Summary
该协议探索的最新进展进行免疫印迹分析。这些新颖的改进采用的Bis-Tris凝胶系统用35分钟电泳运行时，一个7分钟的干印迹转移系统和红外荧光蛋白的检测和成像，其产生更高的分辨率，质量，灵敏度和西数据的改进的准确度。
Abstract
还在积极利用当今最初成立于20世纪70年代末，西方印迹技术。然而，这种传统的Western印迹的方法有几个缺点，其中包括低质量的分辨率，杂散乐队，敏感性下降，而可怜的蛋白质的完整性。最新进展已经大大提高了标准的Western blot检测协议的许多方面产生较高的定性和定量数据。本的Bis-Tris凝胶系统，可以替代传统的Laemmli系统，产生更好的蛋白质分离和分辨率，保持蛋白完整性，并降低电泳至35分钟的运行时间。此外，IBLOT干印迹系统，极大地提高了蛋白质转移到在7分钟，这是在对比的是，往往更低效的冗长的传输时间传统的蛋白转移方法在膜的功效和速度。在这些高度创新的修改，蛋白d组合etection使用红外荧光成像效果更高质量，更准确，相比化学发光标准Western印迹法一致的数据。这种技术可以同时检测在相同的膜上两种不同的抗原通过利用被可视化在不同的荧光通道双色近红外染料。此外，荧光成像的线性度和宽动态范围允许为强，弱蛋白条带的精确定量。因此，该协议描述了重要的改进，以经典的Western印迹方法，其中这些改进显著提高数据的质量，同时大大降低了该实验中的性能时间。
Introduction
为了使用抗体检测1-3蛋白质创造一个更好的方法，1977年和1979年间首次开发蛋白质印迹分析技术。此程序利用蛋白质与用第二抗体可视化，并通过放射自显影，UV光或过氧化物酶反应产物3检测目标蛋白电泳转移到膜上从SDS-PAGE凝胶。因此，这些相同的基本原则仍然被广泛使用在今天的Western blot检测协议。然而，这种经典的免疫印迹技术确实存在许多缺点，如缓慢电泳运行时间，低分辨率和人工蛋白条带，易患蛋白质降解，和有限的灵敏度，以及糟糕的数据质量4。因此，该协议描述了标准的Western blot检测程序，会产生更准确的定性和定量数据显著的进步和改善。
“>本的Laemmli系统，用于分离各种使用SDS-PAGE的蛋白质是蛋白质印迹5最广泛使用的凝胶体系。尽管如此Western印迹系统的普及，这种方法可能会导致带内失真，分辨率的损失，并杂散带4，这可能是由于在分离胶，减少二硫键由于凝胶的不同的氧化还原状态，并且天冬氨酰-脯氨酰裂解再氧化的高pH（9.5）的蛋白质的脱氨基和烷基化反应的结果肽键是由于加热该蛋白质在Laemmli缓冲液（pH为5.2）4,6的的Bis-Tris凝胶系统，该系统工作在中性pH值（7.0），在Lamemmli系统提供了显著益处，该系统提高了蛋白质的稳定性，最小化蛋白质修饰，蛋白质保持其减少的状态，可以防止在电泳过程天冬氨酰-脯氨酰裂解，并且更重要的是，电泳运行时间是35分钟，4,6,7，另外，吨他的Bis-Tris凝胶体系也产生更清晰的条带，更高的分辨率和分离，提高了灵敏度产生更可靠的数据4。同的Bis-Tris凝胶体系相结合，IBLOT干印迹系统采用高场强和电流从凝胶显著降低蛋白质的传输时间内到7分钟8膜。这个传输系统是基于其生成更有效和可靠的蛋白8的转印干印迹法。对于IBLOT传输系统的功效，以传统的传输系统的详细比较请参考以下网站： http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html .它利用阳极和阴极的堆叠，这是由一个包含适当的传输缓冲器，即作为离子储层8的凝胶基质。在转移过程中，电解水有助于防止氧的产生从铜阳极产生，而不会导致带内失真8更一致的蛋白转移。此外，该传输系统还通过减少电极8之间的距离增加了传输速度。
虽然化学发光是最常见，最传统的方法进行蛋白质检测印迹分析，双色红外荧光检测大大提高了灵敏度，质量和Western blot检测数据的准确性。这种检测方法有两种最佳波长，700 nm处采用红外激光激发和800纳米，以生成具有最大信号-噪声比和灵敏度最高9清晰的图像数据。因此，两个靶蛋白可以同时使用700 nm和800 nm的荧光检测信道的相同的膜显影。更重要的是，红外荧光的线性度和动态范围允许为强，弱蛋白条带9的精确定量分析。此外，该协议提供了巨大的优点和改进对经典的Western印迹技术通过降低该实验的电泳和转移时间而不影响这些过程的有效性和使用红外荧光蛋白的检测，以产生更大的定性和定量蛋白质印迹数据。
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Protocol
1。从细胞培养全细胞裂解液的制备
- 将细胞培养皿置于冰上，加入冷PBS与5毫米EDTA（ 如 PBS 5毫升5毫米EDTA/10厘米2板）。从使用细胞刮烹调除去粘附的细胞，然后将细胞悬浮液转移到冷的15毫升锥形管中。
- 在4℃下沉淀的细胞悬浮液通过低速离心以1000rpm（230×g离心）5分钟放置锥形管在冰上，小心地吸出上清液，而不破坏颗粒。
- 用1毫升的PBS中含有5mM EDTA洗涤沉淀和细胞悬浮液转移到一个冷1.5毫升离心管中。在13,000 rpm（13,226×g离心）快速自旋悬浮液，持续10秒，以沉淀细胞。小心取出上清液，而不破坏冰的颗粒和地方管。
- 重悬在25-200微升的粒料（根据颗粒大小， 即对于3×10 6个细胞加〜150微升的RIPA缓冲液）中RIPA缓冲液（50mM的Tris，150mM的氯化钠，0.5mM的EDTA，10mM的氟化钠，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，1％NP-40），其中包含新加入的蛋白酶和磷酸酶抑制剂在2倍终浓度。短暂涡旋振荡每个试管中孵育悬挂在冰上20-30分钟。注意：有几种裂解缓冲液，可用于提取的蛋白，其以溶解的蛋白质和它们的变性剂（ 如 SDS，曲拉通X-100，或NP-40）的强度的能力上不同。 RIPA缓冲液是用于制备全细胞裂解液和破坏蛋白质 - 蛋白质相互作用是有用的。
- 要在14,000 rpm（15,339 XG）5分钟，在4°C。创建一个岗位核分数，离心裂解液将上清转移到一个新的管而不破坏冰核富集的颗粒和地方管。注：核富集的颗粒也可能从管分离而提取的上清液。为了避免收集核富集的颗粒，直接将枪头我NTO粘性核富集的颗粒，并绘制了吸管，以便处置。
- 根据使用这样的蛋白质定量测定作为BCA或布拉德福德制造商的说明确定各样品的蛋白质浓度。
2。样品制备和电泳
- 按照以下所列出的图表制备每个样品。作为替代方案，β-巯基乙醇，也可用于以2.5％的终浓度。然而，还原剂应该被加载在凝胶之前加入到每个样品一小时。总量占移液变化，只有20微升每个制备的样品，每装好。
试剂 减少的样本 蛋白质样本 X微升 4×LDS样品缓冲液 6微升 500纳米红色的DTTucing代理 2.4微升 去离子水 高达15.6微升 总成交量 24微升 - 热样品，在70℃10分钟。当样品加热，准备千毫升1X MES或MOPS电泳缓冲液（50毫升20倍的MES或MOPS电泳缓冲液加950毫升去离子水）。 MOPS运行缓冲可解决中型蛋白14-200 kDa的之间，而MES电泳缓冲液可解决2-200 kDa的之间的较小分子量的蛋白质具有较低的pKa值，其允许在MES电泳缓冲液至运行速度比MOPS 4更快。因此，这两个缓冲区都对比上，导致在蛋白质条带4的分离差异浓缩胶中离子的迁移作用。预留并结合200毫升1X的MES或MOPS用500μl抗氧化的电泳缓冲液，将用于填补上缓冲液槽中最小的I-细胞电泳装置。
- 一旦样品被加热完毕，快速旋转的样本置于冰上将之前。
- 对于预制Bis-Tris凝胶放入微型电池单元，用于电泳的装配遵循制造商的说明进行操作。注意：确保每个凝胶被以这样的方式取向，每个凝胶的短（小）盒向内朝向缓冲区核心和凝胶是水平和对缓冲区核心紧紧地压，以避免从上缓冲液槽泄漏。
- 补上缓冲液槽与200毫升的1X的MES或MOPS电泳缓冲液含有抗氧化剂和下缓冲液槽与大约600毫升的1X的MES或MOPS电泳缓冲液的微型电池单元组成。额外的200-300毫升运行缓冲液可以保存供以后使用。然而，这是不推荐来回收电泳运行过程中用作缓冲液的pH和质量可以被改变的缓冲区。
- 加载20微升每种蛋白质的SAMP勒到每个孔中。如果切片膜成各种条状，以探测多种抗体（ 即超过2），强烈建议加载2-5μl，以每个凝胶的第一个和最后一个孔的预染蛋白质标准，因为这将作为切割导板，用于分离的膜的不同部分，而不会影响该蛋白质条带的成像。
- 运行凝胶在200V恒定35分钟以110-125毫安/凝胶在开始和每个凝胶70-80毫安在年底预期的电流。电泳完成时，跟踪染料迁移到铂丝沿缓冲区核心。
3。蛋白质转移使用IBLOT干印迹系统
- 通过破坏盒的侧粘接完全分离的微型凝胶（这可能产生一个噼啪噪声）。弃短（小）板，小心地从较长（开槽）盘转移到凝胶用去离子水容器中，除去位于底部凝胶的厚足部分。注意：在极少数情况下，凝胶可以连接到短板，而不是时间越长，开槽板。在这种情况下，丢弃该时间越长，开槽板和除去位于底部凝胶的厚右脚部。然后，小心地从短板转移凝胶去离子水。
- 根据制造商的说明装配在阳极和阴极传输栈。注意：这两种硝化纤维素或PVDF膜上的蛋白质提供高质量和高效率的传输，并与荧光检测8兼容。然而，聚偏氟乙烯膜确实具有较高的结合容量（240微克/厘米3）除硝化纤维8（200微克/厘米3）。
- 小心地取出任何气泡或空气凝胶和膜，因为这之间的残留将防止在传输过程中的蛋白条带任何失真。注意：不要修剪膜或被传呃栈以满足您的凝胶大小，因为这将导致阳极和阴极栈之间的直接接触。
- 在正确组装印迹干燥设备上的传输协议栈，选择适当的电压计划（ 即方案三：20 V为7分钟），并开始传输。注：蛋白质大于150 kDa的趋向迁移速度比较慢，可能需要8-10分钟更长的传输时间。另外，在20％乙醇中5-10分钟的凝胶温育之前也将有助于提高这些大蛋白的转印效率。一旦传输程序完成后，设备会自动切断电流。最好是立即取出膜并继续阻止程序，以确保更好的蛋白质检测，避免晒出膜。
4。红外荧光蛋白检测
- 块膜中最小的Odyssey封闭缓冲液（不加吐温20），1小时0.8毫升/厘米2（S）过夜，在4°C。膜（次），也可阻止与脱脂奶粉，然而，这可能会导致较高的背景和干扰蛋白质的检测。
- 在漫游所需的浓度阻断缓冲液含0.1％Tween-20中过夜，在4℃下在初级抗体孵育膜（次）对于双色检测，其中两个不同的抗原上可视化的相同印迹，两个初级抗体必须来自不同宿主物种和同时加入到所述膜（次）。注意：孵育所述膜（次）初级抗体之前，将膜（s）可以被划分成不同部分，以探测多种抗体（ 即大于2）在相同的膜。
- 对于在TBS 10分钟加0.1％Tween-20中轻轻摇动洗膜（次）3倍。
- 孵育膜（次）与荧光标记的二抗的稀释度1:20,000用于在Odysse的800纳米通道中的700nm的信道和1:6,000-1:10,000Ý阻断缓冲液含0.1％Tween-20的30〜60分钟（时间超过1小时温育膜（次）可能会增加背景）。从光保护膜（S）。注意：二次抗体需要从同一宿主物种衍生的，因为每个初级抗体和标记有不同的荧光团。
- 对于在TBS 10分钟加0.1％Tween-20中轻轻摇动洗膜（次）3倍。从光保护膜（S）。
- 膜（次）可被干燥或存储在任何TBS或PBS无Tween-20中，在4℃，直至扫描和成像用红外成像系统。荧光信号将保持稳定数月，如果适当的保护从光。
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Representative Results
双色红外荧光在相同的膜具有增强的灵敏度和最高的信号噪声比，以产生清晰的印迹图像检测强和弱带。通过双色Western印迹检测显现在两个700 nm和800 nm的荧光通道产生的典型的结果列举在图1和图2。在图1中最上面的Western印迹显示了并行（覆盖）检测总的ERK1 / 2在800纳米通道中的裂解物中的来自人2倍连续稀释的700纳米通道（红色）（绿色）和β-肌动蛋白的衍生的黑素瘤细胞系，WM793。此外，这种膜也被切成根据所期望的蛋白质靶的分子量，以便允许两个以上的抗体被检查在同一印迹部分。例如，在图1中所分析的膜切成两半，以探测下部端口不与两个总的ERK1 / 2和β-肌动蛋白的检测推断与第三抗体，总的BIM（700纳米通道 - 红）膜的离子。 图2中的第一板进一步表明了两种颜色的Western印迹荧光检测磷酸化的ERK1 / 2的（800纳米通道-绿）和总的ERK1 / 2（700纳米通道-红色）与重叠的磷酸-ERK和总ERK信号以黄色显示中的MEK1 / 2抑制剂，PD0325901（MEKi），抑制ERK1 / 2的MAP激酶信号转导通路的存在和不存在处理WM793黑素瘤细胞。此外，700 nm和800 nm的荧光图像也可以被转换到标准黑白Western印迹图像的每个抗体（ 图1和2）。在一般情况下，大多数通过此协议产生的Western印迹图像，将导致高质量的图像作为显示出在图1和图2。然而，根据不同的选择性，特异性与第一抗体的质量，达不到最佳的图像可以导致印迹通过这种方法分析的一小部分。例如，如在图2的底部两个面板观察到的，磷酸化的BIM抗体在具有和不具有MEK抑制治疗的WM793黑素瘤细胞的质量欠佳导致具有微弱的蛋白条带和极高膜背景Western印迹图像。
两个目标同时进行红外荧光成像也可以通过相同的膜高效，准确地检测强和弱乐队提供机会，Western印迹定量分析多面广，线性动态范围。蛋白质条带进行定量计算为一个集成的强度，它正比于在膜的荧光标记的抗体的量，并且是独立绕带和分辨率绘制的形状的两个尺寸。这是基于以下标准：1）是一个形状，2）数封闭在形状象素;选择为背景的像素的3）的平均强度和;括在给定的形状10的像素的4）总强度图3A示出的蛋白质的定量在图1的Western印迹所示。定量总的ERK1 / 2，β-肌动蛋白和总BIM表现出增加的荧光信号的积分强度和增加的蛋白浓度（ 图3A）之间的线性关系的。此外， 图3B是如何从荧光蛋白质印迹，显示磷酸化的ERK1 / 2的蛋白质量化归一化到具有和不具有由图2的MEK抑制治疗WM793黑素瘤细胞总的ERK1 / 2蛋白水平定量蛋白水平的另一个例子。从这个量化中，磷酸化的ERK1 / 2水平可以计算为对照水平的百分比。在这个长约本身，用MEK抑制剂处理的黑素瘤细胞中的磷酸-ERK水平分别为对照的0.6％。
图1采用双色红外荧光蛋白检测的WM793源于人黑色素瘤蛋白的2倍连续稀释。细胞裂解液免疫印迹分析，使用的NuPAGE NOVEX的Bis-Tris凝胶与蛋白质转移到PVDF膜使用IBLOT传送装置分离。膜阻挡在Odyssey封闭缓冲液并用探针下面的一抗：兔抗总ERK1 / 2，兔抗总BIM和小鼠抗β-肌动蛋白。使用荧光的山羊抗兔的IRDye 800（绿色）或680（红）和山羊抗小鼠的IRDye 680（红色）的第二抗体分别检测抗原 - 抗体复合物，和可视化与LI-COR的奥德赛经典红外成像系统。第一印迹面板的同时检测总ERK1 / 2（800 nm的通道绿色）和β-肌动蛋白（700纳米通道红色）荧光信号的覆盖。第二面板是单声道的荧光检测在被使用基于这些靶蛋白的分子量刀片分离的相同的膜的总的BIM的。较低的三个Western印迹板是分离的单通道荧光图像的黑白图像。
图2的例子都包含一个高和质量差的印迹与任何DMSO（CTL）或2 MEK抑制剂的微米，PD0325处理WM793黑素瘤细胞图像使用红外荧光。 901（MEKi），18小时如在图1中描述的进行分析。将膜用探针兔抗磷酸化ERK1 / 2（Thr202/Tyr204），小鼠抗总ERK1 / 2，和小鼠抗 - 磷酸-BIM（Ser69）与山羊抗兔的IRDye 800检测到抗原 - 抗体复合（绿色）和羊抗鼠的IRDye 680（红色）。第一印迹面板的同时检测二者磷酸化ERK1 / 2（800纳米通道 - 绿）和总的ERK1 / 2（700纳米通道的红色）的荧光信号的叠加。在第二和第三板是磷酸化和总ERK1 / 2的单声道的荧光图像的黑白图像。底部两个面板是磷酸化的BIM的荧光和黑白图像。这些图像表示欠佳的Western印迹，可导致用此方法，由于初级抗体的质量不合格的例子。
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图3的红外荧光蛋白质印迹A）定量总的ERK1 / 2，β-肌动蛋白和总BIM蛋白水平的蛋白质定量，例如可以通过计算各蛋白条带的积分强度确定。集成的强度正比于在膜的荧光标记的第二抗体的量。磷酸化的ERK1 / 2归一化，以总的ERK1 / 2蛋白表达水平由图2的R-平方值也被用于评价各抗体在图1中所分析的线性回归B）的定量，使用的积分强度计算荧光信号和数据被呈现为DMSO对照的百分比。
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Discussion
在根据本协议产生高质量，定量Western印迹的关键步骤如下：1）测定蛋白质浓度，2）样品的制备; 3）阻挡膜和4）的初级抗体的质量和口径。
测定总蛋白浓度的精度可对定量蛋白质条带，因为红外荧光检测的灵敏度呈将扩增的样品的蛋白浓度发现任何轻微的差异产生了重大影响。为了避免在确定蛋白质浓度，生成的标准曲线与线性回归线或R平方值越接近1越好（R 2≥0.99或更好）是重要的，每个样品的蛋白质浓度的精确计算差异。例如，如果R 2值低于0.99，准备新鲜的BSA标准品，用超纯水，并仔细重复蛋白质的定量测定可以有助于增加对R 2的值。这也是最好避免使用多道移液器，因为这会产生不一致的移液可能有助于缩小的R 2值和不准确的样品的蛋白浓度。
样品制备起着决定的蛋白条带的质量显著作用，这也可能对这些频段的量化的直接影响。当使用的Bis-Tris凝胶体系，它强烈建议样品制备LDS样品缓冲液，因为这个缓冲区的微碱性pH值（8.5）提供了二硫键和变性4还原的最佳条件。此样品缓冲液中还含有能产生一个尖锐的染料前，与移动离子前面，这有助于确保小肽不跑出凝胶4迁移考马斯G250跟踪染料。更重要的是，LDS样品缓冲器最小化的天冬氨酰-脯氨酰基的肽键的裂解，当样品在70℃下加热，由于该缓冲器从8.5-8.0 4改变的pH值。这将导致在一个理想的环境为蛋白质的还原和烷基化，同时还保留了蛋白质的完整性。然而，如果一个Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液来代替该LDS样品缓冲液中，这将导致天冬氨酰-脯氨酰基键的裂解，在蛋白质条带的清晰度的降低，并且增加蛋白质碎片4。它也适当时候，抗氧添加到上缓冲液槽的迷你细胞电泳装置。由于抗氧化剂是能够共迁移与在中性pH下在的Bis-Tris凝胶体系的样品中，这可以帮助减少状态维持蛋白质和保护二硫键以及敏感的氨基酸，防止氧化，而没有该抗氧化剂可以导致扩散的蛋白质条带4。最后，这是极建议使用任一MES或MOPS与Bis-Tris凝胶电泳缓冲液而不是使用Tris-甘氨酸SDS与这些类型的凝胶电泳缓冲液。的Tris-甘氨酸SDS的甘氨酸离子的缓慢迁移的电泳缓冲液和Bis-Tris凝胶结果导致在电泳运行时间的显着增加与带出现更多的压缩和杯状4的组合。
上述分块步骤也是用于生产高品质的Western印迹图像使用荧光检测尽可能多的各种封端剂可以产生高背景膜是至关重要的。用于红外荧光检测时，最好使用Odyssey封闭缓冲液，因为这个特定的封端剂，同时保持低背景增加蛋白质检测的灵敏度。虽然脱脂奶粉，酪蛋白，牛血清白蛋白或也可以用作替代的封闭剂，这些类型的解决方案可能会导致较高的膜背景在某些情况下在宾迪减少一抗10纳克亲和力。此外，基于乳的阻断剂可能含有的IgG可与磷酸化的表位和抗山羊抗体发生交叉反应，这可能会干扰蛋白质的检测和适当的抗体结合9,11的准确性。然而，如果一个Western印迹图像是由高的背景下，非特异性条带，或弱/无信号的困扰，然后利用这些替代阻断剂之一可能有助于提高图像的质量。此外，还建议以避免增加洗涤剂到阻塞步骤和长阻挡孵育，因为这可能导致增加的背景和/或靶蛋白从膜9,12损失。
同时检测上使用标记以700纳米和800纳米通道染料红外线抗体相同的印迹两种不同的抗原，需要慎重选择两个初级和次级抗体。两个初级抗体必须从不同何衍生吨品种。例如，如果一个初级抗体是兔衍生的，那么第二个一级抗体需要来自不同物种比兔等，如小鼠衍生的。同样地，红外线的第二抗体也需要来自于同一宿主物种为每个主要的抗体和标记有不同的荧光团。例如，山羊抗兔在800纳米通道可以与山羊抗小鼠在700nm的信道，以便准确地从被从兔和小鼠来源的两种不同的初级抗体观察蛋白信号进行组合。
第一抗体有很大的不同其品质，亲和力和其抗原的灵敏度。这可能导致一个显著减少信号或由此产生的准确的可视化靶蛋白的困难膜增加蛋白质的非特异性结合。因此，通过使用另一种阻断溶液，如脱脂牛奶或酪蛋白溶解于PBS中，可能有助于提高蛋白质的检测与质量差的主要抗体10。此外，洗涤剂浓度也可影响初级抗体与靶抗原和预防措施的结合确定洗涤剂的浓度，以避免洗去抗体时应该予以考虑。 SDS（0.01-0.02％）的低浓度可使用PVDF膜10特别是在当加入稀释的第二抗体降低背景和非特异性结合。然而，SDS也可以破坏抗原抗体结合，导致了严重的降低信号强度。
此外，在本协议中所述的新颖的修改体现了一种现代方法对传统免疫印迹技术。这些尖端的进步大大提高了疗效，一致性和西部数据的敏感性，并允许多个目标蛋白的准确定量在相同的膜不论其信号强度。更重要的是，这些宝贵的改变也显著减少进行Western blot检测，同时生产高定性和定量数据的实验时间。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们想麦克马洪实验室的所有成员感谢他们的帮助和支持。这项研究是由美国国立卫生研究院的/ NCI R01 CA176839-01（以毫米）和一个院校研究与学术职业发展奖（IRACDA到JS）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 | |
| 4x NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | |
| 10x NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 | |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 | |
| 20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX | |
| SeeBlue Plus2 Prestained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 | |
| iBlot Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 | |
| β-Actin | Sigma | A2228 | |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A | |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 | |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 | |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 | |
| Odyssey Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Odyssey Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
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