinfektera och skada A549 epitelceller som vanligtvis används som modell för humana pneumocyter av typ II5-7. Dectin-1 rapporterades som en värd cell receptor som är involverade i Mtb upptag, proinflammatory svar och antibakteriell effekt på intracellulära mycobacterial tillväxt i A549 celler8. siRNA-tillstånd som beskrivs i protokoll 1 ledde till 85% av tysthetseffektiviteten (data visas inte). Silencing Dectin-1 uttryck med siRNA ledde till en minskning av intracellulära mycobacteria mängd i A549 celler. Efter 3 dagars ljuddämpande och 5 dagars infektion minskas andelen infekterade celler två gånger i Dectin-1-tystade A549-celler jämfört med celler som transfecteras med icke-målande förvrängning siRNA (figurerna 2A och 2B). Vi tillämpade provbaserad normalisering av siRNA riktade Dectin-1 jämfört med förvrängning för att definiera Z-poäng. Som visas i figur 2Cfick vi ett Z-poängsnitt runt -15 för siRNA-mål Dectin-1. Dectin-1 kan användas som positiv kontroll för siRNA-skärmen för att upptäcka andra nya värdfaktorer som är involverade i Mtb-kolonisering i pneumocyter som kan ha samma fenotyp som med Dectin siRNA. Användningen av ett siRNA som påverkar fenotypen som en kontroll på varje mikroplatta under skärmen möjliggör normalisering av varje platta, vilket är användbart när man vill utföra hel genomskärmsanalys. Den statistiska parametern Z' var 0,1 med kontrollbaserad normalisering på förvrängning och siRNA riktade Dectin1, vilket är ett acceptabelt värde för validering av siRNA screening data.
Screening av höginnehållsföreningar
Sammansatt effektivitet vid intracellulär bakterietillväxt utvärderas genom att en dosresponskurva (DRC) etableras och normaliseras till referenspositiva sammansatta och negativa sammansatta lösningsmedelskontroller. Representativa Demokratiska republiken Kongo för två referensföreningar, isoniazid (INH) och rifampicin (RIF), aktiva mot Mtb-tillväxt, visas i figur 3. Dessa kurvor erhålls i mänskliga primära makrofager infekterade av en GFP-uttrycker Mtb H37Rv stam, med avläsning efter 5 dagar efter infektion. DMSO och INH vid en slutlig koncentration på 1% respektive 0,1 μg/ml används ofta som negativa och positiva kontroller, vilket ger basala effektivitetsnivåer (0 och 100%) (Figur 3A). Efter den bildanalysprocess som beskrivs i figur 4Bextraheras multiparametriska data från konfokala fluorescensbilder av infekterade-mänskliga makrofager tagna av automatiserat konfokalt mikroskop. Aktiva föreningar som påverkar den intracellulära replikeringen av Mtb i värdceller ledde till en minskning av mykobakteriell belastning, vilket motsvarar GFP-signalens område i celler på bilder (figur 3B). Förhållandet mellan intracellulärt bakterieområde och total cellareal, beräknat med hjälp av bildbaserad analysprogramvara, ritas i funktion av sammansatt koncentration, vilket genererar Demokratiska republiken Kongo (figur 3B). Dessa kurvor gör det möjligt att bestämma både den koncentration som krävs för att minska bakteriebelastningen med 50 % (IC50)och den minimala koncentration som krävs för att hämma 99 % av bakteriereplikationen (MIC99) (figur 3C). Z' baserat på kontrollen DMSO 1% och kontrollen INH 0, 1 μg/ml var 0,49. Detta Z', egentligen nära 0,5, är acceptabelt för att validera denna analys.
Figur 1. Visual Screening med högt innehåll närmar sig. Schematisk representation av Mtb infektion modell system används för siRNA (A), kemiska föreningar(B) och Mtb mutanter(C) skärmar. (A) siRNA biblioteksskärm: cellerna transfected med siRNA i 3 dagar i 384-brunn plattor med omvända transfection metod. siRNA transfected celler var smittade med GFP-Mtb och inkuberades i 5 dagar vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5% CO2. Cellerna färgades sedan och bilder samlades in med hjälp av ett automatiserat konfokalt mikroskop. (B) Biblioteksskärm för föreningar: föreningarna distribuerades i 384-brunnsplattor. Cell suspension och GFP-Mtb inkuberades tillsammans i 2 timmar vid 37 °C. Infekterade celler såddes i plattorna och inkuberades i 5 dagar vid 37 °C i en atmosfär som innehöll 5% CO2. Cellerna färgades sedan och bilder samlades in med hjälp av ett automatiserat konfokalt mikroskop. (C) FluorescerandeMtb mutant bibliotek: fluorescerande Mtb mutanter såddes i 384-brunnsplattor och värdcellsupphängningen distribuerades. Inkubationstiden varierade beroende på analysen. Cellerna eller cellulära vesiklar var färgade före automatiserad bild förvärv. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Dectin-1-tystning påverkar Mtb-koloniseringen i A549-celler. (A) Representativa konfokala bilder (10X luftlins) av A549-celler transfecterade med icke-målande siRNA (förvrängning) eller med siRNA specifikt för Dectin-1 och infekterade med GFP-Mtb H37Rv (MOI5) i 5 dagar. Skalstrecket representerar 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv visualiserades i grönt och cellerna i rött. Antalet celler(A. Cell detektering) och intracellulära GFP-Mtb H37Rv belastning(A. Bakteriell område) fastställdes med hjälp av bildbaserade analys programvara. (B) Grafisk representation av andelen infekterade A549 celler i 5 replikat (w1 till w5) av Scramble siRNA (blå cirklar) och Dectin-1 siRNA (röda cirklar). (C) Grafisk representation av Z-poäng genomsnitt av Scramble siRNA och Dectin-1 siRNA. (*** p-värde < 0,0001). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Dosresponskurva för aktiva referensföreningar mot Mtb i humana makrofager. (A och B) Representativa konfokala bilder (20X vattenlins) av mänskliga makrofager (röda, cell märkta med rött fluorescerande färgämne) infekterade med GFP-Mtb H37Rv (grön) med en MOI1 i 5 dagar. Skalstången representerar 50 μm. (A) Bilder av infekterade celler inkuberade med DMSO 1% används som negativ kontroll i analysen. (B) Bilder av infekterade celler inkuberade med ökande koncentration av två referensföreningar isonazid (INH) och rifampicin (RIF). C)Dosresponskurvor (Drc) för INH och RIF. Bildbaserad analys möjliggår bestämning av Demokratiska republiken Kongo för varje sammansatt förening som testats. Demokratiska republiken Kongo representerar förhållandet mellan intracellulärt GFP-bakterieområde och total cellareal (Y-axel), i funktion av den sammansatta koncentrationen (loggskala, x-axel). I varje diagram normaliserades demokratiska republiken Kongo av förening till den negativa kontrollen DMSO 1% (0% hämning) och den positiva kontroll INH vid en koncentration av 0,1 μg/ml (100% hämning). För varje förening beräknades den koncentration som krävs för att hämma 50% av bakteriekoloniseringen (IC50)och den minimala hämmande koncentrationen (MIC99)från Demokratiska republiken Kongo. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Standard bild-baserade analys för att bestämma fluorescerande intracellulära mycobacteria. Bilder från 384-brunnsplattor förvärvades med hjälp av ett automatiserat konfokalt mikroskop. I det här fallet spelades 4 olika bilder av samma brunn (fält) in. Varje fält analyserades sedan med hjälp av bildbaserade analysprogramvaran Acapella 2.6 (Perkin Elmer). A) Varje fält innehöll två kanaler (två färger), en för bakterierna (grön) och en för cellkärnorna (blå kanal), som segmenterades med hjälp av följande algoritm: i)nukleidetektering med hjälp av ett inbyggt Acapella-förfarande. ii) cytoplasmdetektering, baserad på kärnans population, med hjälp av ett inbyggt Acapella-förfarande, iii)bakteriedetektering genom att endast hålla pixlar som är högre än ett manuellt definierat tröskelvärde, iv) sammanslagning av cellers position med bakterieposition för att identifiera infekterade celler. Slutliga resultat, uttryckta som ett genomsnitt av de fyra fälten, är det totala bakterieområdet, det totala antalet celler, andelen infekterade celler och bakterieområdet per cell (genomsnitt av alla infekterade celler). B) Varje fält innehöll två kanaler, en för bakterierna (grön kanal) och en för cellkärnorna och cytoplasman (den långröda kanalen), som segmenterades med hjälp av följande algoritm: i) filtrering av den ursprungliga kanalen med hjälp av ett anti-medianfilter, ii) hålla endast pixlar som är högre än ett manuellt definierat tröskelvärde (varje kanal har sitt eget tröskelvärde), iii) räkna det återstående antalet pixlar för varje kanal, iv) slå samman kanaler och räkna antalet pixlar som delas av både bakterier och atomkärnor för att kvantifiera intracellulära bakterier. Slutliga resultat, uttryckta som ett genomsnitt av de fyra fälten, är det totala bakterieområdet, den totala cellulära arealen, den totala arealen intracellulära bakterier och förhållandet mellan intracellulär bakteriell yta och total yta av celler. Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här de metoder som krävs för en fenotypisk analys med hjälp av en GFP-uttrycker Mtb H37Rv stam att infektera fluorescerande märkta värdceller, vilket gör det lämpligt för hög innehåll / hög genomströmning skärmar. Detta protokoll kan tillämpas på ett brett spektrum av föreningar, fluorescerande sonder och Mtb mutanter. För varje protokoll som beskrivs ovan kan fixerings- och immunolabelingsteg utföras före bildförvärv. Vi använder ett automatiserat fluorescerande konfokalt mikroskop utrustat med en 20X (NA 0,70) eller 60X (NA 1.2) vattenlins för att få bilder. Det konfokala mikroskopet är utrustat med 405, 488, 561 och 640 nm excitationslasrar. Den avgivna fluorescensen fångas med hjälp av 3 kameror associerade med en uppsättning filter som täcker en detekteringsvåglängd från 450-690 nm. Det är viktigt att notera att justeringen av mikroskopexcitations- och utsläppsinställningarna beror på vilken typ av färgämnen eller fluorokromer som används i varje experiment. För fenotypiska analyser används DAPI eller Hoechst ofta vid 5 μg/ml i 10 minuter för att färga kärnor. Men celler kan också färgas med olika fluorescerande färgämnen som är specifika för detektion av cytoplasma, membran eller cytoskeleton. Efter bildförvärv bör bilder analyseras med hjälp av en bildbaserad analysprogramvara. Cellsegmenteringsalgoritmer baserade på intensiteten hos varje pixel bör användas för att fastställa antalet celler eller det intracellulära bakterieområdet (se figur 4). De genererade uppgifterna bör vägas mot ett statistiskt baserat godkännandekriterier för att validera analysens robusthet och noggrannhet.
Storskaliga höggenomströmningsskärmar är tidskrävande experiment. Därför är det av största vikt att i förväg bedöma analysens lämplighet. De data som samlats in från fenotypiska skärmar visualiserades med hjälp av kalkylbladsprogram som Excel och normaliserades i allmänhet per platta. De vanligaste kvalitetsmåtten som används för både siRNA- och småmolekylskärmar är Z. Z definieras med medelvärdes- och standardavvikelse för både positiva och negativa kontroller9. Z kvantifierar om analyssvaret är tillräckligt stort för att validera dess tillämpning för en fullskalig urvalsskärm. Z:s räckvidd är negativ oändlighet till 1, med >0,5 som en mycket bra analys, >0 en acceptabel analys och <0 en oacceptabel analys. Jämfört med de småmolekylskärmar för vilka kontrollernas styrka möjliggör validering av analysen med Z > 0,5, påverkar variabiliteten hos siRNA-skärmar Z som tenderar att vara lägre (ofta mellan 0,0-0,5)10. Faktum är att framgången för siRNA-skärmar beror på optimeringen av i) effektiviteten av siRNA-leverans i cellerna, ii) cytotoxiciteten som induceras av transfekten och iii) analysvillkoret för effektiviteten av gensilencing. SiRNA kan lätt transfecteras i olika cellinjer, såsom HeLa, efter tillverkarens transfection protokoll, men effektiv siRNA transfection i vissa cellinjer inklusive makrofager fortfarande en utmaning. Viral vektormedierade uttryck för korta hårnål RNAs (shRNA) kan dock representera ett bra alternativ11. För att undkomma svårigheten att tolka normaliseras data som samlas in från siRNA-skärmar ofta i förhållande till den normala standardfördelningen för att definiera Z-poängen (även kallad Z-värde) för varjepunkt 10,12. Sedan rangordnades träffprover enligt Z-poängen som vanligtvis tillhör mindre än -2 eller mer än +2. Slutligen testades valda träffar på den primära skärmen på en sekundär skärm inklusive fler replikat för att bekräfta fenotypen som observerats på den primära skärmen.
Vårt protokoll kan enkelt tillämpas för småskaliga skärmar med utrustning. För att uppnå detta behövs analysminiaturering i mikrotitrikrikplattorna och manipulering av bibliotek av molekyler för att optimera processen för bevarande, dispensering och blandning13. Dessutom rekommenderas att använda en automatiserad robotplattform, inklusive dispensrar, för att noggrant och reproducerbart kontrollera analysförhållandena i mikrotitrikorna. Den enorma mängd data som produceras genom screening med hög genomströmning (HTS) bör också hanteras av databasen och en anpassad pipeline för bildanalys av den konfokala bilden, datalagring och överföring. De analyser som presenteras i denna rapport utfördes i biosäkerhetsnivå 3-anläggningen (BSL3). Den strikta efterlevnaden av säkerheten i BSL3 ökar skärmerna. Det måste faktiskt finnas många utrustningar som krävs för skärmarna i BSL3 och isoleras för att skydda arbetstagaren och miljön från kontaminering. Installationen av den anpassade rörledningen i BSL3 krävde därför mycket utrymme. Av denna anledning utvecklades vårt protokoll för att få ett maximalt antal steg utförda BSL3 som siRNA-transfekt och sammansatt överföring till plattorna. Cell infektion genom bild förvärv steg utfördes i BSL3 villkor. Bilderna överfördes sedan på en dedikerad server och analyserades ut ur BSL3.
Den fenotypiska analysen som beskrivs här baserades på två metoder för bildanalys (figur 4). Den första metoden, som används för siRNA-screening, utformades för att ge antalet infekterade celler. Denna parameter konstaterades effektivt jämföra effekten av gensilencing på Mtb intracellulär replikering. Vid screening av föreningar var dock en mer grundläggande avläsning baserad på den totala cellarealen tillräcklig för att tydligt identifiera aktiva föreningar. Eftersom denna andra metod är snabbare och lättare att implementera föredrogs den för analys av bilder som härrör från sammansatt screening. För att gå vidare kan mer fluorescerande färgämnen och/eller märkningssonder läggas till och bildanalysskript kan optimeras för att generera multiparametriska data som colocalization, nuclei och cellmorfologi, celldöd, bakteriell aggregering samt intracellulär handel med bakterierna. Det är viktigt att notera att för intracellulära trafficking- eller colocalization-analyser är det viktigt att få Z-staplar för att tillämpa en kumulativ bedömning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd till detta arbete tillhandahölls av Europeiska gemenskapen (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) och Regionen Nord Pas de Calais. Vi erkänner tacksamt den tekniska hjälpen från Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni och Frank Lafont från plattformen BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
