Summary
פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.
Abstract
טכניקות הכתם המערביות שהוקמו במקור בסוף 1970s עדיין מנוצלים באופן פעיל היום. עם זאת, יש שיטה מסורתית זו מערבית סופג כמה חסרונות הכוללים ברזולוציה נמוכה איכות, להקות מזויפות, ירידה ברגישות, וביושר חלבון עני. ההתקדמות שחלה באחרונה השתפרה באופן דרסטי היבטים רבים של פרוטוקול הכתם המערבי הסטנדרטי כדי לייצר מידע איכותי וכמות גבוהה יותר. מערכת ג'ל Bis-טריס, אלטרנטיבה למערכת Laemmli הקונבנציונלית, יוצרת הפרדת חלבון טובה יותר ורזולוציה, שומרת על שלמות חלבון, ומפחיתה אלקטרופורזה לזמן ריצת 35 דקות. יתר על כן, המערכת הסופג היבשה iBlot, משפרת באופן דרמטי את היעילות ומהירות של העברת חלבון על הקרום ב -7 דקות, שזה בניגוד לשיטות העברת חלבון המסורתיות, כי הם לעתים קרובות יעילים יותר עם זמני העברה ארוכים. בשילוב עם שינויים מאוד חדשניים אלה, ד החלבוןetection באמצעות תוצאות הדמיה ניאון אינפרא אדום באיכות גבוהה יותר, מדויקים יותר ונתונים עקביים בהשוואה לטכניקה המערבית סופג סטנדרטית של chemiluminescence. טכנולוגיה זו יכולה בו זמנית לזהות שני אנטיגנים שונים על אותו הקרום על ידי ניצול צבעים קרוב אינפרא אדום בשני צבעים שהם דמיינו בערוצי ניאון שונים. יתר על כן, את הליניאריות והטווח דינמי רחב של דימות פלואורסצנטי מאפשר לכימות המדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את שיפורי מפתח לשיטה הקלאסית המערבית סופג, שבו הפיתוחים האלה להגדיל באופן משמעותי את איכות הנתונים, תוך צמצום זמן ביצוע ניסוי זה באופן משמעותי.
Introduction
הטכניקה של מערבי סופג פותחה לראשונה בין 1977 ו -1979 כדי ליצור שיטה טובה יותר לאיתור חלבונים באמצעות נוגדני 1-3. הליך זה מנוצל העברת electrophoretic של חלבונים לממברנות מג'לי-SDS עם חלבוני היעד דמיינו באמצעות נוגדנים משני וזוהו על ידי autoradiography, אור UV, או מוצר תגובת peroxidase 3. לכן, אותם עקרונות בסיסיים אלה עדיין בשימוש נרחב בפרוטוקולי הכתם המערביים של היום. עם זאת, הטכניקה המערבית סופג הקלאסית הזה עושה חסרונות רבים בהווה, כגון פעמים איטיות ריצת אלקטרופורזה, ברזולוציה נמוכה ולהקות חלבון מלאכותיות, את רגישות לפירוק חלבונים, ורגישות מוגבלת, כמו גם איכות נתונים ירודה 4. לכן, פרוטוקול זה מתאר התקדמות ושיפורים משמעותיות להליך הכתם המערבי הסטנדרטי שמייצר נתונים איכותיים וכמותיים מדויקים יותר.
"> מערכת Laemmli להפרדת מגוון רחב של חלבונים באמצעות SDS-PAGE היא מערכת ג'ל הנפוצה ביותר למערבי סופג 5. למרות הפופולריות של מערכת מערבית סופג את זה, שיטה זו יכולה לגרום לעיוות להקה, אובדן של רזולוציה, ו להקות מזויפות 4. זה עשויה להיות תוצאה של deamination ואלקילציה של חלבונים בשל pH הגבוה (9.5) של ג'ל המפריד, reoxidation של אגרות חוב מופחתים דיסולפיד בשל מצב חיזור השונים של ג'ל, ומחשוף של aspartyl-prolyl איגרות חוב בשל חימום החלבון במאגר Laemmli (pH 5.2) 4,6 פפטיד. מערכת ג'ל Bis-טריס, הפועלת ב-pH ניטראלי (7.0), מספקת יתרונות משמעותיים על פני מערכת Lamemmli. מערכת זו משפרת את יציבות חלבון, ממזערת שינויי חלבון, שומר על חלבונים במדינות מופחתות שלהם, מונעים מחשוף aspartyl-prolyl במהלך אלקטרופורזה, ויותר חשוב מכך, בפעם אלקטרופורזה להפעיל היא 35 4,6,7 דקות. בנוסף, לאמערכת ג'ל הוא Bis-טריס גם מייצרת להקות חדות יותר, רזולוציה והפרדה גבוהות יותר, ורגישות מוגברת וכתוצאה מכך הנתונים אמינים יותר 4.בשיתוף עם מערכת הג'ל Bis-טריס, המערכת הסופג היבשה iBlot משתמשת בעוצמת שדה גבוהה וזרמים כדי להפחית באופן משמעותי את זמן ההעברה של חלבונים מן ג'לים על גבי קרומים תוך 7 דקות 8. מערכת העברה זו מבוססת על השיטה הסופג היבשה שיוצרת העברה יותר יעילה ואמינה של חלבונים 8. להשוואה מפורטת של היעילות של מערכת העברת iBlot למערכות העברה הקונבנציונלית עיינו באתר האינטרנט הבא: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . הוא מנצל ערימת האנודה וקתודה, אשר מורכבות ממטריצת ג'ל המכילה מאגרי ההעברה המתאימים, המשמשים כמאגרי יון 8. במהלך ההעברה, אלקטרוליזה של מים מסייעת במניעת הדור של חמצן מן האנודה הנחושת וכתוצאה מכך העברת חלבון עקבית יותר מבלי לגרום לעיוות להקת 8. יתר על כן, מערכת העברה זו גם מגדילה את מהירות העברה על ידי צמצום המרחק בין האלקטרודות 8.
למרות chemiluminescence היא הטכניקה הנפוצה והמסורתית ביותר לגילוי חלבון של כתם המערבי מנתח, גילוי ניאון אינפרא אדום בשני צבעים משפר באופן משמעותי את הרגישות, איכות ודיוק נתוני כתם המערביים. שיטת זיהוי זה משתמשת בעירור לייזר אינפרא אדום בשני אורכי גל אופטימליים, 700 ננומטרו800 ננומטר, כדי ליצור תמונת נתונים ברורה עם היחס הגדול ביותר אות לרעש והרגישות הגבוהה ביותר 9. לפיכך, ניתן דמיינו שני חלבוני היעד בו זמנית על אותו הקרום באמצעות ננומטר 700 ו800 ערוצי גילוי ניאון ננומטר. וחשוב יותר, את הליניאריות והטווח דינמי של הקרינה אינפרא אדום מאפשר ניתוח כמות מדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות 9. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק יתרונות ושיפורים עצומים על פני הטכניקה מערבית סופג הקלאסית על ידי הפחתת אלקטרופורזה וזמני העברה של ניסוי זה מבלי להתפשר על היעילות של תהליכים אלה וניצול זיהוי חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום כדי לייצר נתונים כתם גדולים יותר איכותיים וכמותית מערביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת lysates תא השלם מתרבית תאים
- מניחים מנות תרבית תאים על קרח ולהוסיף PBS הקר עם 5 מ"מ EDTA (לדוגמא 5 מיליליטר של PBS עם 5 מ"מ צלחת EDTA/10 2 סנטימטר). הסרת תאים חסיד מהצלחת באמצעות מגרד תא ולאחר מכן להעביר את ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מיליליטר קר.
- גלולה השעיות התא על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה על 1,000 סל"ד (230 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C. הנח צינורות חרוטי על קרח ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע לגלולה.
- שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של PBS עם 5 מ"מ EDTA ולהעביר את השעיה תא צינור צנטריפוגות קר 1.5 מיליליטר. השעיה מהירה ספין על 13,000 סל"ד (13,226 XG) במשך 10 שניות עד גלולה תאים. מוציא בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה צינורות ומניחים על קרח.
- Resuspend את הכדור ב25-200 μl (תלוי בגודל גלולה, כלומר עבור 3 x 10 6 תאים להוסיף ~ 150 μl של חיץ ריפה) בחיץ ריפה (50 מ"מ טריס, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 מ"מ NAF, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate נתרן, 1% NP-40) המכיל פרוטאז הוסיף טרי ומעכבי phosphatase בריכוז סופי 2x. בקצרה מערבולת צינור כל דגירה השעיה של 20-30 דקות על קרח. הערה: יש כמה מאגרי תמוגה שיכול לשמש כדי לחלץ חלבונים, אשר נבדלים ביכולתם solubilize חלבונים וחוזק של חומר ניקוי denaturing (כלומר, SDS, טריטון X-100, או NP-40). חיץ ריפה הוא שימושי להכנת lysates תא כולו ושיבוש אינטראקציות בין חלבונים.
- כדי ליצור שבריר פוסט גרעיני, lysates צנטריפוגות ב 14,000 סל"ד (15,339 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C. מעביר את supernatant לצינור חדש מבלי לשבש את צינורות גלולה ומקום מועשרים הגרעיניות על קרח. הערה: גלולה מועשרת הגרעינית יכולה גם להתנתק מהצינור בזמן חילוץ supernatant. כדי להימנע מאיסוף גלולה מועשר הגרעינית, הנח את קצה פיפטה ישירות in כדי גלולה מועשרת הגרעינית צמיגה ולצייר אותו עם פיפטה כדי להיפטר ממנו.
- לקבוע את ריכוז החלבון של כל דגימה על פי הוראות היצרן באמצעות מבחני כימות חלבון כגון BCA או ברדפורד.
2. לדוגמא הכנה ואלקטרופורזה
- הכן את כל דגימה על פי הטבלה הבאה המפורטת להלן. כחלופה, β-mercaptoethanol יכול לשמש גם בריכוז סופי של .2.5%. עם זאת, סוכן צמצום יש להוסיף לכל דגימה של עד שעה לפני טעינת ג'ל. חשבונות הנפח הכולל עבור וריאציות pipetting עם רק 20 μl של כל דגימה שהוכנה עמוסים בכל טוב.
מגיב מדגם מופחת לדוגמא חלבון X μl חיץ מדגם 4x LDS 6 μl 500 ננומטר DTT אדוםucing סוכן 2.4 μl מים Deionized עד 15.6 μl נפח כולל 24 μl - דגימות מחמם על C ° 70 10 דקות. בעוד דגימות חימום, להכין 1,000 מיליליטר של MES או מגבים 1x חיץ ריצה (50 MES מיליליטר 20x או מגבים הפעלת מאגר בתוספת 950 מיליליטר מים deionized). מגבים ריצת חיץ פותר חלבונים בגודל בינוני בין 14-200 kDa, ואילו MES הפעלת מאגר פותר חלבוני משקל מולקולריים קטנים יותר בין 2-200 kDa עם pKa נמוך יותר, המאפשר MES הפעלת מאגר לרוץ מהר יותר מהמגבים 4. לפיכך, שני מאגרים אלה מנוגדים השפעות על ההגירה של יונים בתוך הג'ל לערום שמוביל להבדלים בהפרדה של להקות חלבון 4. מניח בצד ולשלב 200 מיליליטר של MES 1x או מגבים הפעלת מאגר עם 500 μl של נוגדי חמצון, אשר ישמש למילוי העליון הצפת לשכת המינימליתיחידת אלקטרופורזה i-Cell.
- לאחר הדגימות סיימו חימום, דגימות סיבוב מהירות לפני ששם אותם על קרח.
- להרכבה של ג'לי Bis-טריס טרומי ליחידת המיני הנייד אלקטרופורזה לעקוב אחר ההוראות של היצרן. הערה: ודא שכל ג'ל מכוון בצורה כזאת שהקלטת קצרה יותר (קטנה יותר) של כל ג'ל פונה פנימה לכיוון ליבת הצפת וג'לים הם ברמה ולחץ בחוזקה נגד Core המאגר כדי למנוע דליפה מהמאגר העליונה הקאמרי.
- מלא עליון הצפת קאמרית עם 200 מיליליטר של MES או מגבים הפעלת מאגר המכיל נוגדי חמצון והתחתון הצפת לשכת יחידת המיני הנייד עם כ 600 מיליליטר של MES או מגבים הפעלת מאגר 1x 1x. 200-300 מיליליטר הנוסף של הפעלת מאגר ניתן לשמור לשימוש מאוחר יותר. עם זאת, היא אינה מומלצת למחזר החיץ בשימוש בזמן ריצת אלקטרופורזה כpH והאיכות של המאגר עלול להיות שונה.
- טען 20 μl של כל SAMP חלבוןle לכל אחד. אם חתך את הקרום לרצועות שונות על מנת לחקור לנוגדנים מרובים (כלומר יותר מ -2), מומלץ מאוד לטעון 2-5 μl של תקן חלבון prestained בבארות הראשונות והאחרונה של כל ג'ל שזה ישמש חיתוך מדריכים להפרדת החלקים השונים של הקרום מבלי להשפיע על ההדמיה של להקות החלבון.
- ג'לים לרוץ ב200 V קבוע לדקות 35 עם נוכחית צפוי של 110-125 mA / ג'ל בתחילת ו70-80 mA לג'ל בסוף. אלקטרופורזה תושלם כאשר צבע המעקב נודד לחוט הפלטינה לאורך Core הצפת.
3. העברת חלבונים באמצעות מערכת סופג iBlot יבש
- נפרד לחלוטין מיני ג'לים על ידי שבירת הצדדים ערובה של הקלטת (עשוי לייצר רעש פצפוצים). מחק את הצלחת קצרה יותר (קטנה יותר) ולהעביר בזהירות את הג'ל מהצלחת ארוכה יותר (מחוררת) לתוך מיכל עם מים deionized ולהסיר את החלק עבה רגל של הג'ל הממוקם בתחתית. הערה: במקרים נדירים, ג'ל עשוי לצרף לצלחת קצרה יותר במקום זמן רב יותר, מחוררת צלחת. במקרה זה, לבטל את הצלחת ארוכה יותר, מחוררת ולהסיר את החלק עבה רגל של הג'ל הממוקם בתחתית. ואז, בזהירות להעביר את הג'ל מהצלחת הקצרה למים deionized.
- להרכיב את ערימות העברת האנודה וקתודה בהתאם להוראות היצרן. הערה: קרומי שני ניטרוצלולוזה או PVDF לספק העברה באיכות גבוהה ויעילה של חלבונים והם תואמים עם זיהוי ניאון 8. עם זאת, קרום PVDF אכן יש קיבולת גבוהה יותר מחייבת (240 מיקרוגרם / 3 סנטימטר) מאשר ניטרוצלולוזה (200 מיקרוגרם / סנטימטר 3) 8.
- מוציא בזהירות את כל בועות אוויר שנלכד בין או ג'ל והקרום זה ימנעו כל עיוות של להקות החלבון במהלך ההעברה. שים לב: לא לקצץ את הקרום או transfאה מחסנית כדי שיתאים לגודל ג'ל שלך כמו זה יגרום למגע ישיר בין ערימות האנודה וקתודה.
- לאחר הרכבת כראוי ערימות ההעברה במכשיר הסופג היבש, בחר את התכנית המתאימה מתח (כלומר תכנית 3: 20 V עבור 7 דקות) ותתחיל את ההעברה. הערה: חלבונים גדולים מ 150 kDa נוטים להגר יותר לאט ועשויים לדרוש זמן העברה ארוך יותר של 8-10 דקות. בנוסף, דגירה מוקדמת של ג'ל באתנול 20% עבור 5-10 דק גם תעזור לשפר את יעילות ההעברה של חלבונים הגדולים אלה. לאחר תכנית ההעברה הושלמה, המכשיר יכבה באופן אוטומטי הנוכחי. עדיף להסיר באופן מיידי את הקרום ולהמשיך בהליך החסימה כדי להבטיח זיהוי חלבון טוב יותר ולהימנע מהתייבשות הקרום.
4. איתור חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום
- קרום בלוק (ים) במינימום של 0.8 מיליליטר / 2 סנטימטר של אודיסיאה חיץ חסימה (אלתוסיף 20-Tween) במשך שעה או 1הלילה בשעה 4 ° C. קרום (ים) גם יכול להיחסם עם חלב יבש ללא שומן, אולם זה עלול לגרום רקע גבוה יותר ולהפריע לגילוי חלבון.
- דגירה קרום (ים) בנוגדן ראשוני בריכוז הרצוי באודיסיאה חסימת הצפת עם Tween-20 0.1% הלילה בשעה 4 ° C. לזיהוי בשני צבעים, שבו שני אנטיגנים שונים הם דמיינו באותו הכתם, שני הנוגדנים עיקריים חייבים להיות נגזרים ממינים מארח שונים והוסיפו בו זמנית על הקרום (ים). הערה: לפני דוגרים הקרום (ים) בנוגדן ראשוני, הקרום (ים) יכול להיות מחולק לחתיכות שונות על מנת לחקור לנוגדנים מרובים (כלומר יותר מ -2) על אותו הקרום.
- לשטוף 3x קרום (ים) עבור 10 דקות בכפות תוספת Tween-20 0.1% עם רעד עדין.
- דגירה קרום (ים) עם הנוגדנים משני שכותרתו fluorescently בדילול של 1:20,000 עבור הערוץ 700 ננומטר ו1:6,000-1:10,000 לערוץ 800 ננומטר בOdyssey חסימת הצפת עם Tween-20 0.1% עבור 30-60 דקות (דוגרים קרום (ים) במשך שעה ארוכה יותר מ1 עשוי להגדיל ברקע). הגן על קרום (ים) מהאור. הערה: הנוגדנים משני צריכים להיות נגזרים מאותו המין המארח כמו כל אחד מהנוגדנים הראשוניים ומסומן עם fluorophores שונה.
- לשטוף 3x קרום (ים) עבור 10 דקות בכפות תוספת Tween-20 0.1% עם רעד עדין. הגן על קרום (ים) מהאור.
- קרום (ים) עשוי להיות מיובש או מאוחסן בשתי כפות או PBS ללא Tween-20 על 4 מעלות צלזיוס עד סרקו וצלם עם מערכת הדמיה אינפרא אדום. אות ניאון תישאר יציבה במשך כמה חודשים אם מוגנת כראוי מפני האור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקרינה אינפרא אדום בשני צבעים מזהה להקות גם חזקות וגם חלשות באותו קרום עם רגישות משופרת ויחס אות לרעש הגבוה ביותר כדי להפיק תמונות כתם מערביות ברורות. תוצאות אופייניות שנוצרו על ידי זיהוי כתם המערבי שני צבעים דמיינו בשני ננומטר 700 ו800 ערוצי ניאון ננומטר מודגמות באיורים 1 ו -2. הכתם המערבי העליון באיור 1 מציג את זיהוי המקביל (שכבה) של ERK1 סך הכל / 2 בערוץ 800 ננומטר (הירוק) ו β-אקטין בערוץ 700 ננומטר (אדום) של דילולים סידוריים הכפול של lysates מהאדם נגזר שורת תאים מלנומה, WM793. בנוסף, קרום זה גם נחתך למקטעים המבוססים על המשקולות מולקולריות של מטרות חלבון הרצויות, על מנת לאפשר ליותר משני נוגדנים כדי להיבחן על אותו הכתם. למשל, הקרום ניתח באיור 1 נחתך במחצית על מנת לחקור את היציאה התחתונהיון של הממברנה עם נוגדן שלישי, BIM הכולל (700 ננומטר ערוץ אדום) מבלי להסיק עם זיהוי של שני ERK1 סך הכל / 2 ו β-אקטין. הפנל הראשון של איור 2 ממחיש עוד יותר את זיהוי ניאון כתם המערבי בשני צבעים של phospho-ERK1 / 2 (800 ננומטר ערוץ ירוק) וסך הכל ERK1 / 2 (700 ננומטר ערוץ אדום) עם חופף אותות ERK phospho-ERK וכולל מוצג בצהוב של WM793 תאים מלנומה שטופלו בנוכחות והיעדר מעכב MEK1 / 2, PD0325901 (MEKi), שמדכא את מסלול איתות ERK1 / 2 kinase MAP. יתר על כן, ננומטר 700 ו800 תמונות ניאון ננומטר ניתן גם להמיר לתמונות כתם המערביות בשחור לבן הסטנדרטי לכל נוגדן (איורים 1 ו -2). באופן כללי, רוב תמונות כתם מערביות המיוצרים על ידי פרוטוקול זה יגרום לתמונות באיכות גבוהה כפי שהוצגה באיורים 1 ו -2. עם זאת, בהתאם לסלקטיביות, סגוליות,ואיכות של הנוגדן הראשוני, פחות מתמונות אופטימליות יכולה לגרום לחלק קטן מכתמים נותחו על ידי במתודולוגיה זו. לדוגמא, כפי שנצפה בשני פנלים התחתון של איור 2, איכות subpar של נוגדן phospho-BIM בתאים מלנומה WM793 מטופלים עם וללא עיכוב MEK הביאה תמונת כתם מערבית עם להקות חלבון קלושות ורקע קרום גבוה מאוד.
דימות פלואורסצנטי אינפרא אדום בו זמנית של שני יעדים יכולה גם לספק ההזדמנות לניתוח כמותי של כתמים מערביים על פני טווח רחב, ליניארי דינמי ביעילות ובדייקנות איתור להקות גם חזקות וגם חלשות באותו הקרום. כימות של להקות חלבון מחושבת כעוצמת משולבת, שהוא פרופורציונאלי לכמות נוגדנים שכותרתו ניאון על הקרום ואינה תלויה בשניהם גודל הצורה נמשכת סביב הלהקה והרזולוציה. זה מבוסס על הקריטריונים הבאים: 1) הםשל הצורה; 2) מספר הפיקסלים סגורים בצורה; 3) עוצמה ממוצעת של הפיקסלים שנבחרו כרקע ו;. 4) בעוצמה כוללת של פיקסלים סגורים בצורה נתון 10 איור 3 א מציג את כימות החלבון של כתמים מערביים שמודגמים באיור 1. כימות ERK1 סך הכל / 2, β-אקטין, ותערוכת BIM כוללת קשר לינארי בין עלייה בעוצמת המשולבת של אות הניאון והעלייה בריכוז חלבון (איור 3 א). יתר על כן, איור 3 היא דוגמא נוספת לאופן לכמת רמות חלבון מכתמים מערביים ניאון, אשר מציג את כימות החלבון של phospho-ERK1 / 2 מנורמלות לרמות ERK1 / 2 חלבון הכולל של תאים מלנומה WM793 מטופלים עם וללא עיכוב MEK מהאיור 2 . מכימות זה, ניתן לחשב ERK1 / 2 רמות פוספורילציה כאחוז מרמות השליטה. בע"א זוse, רמות phospho-ERK של תאים מלנומה שטופלו במעכבי MEK היו 0.6% מכלל השליטה.
איור 1. ניתוח כתם מערבי באמצעות זיהוי חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום בשני צבעים. Lysates של דילולים סדרתי פי שתיים חלבון מלנומה אדם נגזר WM793 של הופרדו באמצעות ג'ל NuPAGE Novex Bis-טריס עם חלבון מועבר על גבי קרום PVDF באמצעות מנגנון העברת iBlot . קרומים היו חסומים באודיסיאה חסימת הצפת ומששו עם הנוגדנים העיקריים הבאים: ERK1 הארנב נגד סך הכל / 2, BIM ארנב נגד סך הכל, ועכבר אנטי β-אקטין. מתחמי אנטיגן נוגדן התגלו באמצעות עיזים ניאון נגד ארנב IRDye 800 (ירוק) או 680 (אדום) ועז אנטי עכבר IRDye 680 (אדום) נוגדנים משני, בהתאמה,ודמיין עם מערכת הדמיה אודיסיאה קלאסית אינפרא אדום LI-COR. פנל הכתם המערבי הראשון הוא הכיסוי של זיהוי בו זמני בסך הכל ERK1 / 2 (800 ננומטר ערוץ ירוק) וβ-אקטין (700 ננומטר ערוץ אדום) אותות ניאון. הפנל השני הוא גילוי ניאון ערוץ היחיד של BIM המוחלט על אותו הקרום שהופרד באמצעות סכין גילוח המבוסס על המשקולות מולקולריות של חלבוני היעד אלה. שלושה פנלי הכתם המערביים התחתונים הם התמונות בשחור לבן של תמונות ניאון ערוץ יחיד המופרדים.
איור 2. דוגמא של שניהם תמונה גבוהה ואיכות ירודה מערבית כתם באמצעות הקרינה אינפרא אדום. WM793 תאים מלנומה שטופלו גם עם DMSO (CTL) או 2 מיקרומטר של מעכב MEK, PD0325 901 (MEKi), ל18 שעות נותחו כמתואר באיור 1. הקרום היה משש עם ארנב נגד phospho-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), עכבר ERK1 אנטי סך הכל / 2, ועכבר אנטי phospho-BIM (Ser69) עם קומפלקסי אנטיגן נוגדן מזוהים עם עז נגד הארנב IRDye 800 (ירוק) ועז אנטי עכבר IRDye 680 (אדום). פנל הכתם המערבי הראשון הוא הכיסוי של זיהוי בו זמני של שני phospho-ERK1 / 2 (800 ננומטר ערוץ ירוק) וסך הכל ERK1 / 2 אותות (700 ננומטר ערוץ אדום) ניאון. הלוחות שני והשלישי הם התמונות בשחור לבן של תמונות ניאון ערוץ יחידה של phospho וERK1 סך הכל / 2. שני פנלים התחתון הם תמונות ניאון ושחורות ולבנים של phospho-BIM. תמונות אלה מייצגות דוגמא של כתם מערבי subpar שיכול לגרום בשיטה זו בשל האיכות ירודה של הנוגדן הראשוני.
"Src =" p_upload/51149/51149fig3highres.jpg / files/ftp_upload/51149/51149fig3.jpg "/>
איור 3. דוגמאות לכימות חלבון של הכתמים המערביים ניאון אינפרא אדום.) כימות ERK1 סך הכל / 2, β-אקטין, וסך רמות חלבון BIM נקבעו על ידי חישוב עוצמת המשולבת של כל להקת חלבון. העצמה המשולבת היא פרופורציונלית לכמות נוגדנים משני שכותרתו ניאון על הממברנה. כימות ערכי R בריבוע שימשו גם כדי להעריך את רגרסיה ליניארית עבור כל אחד מהנוגדנים ניתח באיור 1. B) של phospho-ERK1 / מנורמלים לERK1 / 2 רמות חלבון הכוללת מאיור 2 2 חושב באמצעות העצמה המשולבת של אות ונתונים ניאון מוצגים כאחוז מDMSO השליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביצירה באיכות גבוהה, כתמים מערביים כמותיים על פי פרוטוקול זה את הדברים הבאים: 1) מדידת ריכוזי חלבון, 2) הכנת מדגם; 3) חוסמים את הקרום ו; 4) איכות ורמה של הנוגדן הראשוני.
הדיוק של מדידה הכולל ריכוזי חלבון יכול להיות השפעה גדולה על כימותי להקות חלבון מאז הרגישות יוצאת דופן של גילוי ניאון אינפרא אדום תגביר כל קלים הבדלים שנמצאו בריכוז החלבון של הדגימות. כדי למנוע אי התאמות בקביעת ריכוז החלבון, שהניבו עקומה סטנדרטית עם קו רגרסיה ליניארית או ערך R בריבוע קרוב ל1 האפשר (R 2 ≥ 0.99 או יותר) הוא חשובים בחישוב המדויק של ריכוז החלבון של כל דגימה . לדוגמא, אם ערך 2 R יורד מתחת 0.99, הכנת תקני BSA טריים עם מים ultrapure וחוזר בזהירותassay כימות חלבון עשוי לעזור להגדיל את ערך 2 R. היא גם הטובה ביותר להימנע מהשימוש pipettor רבת ערוצים כמו זה יהיה ליצור חוסר עקביות בפיפטה שעשויה לתרום לR הופחת 2 ערכים ואי דיוקים בריכוזי החלבון של הדגימות.
הכנת מדגם משחקת תפקיד משמעותי בקביעת האיכות של להקות החלבון, אשר יכולה להיות גם השפעה ישירה על כימות של הלהקות האלה. בעת השימוש במערכת ג'ל Bis-טריס, זה מאוד מומלץ כי דגימות מוכנות עם דוגמא LDS הצפת בגלל pH בסיסי מעט (8.5) של החיץ הזה מספק את המצב האופטימלי להפחתה של אגרות חוב דיסולפיד וdenaturation 4. חיץ מדגם זה מכיל גם לצבוע מעקב Coomassie G250 שמייצר מול צבע חד שנודד עם מול יון הנע, אשר מסייע להבטיח שפפטידים קטנים לא לברוח ג'ל 4. חשוב מכך, לדוגמא LDSחיץ מקטין את המחשוף של אג"ח פפטיד aspartyl-prolyl כאשר דגימות מחוממות על 70 מעלות צלזיוס עקב ה-pH של חיץ שינוי 8.5-8.0 4. התוצאה היא סביבה אידיאלית להפחתה ואלקילציה של חלבונים תוך שמירה על שלמותו של החלבון. עם זאת, אם חיץ מדגם טריס-גליצין SDS משמש במקום מדגם LDS הצפת, זה יוביל למחשוף של אג"ח aspartyl-prolyl, ירידה בחדות של להקות החלבון, ופיצול חלבון עלייה 4. כמו כן הוא רלוונטי להוספת נוגדי חמצון לעליונה הצפת לשכת יחידת אלקטרופורזה מיני הנייד. מאז נוגד חמצון הוא מסוגל comigrate עם הדגימות ב-pH הניטרלי במערכת ג'ל Bis-טריס, זה יכול לעזור לשמור על חלבונים במצב מופחת ולהגן על איגרות חוב דיסולפיד, כמו גם חומצות אמינו רגישות מפני חמצון, ואילו יכול העדר נוגד חמצון להוביל ללהקות חלבון מפוזרות 4. לבסוף, זה מאודמומלץ להשתמש גם MES או מגבים הפעלת מאגר עם ג'לי Bis-טריס בניגוד באמצעות טריס-גליצין SDS הפעלת מאגר עם אלו סוגים של ג'לים. השילוב של טריס-גליצין SDS הפעלת מאגר ותוצאות ג'לי Bis-טריס בהגירה האיטית של יוני גליצין גורם עלייה דרמטית בזמן אלקטרופורזה לרוץ עם הלהקות שהופיעו יותר דחוסות ו4 בצורת כוס.
צעד החסימה הוא קריטי גם להפקת תמונות כתם מערביות באיכות גבוהה באמצעות זיהוי ניאון כמו רבים מסוכני החסימה השונים יכולים ליצור רקע קרום גבוה. לגילוי ניאון אינפרא אדום, עדיף להשתמש אודיסיאה חסימת הצפת כי סוכן חסימה הספציפי הזה מגביר את הרגישות של זיהוי חלבון תוך שמירה על רקע נמוך. למרות שחלב ללא שומן יבש, קזאין, או BSA יכול לשמש גם כסוכני חסימה חלופיים, אלו סוגים של פתרונות יכולים לגרום רקע קרום גבוה יותר ובמקרים מסוימים לירידה בינדיזיקת ננוגרם של הנוגדן הראשוני 10. בנוסף, חוסמי המבוסס על חלב יכולים להכיל IgG שיכול לחצות מגיבים עם phospho-אפיטופים ונוגדנים נגד עזים, אשר יכולה להפריע לדיוק של זיהוי חלבונים ונוגדנים תקינים מחייב 9,11. עם זאת, אם תמונת כתם מערבית נגועה ברקע גבוה, להקות ספציפיות, או חלש / אין אות, תוך ניצול אחד מסוכני החסימה חלופיים אלה לאחר מכן עשוי לעזור כדי לשפר את האיכות של התמונה. יתר על כן, הוא גם המליץ להימנע מהוספת חומר ניקוי לצעד החסימה וincubations חסימה הארוכה היות והדבר עלול להוביל לעלייה ברקע ו / או אובדן של חלבון המטרה מהקרום 9,12.
במקביל איתור שני אנטיגנים שונים באותו הכתם באמצעות נוגדני אינפרא אדום שכותרתו עם ננומטר 700 ו800 צבע ערוץ ננומטר דורש בחירה נבונה של שני נוגדנים הראשוניים ומשניים. שני הנוגדנים העיקריים חייבים להיות נגזרים מהוז שונהמינים לא. לדוגמא, אם נוגדן אחד עיקרי נגזר מארנב, אז הנוגדן הראשוני השני צריך להיות נגזר ממינים שונים אחרים מאשר ארנב, כגון עכבר. בדומה לכך, הנוגדנים המשניים אינפרא אדום גם צריכים להיות נגזרים מאותו המין מארח כמו כל אחד מהנוגדנים הראשוניים ומסומן עם fluorophores שונה. לדוגמא, נגד ארנב עז בערוץ 800 ננומטר יכול להיות בשילוב עם אנטי עכבר עז בערוץ 700nm כדי לצפות במדויק את אות החלבון משני נוגדנים עיקריים שונים הנגזרים מארנב והעכבר.
נוגדנים עיקריים להשתנות במידה ניכרת באיכותם, זיקה, ורגישות לאנטיגן שלהם. זה יכול לגרום לירידה משמעותית באות או עלייה בספציפית המחייב של חלבוני הקרום ובכך ליצור קשיים בצורה מדויקת לדמיין את חלבון המטרה. כך, באמצעות פתרון חלופי חסימה, כמו חלב יבש ללא שומן אוקזאין המומס ב-PBS, עשוי לעזור כדי לשפר את זיהוי החלבון עם נוגדנים עיקריים באיכות ירודה 10. בנוסף, ריכוז חומר הניקוי יכול להשפיע גם על הכריכה של הנוגדן הראשוני לאנטיגן המטרה ואמצעי הזהירות יש לשקול בעת קביעת הריכוז של חומר ניקוי על מנת להימנע משטיפת הנוגדן. ריכוז נמוך של SDS (.01-0.02%) יכול להפחית את הרקע וספציפי מחייב כאשר הוסיף שני הנוגדנים בדילול מלא, במיוחד כאשר באמצעות PVDF קרום 10. עם זאת, SDS יכול גם לשבש את נוגדן אנטיגן מחייב מובילים לירידה חמורה בעוצמת אות.
יתר על כן, שינויי הרומן מתוארים בפרוטוקול זה מדגים גישה מודרנית לטכניקה המערבית סופג המסורתית. פיתוחים חדשני אלו לשפר בצורה דרסטית את היעילות, עקביות, ורגישות של הנתונים מערביים ומאפשר לכימות מדויק של חלבוני יעד מרוביםעל אותו הקרום ללא קשר לעוצמת האות שלהם. חשוב מכך, שינויים אלה חשובים גם להפחית באופן משמעותי את זמן הניסוי של ביצוע כתם מערבי תוך הפקת מידע איכותי וכמות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה מקמהון לסיוע והתמיכה שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מR01 CA176839-01 NIH / NCI (לMM) ופרס מחקר מוסדי ואקדמי לפיתוח קריירה (IRACDA לJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 | |
| 4x NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | |
| 10x NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 | |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 | |
| 20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX | |
| SeeBlue Plus2 Prestained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 | |
| iBlot Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 | |
| β-Actin | Sigma | A2228 | |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A | |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 | |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 | |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 | |
| Odyssey Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Odyssey Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kubo, K. Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling. Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).
- Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).
- Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030. LI-COR Biosciences. , (2007).
- Hambaeus, L.
- DenHollander, N., Befus, D. Loss of antigens from immunoblotting membranes. J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).
