Det snabbaste Western i stan: en modern twist på den klassiska Western blot-analys

Summary

Detta protokoll utforskar det senaste inom utföra Western blot analyser. Dessa nya ändringar anställa en Bis-Tris-gel-system med en 35 min elektrofores kör tid, en 7 min torrt system blotting överföring, och infraröd fluorescerande protein detektion och avbildning som genererar högre upplösning, kvalitet, känslighet och förbättrad noggrannhet av västerländska uppgifter.

Abstract

De Western blot teknik som ursprungligen etablerades i slutet av 1970 fortfarande aktivt utnyttjas idag. Men denna traditionella metoden för Western blotting har flera nackdelar som inkluderar låg kvalitet upplösning, falska band, minskad känslighet, och dålig proteinintegritet. Nya framsteg har drastiskt förbättrat många aspekter av standarden Western blot-protokollet för att producera högre kvalitativa och kvantitativa data. Den Bis-Tris gel systemet, ett alternativ till den konventionella Laemmli-systemet genererar bättre proteinseparation och upplösning, underhåller protein integritet, och minskar elektrofores på en 35 min körning. Dessutom iBlot torr blotting-system, förbättrar dramatiskt effektiviteten och hastigheten för proteinöverföring till membranet i 7 min, vilket är i motsats till de traditionella proteinöverföringsmetoder som ofta är mer ineffektiva med långa överföringstider. I kombination med dessa mycket innovativa förändringar, protein detection hjälp av infraröda fluorescerande imaging resultat i högre kvalitet, mer exakta och konsekventa uppgifter jämfört med standard Western blotting tekniken med kemiluminescens. Denna teknologi kan samtidigt detektera två olika antigener på samma membran genom att utnyttja två-färgs nära-infraröda färgämnen som visualiseras i olika fluorescenskanaler. Vidare linjäritet och brett dynamikområde av fluorescerande avbildning möjliggör exakt kvantifiering av både starka och svaga proteinbanden. Således beskriver detta protokoll de viktigaste förbättringarna av den klassiska Western blotting metod, där dessa framsteg väsentligt öka kvaliteten på data samtidigt kraftigt minska prestationstiden för detta experiment.

Introduction

Tekniken med Western blotting har utvecklats mellan 1977 och 1979 i syfte att skapa en bättre metod för att detektera proteiner med användning av antikroppar ^1-3. Detta förfarande utnyttjade elektroforetisk överföring av proteinerna till membran från SDS-PAGE-geler med målproteiner visualiseras med sekundära antikroppar och detekteras genom autoradiografi, UV-ljus, eller ett peroxidas reaktionsprodukt ^3. Således är dessa samma grundläggande principer fortfarande ofta används i dagens Western blot-protokoll. Men denna klassiska Western blotting tekniken presentera många nackdelar, till exempel långsamma elektrofores körtider, låg upplösning och konstgjorda proteinbanden, känslighet för proteinnedbrytning, och begränsad känslighet samt dålig datakvalitet ^4. Därför beskriver detta protokoll betydande framsteg och förbättringar till den standard Western blot förfarande som genererar mer exakta kvalitativa och kvantitativa data.

"> Den Laemmli-systemet för att separera ett brett spektrum av proteiner med användning av SDS-PAGE är den mest använda gelsystem för Western blotting ^5. Trots populariteten av denna Western-blotting-system, kan denna metod resultera i bandet distorsion, förlust av upplösning, och spurious band ^4. Detta kan vara en konsekvens av deaminering och alkylering av proteiner på grund av högt pH (9,5) av den separerande gelén, återoxidering av reducerad disulfidbindningar på grund av den varierande redoxtillstånd av gelén, och klyvning av aspartyl-prolyl peptidbindningar på grund av uppvärmning av proteinet i Laemmli-buffert (pH 5,2) ^4,6. Bis-Tris gel systemet, som är verksam i ett neutralt pH-värde (7,0), ger betydande fördelar över Lamemmli systemet. förbättrar Systemet proteinstabilitet, minimerar proteinmodifieringar, upprätthåller proteiner i sina reducerade stater, förhindrar aspartyl-prolyl klyvning under elektrofores, och ännu viktigare, är den elektrofores gångtid 35 min ^4,6,7. Dessutom than Bis-Tris gel systemet producerar dessutom skarpare band, högre upplösning och separation, samt ökad känslighet resulterar i mer tillförlitliga uppgifter ^4.

I samband med Bis-Tris-gel-system, använder iBlot torra blotting-systemet med hög fältstyrka och strömmar för att avsevärt minska överföringstiden av proteiner från geler på membran inom 7 min ^8. Detta överföringssystem är baserat på den torra blotting-metoden som genererar en mer effektiv och tillförlitlig överföring av proteiner ^8. För en detaljerad jämförelse av effekten av systemet för iBlot överföring till de konventionella överföringssystem hänvisas till följande webbplats: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Den utnyttjar en anod-och katodstapeln, som är sammansatta av en gelmatris som innehåller de lämpliga överföringsbuffertarna, som verkar som jon reservoarer ^8. Under överföringen, hjälper vatten elektrolys för att förhindra uppkomsten av syre från koppar anoden resulterar i en mer konsekvent proteinöverföring utan att bandet distorsion ^8. Dessutom ökar denna överföringssystem även överföringshastigheten genom att minska avståndet mellan elektroderna ^8.

Även kemiluminiscens är den vanligaste och traditionella tekniken för protein upptäckt av Western blot analyser, tvåfärgad infraröd fluorescerande detektion avsevärt förbättrar känsligheten, kvalitet och noggrannhet av Western blot uppgifter. Denna upptäckt metod använder infraröd laser excitation i två optimala våglängder, 700 nmoch 800 nm, för att generera en klar data, bilder med den största signal-till-brusförhållande och högsta känslighet ^9. Sålunda kan två målproteiner visualiseras samtidigt på samma membran med användning av 700 nm och 800 nm fluorescensdetekteringskanaler. Ännu viktigare är att lineariteten och det dynamiska omfånget av infraröd fluorescens möjliggör exakt kvantitativ analys av både starka och svaga proteinband ^9. Vidare tillhandahåller detta protokoll enorma fördelar och förbättringar över den klassiska Western blotting-teknik, genom att minska elektrofores och överföring gånger med detta experiment utan att äventyra effektiviteten av dessa processer och utnyttjande av infraröda fluorescerande proteindetektion för att producera större kvalitativa och kvantitativa Western blot-data.

Protocol

1. Beredning av helcellslysat från cellodling

1. Placera cellodlingsskålar på is och tillsätt kallt PBS med 5 mM EDTA (t.ex. 5 ml PBS med 5 mM EDTA/10 cm ² platta). Avlägsna vidhäftande cellerna från skålen med användning av en cellskrapa och överför sedan cellsuspensionen till en kall 15 ml koniska rör.
2. Pelletera cellsuspensioner genom låghastighetscentrifugering vid 1000 rpm (230 x g) under 5 minuter vid 4 ° C. Placera koniska rör på is och försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
3. Tvätta pellet med 1 ml PBS med 5 mM EDTA och överföra cellsuspensionen till en kall 1,5 ml centrifugrör. Quick spin fjädring vid 13.000 rpm (13.226 xg) i 10 sekunder till pellets cellerna. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten och placera rören på is.
4. Återsuspendera pelleten i 25 till 200 | il (beroende på pelletstorlek, det vill säga för 3 x 10 ⁶ celler lägga ~ 150 | il RIPA-buffert) iRIPA-buffert (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxikolat, 1% NP-40) innehållande färskt tillsatt proteas och fosfatasinhibitorer vid en 2x slutlig koncentration. Skaka snabbt varje rör och inkubera suspension 20-30 minuter på is. Notera: det finns flera lys buffertar som kan användas för att extrahera proteiner, vilka skiljer sig i deras förmåga att solubilisera proteiner och styrkan i deras denaturerande detergent (t.ex. SDS, Triton X-100 eller NP-40). RIPA-buffert är användbar för framställning av helcellslysat och stör protein-proteininteraktioner.
5. För att skapa ett post-nukleär fraktion, centrifugera lysat vid 14.000 rpm (15.339 xg) i 5 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt rör utan att störa de nukleära-anrikade pellet och placera rören på is. Notera: kärnkraftsberikad pellets kan också lossna från röret samtidigt utvinna supernatanten. För att undvika att samla kärn-berikade pellets, placera pipettspetsen direkt into den viskösa kärn-berikade pellets och rita upp det med pipetten för att göra sig av med det.
6. Bestäm proteinkoncentrationer av varje prov i enlighet med tillverkarens instruktioner under användning av sådana protein kvantifieringsmetoder analyser såsom BCA eller Bradford.

2. Provberedning och elektrofores

1. Förbered varje prov i enlighet med följande diagram anges nedan. Som ett alternativ, kan β-merkaptoetanol också användas vid en slutlig koncentration av 2,5%. Emellertid bör det reducerande medlet tillsättas till varje prov upp till en timme innan laddning av gelén. Den totala volym uppgår till pipetter varianter med endast 20 l av varje förberett prov laddad per brunn.

   REAGENS	Reducerade provet
   Proteinprov	X il
   4x LDS provbuffert	6 | il
   500 nM DTT Röducing Agent	2,4 ^ il
   Avjoniserat vatten	Upp till 15,6 l
   Total volym	24 | il

2. Värme proverna vid 70 ° C under 10 min. Medan proverna uppvärmning, förbereda 1,000 ml 1x MES och MOPS löpande buffert (50 ml 20x MES och MOPS löpande buffert plus 950 ml avjoniserat vatten). MOPS löpbuffert löser medelstora proteiner mellan 14 till 200 kDa, medan MES rinnande buffert löser mindre molekylviktsproteinerna mellan 2-200 kDa med lägre pKa-värde, som tillåter MES rinnande buffert för att köra snabbare än MOPS ^4. Därför har dessa två buffertar kontrasterande effekter på migreringen av joner i uppstaplingsgelen som leder till skillnader i separationen av de proteinband ^4. Ställ åt sidan och kombinera 200 ml 1x MES och MOPS löpande buffert med 500 l av Antioxidant, som kommer att användas för att fylla den övre buffertkammare i Mini-Cell elektroforesenheten.
3. När proverna är klara värme, snabba spin prover innan de placeras på is.
4. För montering av de prefabricerade Bis-Tris geler till Mini-Cell enhet för elektrofores följa tillverkarens anvisningar. OBS: se till att varje gel är orienterade på ett sådant sätt att den kortare (mindre) kassett för varje gel vänd inåt mot buffert Core och gelerna är nivå och tätt tryckt mot buffert Kärna för att undvika läckage från övre buffert avdelningen.
5. Fyll övre buffertkammaren med 200 ml 1x MES och MOPS Running Buffer innehåller Antioxidant och Lower Buffer avdelningen av Mini-Cell enhet med cirka 600 ml 1x MES och MOPS löpande buffert. De extra 200-300 ml löpande buffert kan sparas för senare användning. Emellertid är det inte rekommenderat att återvinna den buffert som användes under elektroforeskörning som pH och kvalitet av bufferten kan ändras.
6. Ladda 20 | il av varje protein sample i varje brunn. Om sektione membranet i olika band i syfte att söka efter flera antikroppar (dvs. mer än 2), är det starkt rekommenderat att ladda 2-5 ìl av förfärgade protein standard i den första och sista brunnar av varje gel eftersom detta kommer att fungera som skärlinjer för att separera de olika delarna av membranet utan att påverka den avbildning av proteinbanden.
7. Kör geler vid 200 V konstant under 35 min med en förväntad ström av 110-125 mA / gel i början och 70-80 mA per gel vid slutet. Elektrofores är färdig när spårning färgämnet migrerar till platinatråd längs Buffert-kärnan.

3. Protein Transfer Använda iBlot Dry Blotting System

1. Helt separera mini geler genom att bryta de bundna sidorna av kassetten (detta kan ge ett sprakande ljud). Kasta den kortare (mindre) platta och töm gelen från längre (slitsade) platta i en behållare med avjoniserat vatten ochta bort den tjocka fotade del av gelén som finns längst ned. OBS: den sällsynta fall kan gelen fäster vid kortare plattan istället för längre, slitsade plattan. I detta fall, kasta längre, slitsad platta och ta bort den tjocka fotade del av gelén som finns längst ned. Sedan, töm gelen från kortare plattan till avjoniserat vatten.
2. Montera anod-och katodöverförings stackar enligt tillverkarens anvisningar. Obs: både nitrocellulosa eller PVDF-membran ger högkvalitativ och effektiv överföring av proteiner och är kompatibla med fluorescerande upptäckt ^8. Emellertid gör PVDF-membran har en högre bindningskapacitet (240 ^ g / cm ³⁾ än nitrocellulosa (200 ^ g / cm ^{3) 8.}
3. Ta försiktigt bort eventuella bubblor eller luft instängd mellan gelen och membranet eftersom detta kommer att förhindra snedvridning av proteinbanden under överföringen. OBS: inte trimma membranet eller transfer stack för att passa din gel storlek som detta kommer att orsaka direkt kontakt mellan anod-och katod stackar.
4. Efter korrekt montering av överförings stackar på torra blotting enheten väljer rätt spänning programmet (dvs. Program 3: 20 V för 7 min) och påbörja överföringen. Obs: proteiner som är större än 150 kDa brukar migrera långsammare och kan kräva en längre överföringstid på 8-10 minuter. Dessutom kommer före inkubation av gelén i 20% etanol under 5-10 min också bidra till att förbättra överföringseffektiviteten av dessa stora proteiner. När överföringen programmet är klar, kommer enheten automatiskt att stänga av strömmen. Det är bäst att genast ta bort membranet och fortsätta med blockeringsförfarande för att säkerställa bättre upptäckt protein och undvika uttorkning membranet.

4. Infraröd Fluorescent Protein Detection

1. Blockmembran (er) på minst 0,8 ml / cm ² av Odyssey Blocking Buffer (Inte Lägg Tween-20) i 1 timme elleröver natten vid 4 ° C. Membran (er) kan även blockeras med fettfri torrmjölk, men detta kan leda till högre bakgrund och interferera med proteindetektion.
2. Inkubera membran (er) i primära antikroppen vid den önskade koncentrationen i Odyssey Blocking Buffer med 0,1% Tween-20 över natt vid 4 ° C. För två-färgsdetektering, i vilken två olika antigen visualiseras på samma blöt, måste två primära antikroppar härledas från olika värdarter och tillsättas samtidigt till membranet (er). OBS: innan inkubering av membranet (er) i primär antikropp, kan membranet (s) vara uppställd i olika bitar för att söka efter flera antikroppar (dvs. mer än 2) på samma membran.
3. Tvätta membran (s) 3 x 10 min i TBS plus 0,1% Tween-20 med försiktig skakning.
4. Inkubera membran (er) med fluorescensmärkta sekundära antikroppar vid en utspädning av 1:20.000 för 700 nm-kanalen och 1:6,000-1:10,000 för 800 nm-kanalen i Odyssey blockeringsbuffert med 0,1% Tween-20 under 30 till 60 min (inkubera membranet (er) under längre tid än en timme kan öka bakgrunden). Skydda membran (er) från ljus. Anm: de sekundära antikropparna måste vara härledd från samma värdart som var och en av de primära antikropparna, och märkta med olika fluoroforer.
5. Tvätta membran (s) 3 x 10 min i TBS plus 0,1% Tween-20 med försiktig skakning. Skydda membran (er) från ljus.
6. Membran (s) kan torkas eller förvaras i antingen TBS eller PBS utan Tween-20 vid 4 ° C tills skannas och avbildas med en infraröd Imaging System. Fluorescerande signal förblir stabil under flera månader om ordentligt skyddade från ljus.

Representative Results

Två-färg infraröd fluorescens upptäcker både starka och svaga band på samma membran med förbättrad känslighet och högsta signal-till-brus-förhållande för att producera tydliga Western blot bilder. Typiska resultat som genereras av två-färgs Western blot detektering visualiseras i både 700 nm och 800 nm fluorescerande kanaler exemplifieras i Figurerna 1 och 2. Den översta Western blot i Figur 1 visar den samtidiga (överlagring) upptäckt av total ERK1 / 2 i 800 nm-kanal (grön) och β-aktin i 700 nm-kanal (röd) i tvåfaldiga spädningar av lysat från människa -härledd melanomcellinje, WM793. Dessutom har detta membran också skurits i sektioner baserade på molekylvikterna för de önskade protein mål för att tillåta mer än två antikroppar som skall undersökas på samma blöt. Till exempel var membranet analyseras i fig. 1 halve för att sondera den nedre portenion av membranet med en tredje antikropp, total BIM (700 nm-kanal-röd) utan inferring med detekteringen av både total ERK1 / 2 och β-aktin. Den första panelen i figur 2 visar två-färgs Western blöt fluorescerande detektion av fosfo-ERK1 / 2 ytterligare (800 nm kanal-grön) och total ERK1 / 2 (700 nm kanal-röd) med överlappande fosfo-ERK och total ERK signaler visas i gult av WM793-melanomceller behandlade i närvaro och frånvaro av den MEK1 / 2-inhibitor, PD0325901 (Meki), vilket undertrycker ERK1 / 2 MAP-kinassignalvägen. Vidare kan 700 nm och 800 nm fluorescerande bilder även omvandlas till standardsvartvita Western blot-bilder för varje antikropp (fig. 1 och 2). I allmänhet kommer huvuddelen av Western blot-bilder som produceras av detta protokoll för att resultera i bilder med hög kvalitet som visats i fig 1 och 2. Men beroende på den selektivitet, specificitet,och kvaliteten på den primära antikroppen, är mindre än optimala bilder kan resultera i att en liten del av blots analyserade med denna metod. Till exempel, såsom observerats i de nedersta två paneler av fig 2, den subpar kvaliteten på fosfo-BIM-antikropp hos WM793-melanomceller behandlade med och utan MEK inhibering resulterade i en Western blot-bild med svaga proteinband och extremt hög membran bakgrund.

Samtidig infraröd fluorescerande avbildning av två mål kan också ge möjlighet till kvantitativ analys av Western blotting över en bred, linjärt dynamiskt område genom att effektivt och korrekt upptäcka både starka och svaga band på samma membran. Kvantifiering av proteinband beräknas som en integrerad intensitet, som är proportionell mot mängden av fluorescensmärkta antikroppar på membranet och är oberoende av såväl storlek som formen dras runt bandet och upplösning. Detta är baserat på följande kriterier: 1) ären av formen, 2) antalet pixlar inneslutna i formen, 3) medelintensiteten av pixlarna som valts som bakgrund och,. 4) totala intensiteten av bildpunkterna är inneslutna i den givna formen ¹⁰ Figur 3A visar det protein kvantifiering av Western-läskningar som visas i fig 1. Kvantifiering av total ERK1 / 2, β-aktin, och total BIM uppvisar ett linjärt samband mellan en ökning i den integrerade intensiteten av den fluorescerande signalen och den ökning av proteinkoncentrationen (figur 3A). Dessutom är figur 3B ett annat exempel på hur man kan kvantifiera proteinnivåer från fluorescerande Western blotting, som visar protein kvantifiering av fosfor-ERK1 / 2 normaliserat till totalt ERK1 / 2 proteinnivåer i WM793 melanomceller behandlade med och utan MEK inhibition från figur 2 . Från denna kvantifiering kan fosforylerade ERK1 / 2 nivåer beräknas som en procent av kontrollnivåer. I detta case, var fosfo-ERK nivåer av melanomceller behandlade med den MEK-inhibitor 0,6% av kontrollen.

Figur 1. Western blot-analys med användning av två-färgs infraröd fluorescerande protein detektion. Lysat av två-faldiga seriespädningar av WM793 melanomprotein från människa härledd separerades med användning av en NuPAGE Novex Bis-Tris-gel med protein överfördes på PVDF-membran med användning av iBlot överföringsanordningen . Membranen blockerades i Odyssey Blocking Buffer och sonderades med följande primära antikroppar: kanin-anti-total ERK1 / 2, kanin-anti-total BIM-och mus anti-β-aktin. Antigen-antikroppskomplex detekterades med användning av fluorescerande get anti-kanin IRDye 800 (grön) eller 680 (röd) och get-anti-mus-IRDye 680 (röd) sekundära antikroppar, respektive,och visualiseras med LI-COR Odyssey Classic Infrared Imaging System. Den första Western blot panelen är en överlagring av samtidig detektion av totala ERK1 / 2 (800 nm-kanal-grön) och β-aktin (700 nm-kanal-röd) fluorescerande signaler. Den andra panelen är en enda kanal fluorescerande detektering av total BIM på samma membran som separerades med användning av ett rakblad baserat på molekylvikterna för dessa målproteiner. De nedre tre Western blot-paneler är de svartvita bilder av de separerade enkanaliga fluorescerande bilder.

Figur 2. Ett exempel på både hög-och låg kvalitet Western blot-bild med hjälp av infraröd fluorescens. WM793-melanomceller behandlades med antingen DMSO (CTL) eller 2 | iM av MEK-inhibitor, PD0325 901 (Meki), under 18 timmar analyserades såsom beskrivs i figur 1. Membranet sonderades med kanin-anti-fosfo-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), mus-anti-total ERK1 / 2, och mus-anti-fosfo-BIM (Ser69) med antigen-antikroppskomplex som detekteras med get-anti-kanin-IRDye 800 (grön) och get anti-mus IRDye 680 (röd). Den första Western blot panelen är en överlagring av samtidig detektion av både fosfor-ERK1 / 2 (800 nm-kanal-grön) och totala ERK1 / 2 (700 nm-kanal-röd) fluorescerande signaler. Den andra och tredje panelerna är de svartvita bilder av en enda kanal fluorescerande bilder av fosfor och total ERK1 / 2. De två nedersta panelerna är fluorescerande och svartvita bilder av fosfor-BIM. Dessa bilder representerar ett exempel på en stycket Western blöt, som kan resultera i denna metod på grund av bristfällig kvalitet av den primära antikroppen.

p_upload/51149/51149fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51149/51149fig3.jpg "/>
Figur 3. Exempel på protein kvantifiering av de infraröda fluorescerande Western blöts. A) Kvantifiering av total ERK1 / 2, β-aktin, och totala BIM proteinnivåer bestämdes genom att beräkna den integrerade intensiteten hos varje proteinband. Den integrerade intensiteten är proportionell mot mängden av fluorescensmärkta sekundära antikroppar på membranet. R-kvadratvärden användes också för att utvärdera den linjära regressionen för var och en av antikropparna analyseras i figur 1. B) Kvantifiering av fosfo-ERK1 / 2 normaliseras till den totala ERK1 / 2-proteinnivåer från Figur 2 beräknades under användning av integrerade intensiteten av den fluorescenssignal och data presenteras som en procent av den DMSO-kontroll.

Discussion

De kritiska stegen i att generera högkvalitativa, kvantitativa Western blotting enligt detta protokoll är följande: 1) mätning av proteinkoncentrationer, 2) provberedning, 3) blockerar membranet och, 4) kvalitet och kaliber på den primära antikroppen.

Noggrannheten för mätning av den totala proteinhalter kan ha en stor inverkan på att kvantifiera proteinband eftersom den exceptionella känsligheten för IR fluorescerande upptäckt förstärker några små skillnader som finns i proteinkoncentrationen av proverna. För att undvika avvikelser i bestämning av proteinkoncentrationen, generera en standardkurva med en linjär regressionslinje eller R-kvadratvärdet så nära 1 som möjligt (R ² ≥ 0,99 g eller mindre) är viktigt vid exakt beräkning av proteinkoncentrationen i varje prov . Till exempel, om värdet på ^R2 sjunker under 0,99, förbereder färska BSA standarder med ultrarent vatten och försiktigt upprepaprotein kvantifiering analys kan bidra till att öka värdet på ^R2. Det är också bäst att undvika att använda en flerkanalig pipett eftersom detta kommer att generera inkonsekvenser i pipettering som kan bidra till minskad R ^2-värden och felaktigheter i proteinkoncentrationen av proverna.

Provberedning spelar en betydande roll för att bestämma kvaliteten på de proteinband, som också kan ha en direkt effekt på kvantifieringen av dessa band. Vid användning av Bis-Tris gel systemet, är det starkt rekommenderat att proverna är beredda med LDS provbuffert eftersom svagt alkaliskt pH (8,5) i denna buffert ger optimal förutsättning för att minska disulfidbindningar och denaturering ^4. Detta prov buffert innehåller också en Coomassie G250 spårning färgämne som ger en skarp färgfronten som vandrar med den rörliga jon fronten, vilket bidrar till att små peptider inte kör bort gelen ^4. Ännu viktigare, LDS SampleBuffert minimerar klyvning av aspartyl-prolyl peptidbindningar när prover upphettades vid 70 ° C på grund av pH-värdet hos bufferten ändra 8,5-8,0 ^4. Detta resulterar i en idealisk miljö för reduktion och alkylering av proteiner och samtidigt bevara integriteten av proteinet. Om emellertid en Tris-glycin SDS-provbuffert användes i stället för den LDS provbuffert, kommer detta att leda till klyvning av aspartyl-prolyl bindningar, en minskning av skärpan hos proteinbanden, och en ökning av proteinfragmentering ^4. Det är också relevant att lägga till Antioxidant till övre buffertkammare Mini-Cell elektroforesenheten. Eftersom Antioxidant kan comigrate med proverna vid neutralt pH i Bis-Tris-gel-system, kan detta hjälpa till att bibehålla proteiner i ett reducerat tillstånd och skydda disulfidbindningar liksom känsliga aminosyror mot oxidation, medan frånvaro av antioxidant kan leda till diffunderade proteinband ^4. Slutligen är det mycketrekommenderas att använda antingen MES eller MOPS löpbufferten med Bis-Tris-geler i motsats till användning av Tris-glycin SDS kömingsbuffert med dessa typer av geler. Kombinationen av Tris-glycin SDS kömingsbuffert och Bis-Tris-geler resulterar i den långsamma migrationen av glycin-joner orsakar en dramatisk ökning i elektrofores gångtid med band som uppträder mer komprimerade och skålformade ^4.

Den blockerande steget är också avgörande för att producera Western blot-bilder med hög kvalitet med användning av fluorescensdetektion då många av de olika blockeringsmedel kan generera hög membran bakgrund. För infraröd fluorescerande upptäckt, är det bäst att använda Odyssey Blocking Buffer eftersom denna specifika blockerande medel ökar känsligheten för protein detektion bibehållen låg bakgrund. Även fettfri torrmjölk, kasein, eller BSA också skulle kunna användas som alternativa blockeringsmedel, kan dessa typer av lösningar orsaka högre membran bakgrund och i vissa fall en minskning i bindienng affiniteten av den primära antikroppen ^10. Dessutom kan mjölkbaserade blockerare innehålla IgG som kan korsreagera med fosfonotio-epitoper och anti-get-antikroppar, som kan störa noggrannheten av protein upptäckt och korrekt antikroppsbindning ^9,11. Men om en Western blöt avbildar plågas av hög bakgrund, ospecifika band, eller svag / ingen signal och sedan utnyttja ett av dessa alternativa blockeringsmedel kan bidra till att förbättra kvaliteten på bilden. Dessutom är det också rekommenderat att undvika att lägga tvättmedel till blockeringssteget och långa blockerings inkubationer eftersom detta kan leda till en ökning av bakgrunden och / eller förlust av målproteinet från membranet ^9,12.

Samtidigt detektera två olika antigener på samma blöt med användning av infraröda antikroppar märkta med en 700 nm och 800 nm kanal färgämne kräver välbetänkt urval av både de primära och sekundära antikroppar. De två primära antikroppar måste härledas från olika vät arter. Till exempel, om en primär antikropp är härledd från kanin, då måste den andra primära antikroppen för att vara härledda från en annan art än kanin olika arter, såsom mus. På liknande sätt behöver de infraröda sekundära antikroppar också vara härledda från samma värdart som var och en av de primära antikropparna, och märkta med olika fluoroforer. Exempelvis kan en get-anti-kanin i 800 nm-kanalen kombineras med en get-anti-mus i 700 nm-kanalen för att exakt observera proteinet signalen från två olika primära antikroppar som är härledda från kanin och mus.

Primära antikroppar varierar kraftigt i kvalitet, samhörighet, och känslighet för deras antigen. Detta kan resultera i en signifikant reduktion i signal eller en ökning av icke-specifik bindning av proteiner till membranet och därigenom skapa svårigheter att noggrant visualisera målproteinet. Således, genom att använda en alternativ blockeringslösning, såsom fettfri torrmjölk ellerkasein upplöst i PBS, kan bidra till att förbättra proteindetektering med låg kvalitet primära antikroppar ^10. Dessutom kan koncentrationen tvättmedel också påverka bindningen av den primära antikroppen till målantigenet och försiktighet bör beaktas vid bestämning av koncentrationen av rengöringsmedel för att undvika att tvätta bort antikroppen. En låg koncentration av SDS (från 0,01 till 0,02%) kan minska bakgrund och icke-specifik bindning när den tillsätts till den utspädda sekundära antikroppen, speciellt vid användning av PVDF-membran ^10. Emellertid SDS kan också störa antigenantikroppsbindning vilket leder till en kraftig minskning av signalstyrkan.

Dessutom är de nya ändringar som beskrivs i detta protokoll exemplifierar en modern syn på traditionella Western blotting tekniken. Dessa banbrytande framsteg drastiskt förbättra effektiviteten, konsekvens, och känslighet västerländska uppgifter och gör det möjligt att exakt kvantifiering av flera målproteinerpå samma membran oavsett deras signalstyrka. Ännu viktigare är dessa värdefulla förändringar också avsevärt minska den experimentella tiden att utföra en Western blot samtidigt som det producerar höga kvalitativa och kvantitativa data.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A