Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

Summary

Dieses Protokoll untersucht die neuesten Fortschritte bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen. Diese neuen Änderungen setzen eine Bis-Tris-Gel-System mit einer 35 min Elektrophorese Laufzeit, einer 7 min-Dry-Blotting Transfersystem und Infrarot-fluoreszierende Protein Erkennung und Bildgebung, höhere Auflösung, Qualität, Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der West Daten erzeugt.

Abstract

Die Western-Blot-Techniken, die ursprünglich in den späten 1970er Jahren gegründet wurden, sind auch heute noch aktiv genutzt. Diese traditionelle Methode des Western-Blot hat jedoch mehrere Nachteile, die Auflösung geringer Qualität, Störbänder, verminderte Empfindlichkeit und schlechte Integrität Protein enthalten. Jüngste Fortschritte haben sich drastisch verbessert, zahlreiche Aspekte des Standards Western-Blot-Protokoll, um höhere qualitative und quantitative Daten zu erzeugen. Die Bis-Tris-Gel-System, eine Alternative zu den herkömmlichen Laemmli-System, erzeugt bessere Protein Trennung und Auflösung, hält Proteinintegrität und reduziert die Elektrophorese zu 35 min Laufzeit. Darüber hinaus ist die iBlot Dry-Blotting-System, verbessert deutlich die Wirksamkeit und Geschwindigkeit der Proteintransfer auf die Membran in 7 min, was im Gegensatz zu den traditionellen Methoden, die Proteintransfer häufig ineffizient mit langen Übertragungszeiten ist. In Kombination mit diesen hoch innovativen Modifikationen, Protein Detection mit Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung führt zu höherer Qualität, genauer und konsistenter Daten im Vergleich zu den Standard-Western-Blot-Technik der Chemilumineszenz. Diese Technologie kann gleichzeitig erfassen zwei verschiedene Antigene auf derselben Membran unter Verwendung von Zweifarben-Nah-Infrarot-Farbstoffen, die in unterschiedlichen Fluoreszenzkanäle visualisiert werden. Darüber hinaus ermöglicht die präzise Quantifizierung der starken und schwachen Proteinbanden die Linearität und großen Dynamik des Fluoreszenz-Bildgebung. So beschreibt dieses Protokoll die wichtigsten Verbesserungen des klassischen Western-Blot-Verfahren, bei dem diese Fortschritte die Qualität der Daten deutlich zu erhöhen, während die Leistungszeit dieses Experiments stark reduziert.

Introduction

Die Technik der Western-Blot wurde erstmals zwischen 1977 und 1979, um eine bessere Methode zum Nachweis von Proteinen mit Hilfe von Antikörpern ^3.1 erstellen entwickelt. Dieses Verfahren verwendet elektrophoretischen Transfer von Proteinen an Membranen, die aus SDS-PAGE-Gelen mit Zielproteinen visualisiert mit Sekundärantikörper und durch Autoradiographie, UV-Licht oder einem Peroxidase-Reaktionsprodukt ³ detektiert. Somit sind diese gleichen Grundprinzipien sind noch weitgehend in der heutigen Western-Blot-Protokolle verwendet. Allerdings ist diese klassische Western-Blot-Technik derzeit viele Nachteile, wie langsam Elektrophorese-Laufzeiten, niedrige Auflösung und künstliche Proteinbanden, die Anfälligkeit für Proteinabbau und begrenzte Empfindlichkeit als auch schlechte Datenqualität ^4. Daher beschreibt dieses Protokoll signifikante Fortschritte und Verbesserungen der Standard-Western-Blot-Verfahren, die genauer qualitative und quantitative Daten erzeugt.

"> Der Laemmli-System für die Trennung ein breites Spektrum von Proteinen mittels SDS-PAGE ist die am häufigsten verwendete Gel-System für ^{Western-Blot-5.} Trotz der Beliebtheit des Western-Blot-System, kann diese Methode in der Bandverzerrung, Verlust der Auflösung, und führen Störbänder ^4. Dies kann eine Folge der Desaminierung und Alkylierung von Proteinen aufgrund der hohen pH-Wert (9,5) des Trenngel, Reoxidation des reduzierten Disulfidbindungen aufgrund der unterschiedlichen Redox-Zustand des Gels, und die Spaltung der Aspartyl-Prolyl sein Peptidbindungen durch Erwärmen des Proteins in Laemmli-Puffer (pH 5,2) ^4,6. Die Bis-Tris-Gel-System, das bei einem neutralen pH-Wert (7,0) arbeitet, bietet erhebliche Vorteile gegenüber dem Lamemmli System. Dieses System verbessert die Proteinstabilität, minimiert Proteinmodifikationen, behält Proteine ​​in ihren reduzierten Zuständen verhindert Aspartyl-Prolyl-Spaltung während der Elektrophorese, und noch wichtiger, ist der Elektrophorese-Laufzeit 35 min ^4,6,7. Zusätzlich ter Bis-Tris-Gel-System produziert auch schärfer Bands, höhere Auflösung und Trennung, und erhöhte Empfindlichkeit, was zu zuverlässigeren Daten ^4.

In Verbindung mit der Bis-Tris-Gel-System, verwendet der iBlot Dry-Blotting-System hohe Feldstärke und Ströme, um die Übertragungszeit von Proteinen aus Gelen deutlich reduzieren auf Membranen innerhalb von 7 min ^8. Dieses Übertragungssystem ist auf dem trockenen Blotting-Verfahren, die eine effiziente und zuverlässige Übertragung von Proteinen auf der Basis ⁸ erzeugt. : Für einen detaillierten Vergleich der Wirksamkeit der iBlot Transfersystem zu den herkömmlichen Übertragungssystemen finden Sie in der folgenden Website http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Es verwendet eine Anode und Kathode Stapel, die aus einer Gelmatrix, die die entsprechenden Übertragungspuffer, die als Ionen Reservoirs ⁸ handeln enthält bestehen. Während der Übertragung, hilft die Wasserelektrolyse, die Erzeugung von Sauerstoff aus der Kupferanode, was zu einer konsistenteren Proteintransfer ohne Verzerrung Band ⁸ zu verhindern. Außerdem erhöht diese Übertragungssystem auch die Übertragungsgeschwindigkeit, indem der Abstand zwischen den Elektroden ^8.

Obwohl Chemilumineszenz ist die häufigste und traditionelle Technik zur Detektion von Protein-Western-Blot-Analysen, zwei-Farben-Infrarot-Fluoreszenzdetektion stark die Empfindlichkeit, Qualität und Genauigkeit der Western-Blot-Daten verbessert. Dieses Nachweisverfahren nutzt Infrarot-Laser-Anregung in zwei optimalen Wellenlängen 700 nmund 800 nm, um ein klares Bild Daten mit dem größten Signal-zu-Rausch-Verhältnis und höchste Sensitivität ⁹ generieren. Somit können zwei Zielproteine ​​gleichzeitig auf derselben Membran unter Verwendung der 700 nm und 800 nm Fluoreszenzdetektionskanäle visualisiert werden. Noch wichtiger ist, ermöglicht eine genaue quantitative Analyse von starken und schwachen Proteinbanden ⁹ die Linearität und den dynamischen Bereich der Infrarot-Fluoreszenz. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll enorme Vorteile und Verbesserungen gegenüber dem klassischen Western-Blot-Technik durch Verringern der Elektrophorese und Übertragungszeiten dieses Experiments ohne die Wirksamkeit dieser Verfahren und Verwendung Infrarot-Fluoreszenzproteindetektion größere qualitative und quantitative Western-Blot-Daten zu erzeugen.

Protocol

1. Zubereitung ganzer Zellysate aus Zellkultur

1. Zeigen Zellkulturschalen auf Eis und kaltes PBS mit 5 mM EDTA (z. B. 5 ml PBS mit 5 mM EDTA/10 cm ² Schild). Entfernen anhaftender Zellen von der Schale mit einem Zellschaber und übertragen die Zellsuspension in einem kalten 15 ml konischen Röhrchen dann.
2. Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit bei 1000 Upm (230 × g) für 5 min bei 4 ° C. Zeigen konische Röhrchen auf Eis und den Überstand vorsichtig absaugen, ohne dass der Pellets.
3. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml PBS mit 5 mM EDTA und übertragen Zellsuspension zu einer kalten 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Schnell Spin Suspension bei 13.000 rpm (13.226 xg) für 10 sec Zellen zu pelletieren. Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet und Ort Röhrchen auf Eis zu stören.
4. Das Pellet in 25-200 &mgr; l (je nach Granulatgröße, dh 3 × 10 ⁶ Zellen hinzuzufügen ~ 150 &mgr; l RIPA-Puffer) inRIPA-Puffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1% NP-40) mit frisch zugesetzten Protease-und Phosphatase-Inhibitoren bei einer Endkonzentration 2x. Kurz vortexen jedes Rohr Suspension und Inkubation für 20-30 min auf Eis. Hinweis: Es gibt mehrere Lyse-Puffer, die verwendet werden können, um Proteine ​​zu extrahieren, die in ihrer Fähigkeit, Proteine ​​und Stärke ihrer denaturierenden Detergens (z. B. SDS, Triton X-100 oder NP-40) zu solubilisieren abweichen. RIPA-Puffer ist zur Herstellung von ganzen Zelllysaten und stören Protein-Protein-Wechselwirkungen.
5. Um eine post-Kernfraktion, Zentrifuge Lysate bei 14.000 rpm (15.339 xg) für 5 min bei 4 ° C zu erstellen Den Überstand in ein neues Röhrchen, ohne die Kern angereicherten Pellets und Ort Röhrchen auf Eis zu stören. Hinweis: Die Kern angereicherte Pellet kann auch aus dem Rohr zu lösen, während das Extrahieren des Überstandes. Um das Sammeln der Kern angereicherten Pellets zu vermeiden, legen Sie die Pipettenspitze direkt into viskosen Kern angereicherten Pellets und ziehen Sie es mit der Pipette, um ihn zu entsorgen.
6. Bestimmen der Proteinkonzentration jeder Probe nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung solcher Proteinquantifizierungsassays als BCA-oder Bradford.

2. Probenvorbereitung und Elektrophorese

1. Vorbereitung jeder Probe entsprechend der folgenden Übersicht zusammengestellt. Als Alternative können auch β-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 2,5% verwendet werden. Jedoch sollte das Reduktionsmittel zu jeder Probe bis zu einer Stunde vor dem Laden des Gels zugesetzt werden. Das Gesamtvolumen Konten zum Pipettieren Varianten mit nur 20 ul jeder hergestellten Probe pro belastet auch.

   REAGENS	Reduzierten Probe
   Proteinprobe	X ul
   4x LDS Sample Buffer	6 ul
   500 nM DTT Reducing-Agent	2,4 ul
   VE-Wasser	Bis zu 15,6 ul
   Gesamtvolumen	24 ul

2. Wärme Proben bei 70 ° C für 10 min. Während die Proben erhitzt, bereiten 1.000 ml 1x MES-oder MOPS-Laufpuffer (50 ml 20x MES-oder MOPS Laufpuffer und 950 ml VE-Wasser). MOPS-Laufpuffer löst mittelgroße Proteine ​​zwischen 14-200 kDa, während MES Laufpuffer löst geringeren Molekulargewicht zwischen Proteinen 2-200 kDa mit einem niedrigeren pKa, die die MES-Laufpuffer, um schneller als die MOPS ⁴ laufen zu lassen. Somit sind diese beiden Pufferspeicher haben gegenläufigen Effekten auf die Wanderung der Ionen im Sammelgel, die Unterschiede in der Trennung der Proteinbanden ⁴ führt. Beiseite stellen und kombinieren 200 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer mit 500 ul Antioxidationsmittel, die verwendet werden, um die obere Pufferkammer der Min füllen werdeni-Cell Elektrophorese-Einheit.
3. Sobald die Proben, bevor Sie sie auf Eis fertig Heizung, schnelle Runde Proben.
4. Für die Montage der Fertig Bis-Tris Gele in den Mini-Cell-Einheit für die Elektrophorese folgen den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jedes Gel wird in der Weise orientiert, dass die kürzeren (kleineren) Kassette jedes Gels Gesichter nach innen auf die Buffer-Core und die Gele sind eben und fest gegen den Buffer-Core gedrückt, um das Auslaufen aus dem oberen Pufferkammer zu vermeiden.
5. Füllen Sie den oberen Pufferkammer mit den 200 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer, der die Antioxidationsmittel und der unteren Pufferkammer der Mini-Cell-Einheit mit ca. 600 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer. Die zusätzlichen 200 bis 300 ml Laufpuffer kann zur späteren Verwendung gespeichert werden. Es wird jedoch nicht empfohlen, den Puffer während der Elektrophorese Lauf verwendet, wie der pH-Wert und die Qualität des Puffers können geändert werden, zu recyceln.
6. Legen Sie 20 ul jedes Protein sample in jede Vertiefung. Wenn Schnitt die Membran in verschiedenen Streifen, um für mehrere Antikörper (dh mehr als 2) zu untersuchen, ist es dringend empfohlen, 2-5 ul der vorgefärbten Proteinstandard in der ersten und letzten Wells jeder Gel laden, da dies als zu dienen Schneidführungen für die Trennung der verschiedenen Abschnitte der Membran, ohne die Abbildungs ​​der Proteinbanden.
7. Gele laufen bei 200 V konstant 35 min mit einem erwarteten Strom von 110-125 mA / Gel zu Beginn und 70-80 mA pro Gel am Ende. Elektrophorese ist beendet, wenn die Tracking-Farbstoff wandert zu der Platindraht entlang der Buffer-Core.

3. Protein-Transfer mit den iBlot Dry Blotting-System

1. Völlig trennen die Mini-Gele, die durch das Brechen der gebundenen Seiten der Kassette (das kann eine knisterndes Geräusch zu erzeugen). Entsorgen Sie den kürzeren (kleineren) Platte und das Gel sorgfältig übertragen von der längeren (Schlitz)-Platte in einen Behälter mit VE-Wasser undentfernen Sie die dicke tritt Teil des Gels auf der Unterseite. Hinweis: In seltenen Fällen kann das Gel auf die kürzere Platte statt der mehr zu befestigen, geschlitzte Platte. In diesem Fall verwerfen die längere, Schlitzplatte und die dicke tritt Teil des Gels an der Unterseite des Geräts entfernen. Anschließend vorsichtig mit dem Gel übertragen von der kürzeren Platte VE-Wasser.
2. Montieren die Anoden-und Kathodenübertragungsstapel nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: sowohl Nitrocellulose oder PVDF-Membranen bieten qualitativ hochwertige und effiziente Übertragung der Proteine ​​und sind mit Fluoreszenzdetektion ⁸ kompatibel. Jedoch PVDF-Membran hat eine höhere Bindungskapazität (240 &mgr; g / cm ³⁾ als Nitrocellulose ⁸ (200 &mgr; g / cm ^3).
3. Entfernen Sie vorsichtig jegliche Blasen oder Luft zwischen dem Gel und Membran, wie diese gefangen wird jede Verzerrung der Proteinbanden während der Übertragung zu verhindern. Hinweis: nicht die Membran oder die transf trimmener stapeln, um Ihre Gel-Größe passen, da dies direkten Kontakt zwischen Anoden-und Kathoden Stacks führen.
4. Nach der korrekten Montage der Transfer-Stacks auf der Dry-Blotting-Gerät, wählen Sie die entsprechende Spannungsprogramms (dh Programm 3: 20 V für 7 min) und beginnen Sie die Übertragung. Hinweis: Proteine ​​größer als 150 kDa neigen wandern langsamer und kann eine längere Übertragungszeit von 8-10 min erfordern. Darüber hinaus wird vor der Inkubation des Gels in 20% igem Ethanol für 5-10 min auch helfen, die Übertragungseffizienz dieser große Proteine ​​zu verbessern. Sobald das Transferprogramm abgeschlossen ist, wird das Gerät automatisch die aktuelle geschlossen. Es ist am besten, sofort den Membran und gehen Sie mit der Sperrverfahren, um eine bessere Proteindetektion zu gewährleisten und zu verhindern Austrocknen der Membran.

4. Infrarot-Fluorescent Protein-Erkennung

1. Block-Membran (en) in einem Minimum von 0,8 ml / cm ² Odyssey Blocking Buffer (Nicht hinzufügen Tween-20) für 1 h oderüber Nacht bei 4 ° C. Membran (en) kann auch mit fettfreier Trockenmilch blockiert werden, aber dies kann höher Hintergrund verursachen und Proteinnachweis.
2. Inkubieren Membran (en) in primären Antikörper in der gewünschten Konzentration in Odyssey Blockierungspuffer mit 0,1% Tween-20 über Nacht bei 4 ° C. Für Zweifarberkennung, in dem zwei verschiedene Antigene auf der gleichen Blot sichtbar gemacht, müssen die beiden primären Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies abgeleitet und simultan auf die Membran (en) zugegeben werden. Hinweis: Vor der Inkubation der Membran (en) in primäre Antikörper kann die Membran (en) in verschiedenen Stücke geschnitten, um für mehrere Antikörper (mehr als 2) auf der gleichen Membran sondieren.
3. Für 10 min in TBS plus 0,1% Tween-20 unter leichtem Schütteln waschen Membran (en) 3x.
4. Inkubieren Membran (en) mit den fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:20.000 für die 700 nm-Kanal und 1:6,000-1:10,000 für die 800 nm-Kanal in Odyssey Blockierungspuffer mit 0,1% Tween-20 für 30 bis 60 min (Inkubation Membran (e) für mehr als 1 Stunde kann Hintergrund erhöhen). Schützen Membran (en) aus Licht. Anmerkung: Die sekundären Antikörper müssen von der gleichen Wirtsspezies wie jede der primären Antikörpern abgeleitet und mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert werden.
5. Für 10 min in TBS plus 0,1% Tween-20 unter leichtem Schütteln waschen Membran (en) 3x. Schützen Membran (en) aus Licht.
6. Membran (en) kann entweder getrocknet oder in TBS oder PBS gelagert werden, ohne Tween-20 bei 4 ° C bis gescannt und mit einem Infrarot-Abbildungssystem abgebildet wird. Fluoreszenzsignal wird für mehrere Monate stabil bleiben, wenn sie richtig vor Licht geschützt.

Representative Results

Zwei-Farben-Infrarot-Fluoreszenz detektiert sowohl starke als auch schwache Banden auf der gleichen Membran mit erhöhter Empfindlichkeit und dem höchsten Signal-zu-Rausch-Verhältnis, klare Western-Blot-Bilder zu erzeugen. Typische Ergebnisse nach zweifarbige Western-Blot Nachweis sowohl im 700 nm und 800 nm Fluoreszenzkanälen sichtbar gemacht wird, wird in Fig. 1 und 2 veranschaulicht. Die oberste Western-Blot in Fig. 1 zeigt die gleichzeitige (Overlay) Nachweis von Gesamt ERK1 / 2 in den Kanal 800 nm (grün) und β-Actin in den Kanal 700 nm (rot) des zweifachen Serienverdünnungen von Lysaten von menschlichen abgeleiteten Melanomzelllinie, WM793. Darüber hinaus hat diese Membran auch in Abschnitte auf der Basis der Molekulargewichte der gewünschten Protein-Targets, um mehr als zwei Antikörper auf dem gleichen Blot untersucht werden können geschnitten. Zum Beispiel wurde die Membran in Abbildung 1 analysiert in der Hälfte, um den unteren Anschluss Sonde geschnittenIonen der Membran mit einem dritten Antikörper, der Gesamt BIM (700 nm Rot-Kanal) ohne Ableitung mit der Erfassung sowohl insgesamt ERK1 / 2 und β-Actin. Der erste Teil von Abbildung 2 zeigt weiterhin die Zwei-Farben-Western-Blot-Fluoreszenzdetektion von Phospho-ERK1 / 2 (800 nm-Kanal-grün) und Gesamt-ERK1 / 2 (700 nm-Kanal-rot) mit überlappenden Phospho-ERK-und Gesamt ERK Signale in Gelb WM793-Melanom-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit der MEK1 / 2 Inhibitor, PD0325901 (meki), die das ERK1 / 2 MAP-Kinase-Signalweg unterdrückt behandelt angezeigt. Darüber hinaus ist die 700 nm und 800 nm Fluoreszenzbilder können auch die Standard-Schwarz-Weiß-Western-Blot-Bilder für jeden Antikörper (Abbildungen 1 und 2) umgewandelt werden. Im allgemeinen wird die Mehrheit der Western-Blot-Bilder von diesem Protokoll hergestellt in Bildern hoher Qualität führen, wie in den 1 und 2 gezeigt. Jedoch, abhängig von der Selektivität, Spezifität,und Qualität der den primären Antikörper, suboptimale Bilder können in einem kleinen Teil des Blots mit dieser Methode analysiert führen. Zum Beispiel, wie in den beiden Bodenplatten von Fig. 2 beobachtet wird, das unterdurchschnittliche Qualität des Phospho-Antikörper in den BIM WM793-Melanom-Zellen mit und ohne MEK-Hemmung behandelt ergab eine Western-Blot-Bild mit schwachen Proteinbanden und sehr hohen Membran Hintergrund.

Gleichzeitige Infrarot-Fluoreszenz-Imaging von zwei Ziele bieten auch die Möglichkeit für die quantitative Analyse der Western Blots über einen breiten, linearen Dynamikbereich effizient und genau zu erfassen, sowohl starke als auch schwache Banden auf der gleichen Membran. Quantifizierung der Proteinbanden als integrierte Intensität, die proportional zu der Menge an Fluoreszenz-markierten Antikörper auf der Membran ist und unabhängig sowohl von der Größe der Form um das Band und die Auflösung gezeichnet berechnet. Diese basiert auf den folgenden Kriterien: 1) sindein der Form, 2) die Anzahl der Pixel in der Form eingeschlossen ist, 3) Durchschnittsintensität der als Hintergrund ausgewählten Pixel und;. 4) Gesamtintensität der Pixel in der gegebenen Form ¹⁰ eingeschlossen 3A zeigt die Quantifizierung der Protein Western-Blots in Fig. 1 dargestellt. Bestimmung des Gesamt ERK1 / 2, β-Actin, und insgesamt BIM zeigen eine lineare Beziehung zwischen einem Anstieg der integrierten Intensität des Fluoreszenzsignals und die Zunahme der Proteinkonzentration (Fig. 3A). Außerdem ist ein weiteres Beispiel für die Proteinspiegel von Fluoreszenz Western-Blots, die die Protein-Quantifizierung von Phospho-ERK1 / 2 normiert auf Gesamt ERK1 / 2-Proteinspiegel von WM793-Melanom-Zellen mit und ohne MEK-Hemmung von Fig. 2 behandelt zeigt quantifizieren 3B . Quantifizierung von diesem können die phosphorylierte ERK1 / 2 Stufen als Prozent der Kontrollniveaus berechnet werden. In diesem ca.se waren Phospho-ERK Ebenen von Melanomzellen mit dem MEK-Inhibitor behandelten 0,6% der Kontrolle.

Fig. 1 ist. Western Blot-Analyse unter Verwendung von Zweifarb Infrarot-Fluoreszenzproteinnachweis. Lysate von zweifachen Reihenverdünnungen WM793 Menschen abgeleiteten Melanomprotein wurden unter Verwendung eines NuPAGE Novex Bis-Tris-Gel mit Proteins auf PVDF-Membran unter Verwendung der Übertragungsvorrichtung getrennt iBlot . Die Membranen wurden in Odyssey Blocking Buffer blockiert und mit den folgenden primären Antikörpern sondiert: Kaninchen-Anti-Gesamt ERK1 / 2, Kaninchen-Anti-Gesamt BIM und Maus-anti-β-Actin. Antigen-Antikörper-Komplexe wurden unter Verwendung von fluoreszierenden Ziegen-Anti-Kaninchen-IRDye 800 (grün) oder 680 (rot) und Ziege-Anti-Maus IRDye 680 (rot) Sekundärantikörper bzw. erkannt wird,und mit dem LI-COR Odyssey Infrared Imaging System Klassische visualisiert. Das erste Western-Blot-Panel ist die Überlagerung von gleichzeitigen Nachweis von Gesamt ERK1 / 2 (800 nm-Kanal-grün) und β-Actin (700 nm-Kanal-rot) Fluoreszenzsignale. Die zweite Platte ist die einkanalige Fluoreszenzdetektion der Gesamt BIM auf derselben Membran, die mit einer Rasierklinge auf der Basis der Molekulargewichte dieser Zielproteine ​​getrennt wurde. Die unteren drei Western-Blot-Panels sind die Schwarz-Weiß-Bilder der getrennten Einzelkanal-Fluoreszenzbilder.

2. Ein Beispiel sowohl ein hoher und schlechter Qualität Western-Blot-Bild unter Verwendung von Infrarotfluoreszenz. WM793-Melanom-Zellen entweder mit DMSO (CTL) oder 2 uM des MEK-Inhibitors behandelt PD0325 901 (meki), 18 h wurden wie in Fig. 1 beschrieben, analysiert. Die Membran wurde mit Kaninchen-Anti-phospho-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204) sondiert, Maus-Anti-Gesamt-ERK1 / 2 und Maus-Anti-phospho-BIM (Ser69) mit mit Ziege-Anti-Kaninchen IRDye 800 detektiert Antigen-Antikörper-Komplexe (grün) und Ziege-Anti-Maus IRDye 680 (rot). Das erste Western-Blot-Panel ist die Überlagerung von gleichzeitigen Nachweis von sowohl Phospho-ERK1 / 2 (800 nm-Kanal-grün) und insgesamt ERK1 / 2 (700 nm-Kanal-rot) Fluoreszenzsignale. Die zweite und dritte Platten sind die schwarz-weißen Bilder der Einzelkanal-Fluoreszenzbilder von Phospho-und Gesamt ERK1 / 2. Die beiden Bodenplatten sind die Leuchtstoff-und Schwarz-Weiß-Bilder von Phospho-BIM. Diese Bilder stellen ein Beispiel für eine unterdurchschnittliche Westernblot, die mit diesem Verfahren aufgrund der minderwertigen Qualität des primären Antikörpers führen kann.

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3. Beispiele Proteinquantifizierung der Infrarot-Fluoreszenz Western Blots. A) Quantifizierung der Gesamt ERK1 / 2, β-Actin, und BIM Gesamtproteinmengen wurde durch Berechnung der integrierten Intensität von jedem Protein-Bande bestimmt. Die integrierte Intensität ist proportional zu der Menge an Fluoreszenz-markierten Sekundär-Antikörper auf der Membran. R-Quadrat-Werte wurden auch verwendet, um die lineare Regression für jeden der Antikörper in 1 analysiert auszuwerten. B) Quantifizierung von Phospho-ERK1 / 2 normiert auf Gesamt ERK1 / 2-Proteinspiegel aus Fig. 2 wurde unter Verwendung der integrierten Intensität der Fluoreszenzsignal und die Daten werden als Prozent der DMSO-Kontrolle dargestellt.

Discussion

Die kritischen Schritte bei der Erzeugung von qualitativ hochwertigen, quantitative Western-Blots gemäß diesem Protokoll sind folgende: 1) Messung der Proteinkonzentration, 2) Probenvorbereitung, 3) Blockierung der Membran und, 4) Qualität und Kaliber des primären Antikörpers.

Die Genauigkeit der Messung der Gesamtproteinkonzentrationen können einen großen Einfluss auf die Quantifizierung von Proteinbanden, da die außergewöhnliche Empfindlichkeit des Infrarot-Fluoreszenzdetektion wird keine leichte Unterschiede in der Proteinkonzentration der Proben gefunden zu verstärken. Abweichungen bei der Bestimmung der Proteinkonzentration, wodurch eine Standardkurve mit einer linearen Regressionslinie oder R-Quadrat-Wert so nahe wie möglich bei 1 (R ² ≥ 0,99 oder besser) ist wichtig, die genaue Berechnung der Proteinkonzentration jeder Probe zu vermeiden . Zum Beispiel, wenn die R ^2-Wert fällt unter 0,99, Vorbereitung frischen BSA-Standards mit Reinstwasser und sorgfältig Wiederholen derProteinquantifizierung Test kann helfen, die R ^2-Wert zu erhöhen. Es ist auch am besten zu vermeiden, mit einer Mehrkanalpipette, da dies Inkonsistenzen beim Pipettieren zu reduziere R ^2-Werte und Ungenauigkeiten in der Protein-Konzentrationen der Proben beiträgt erzeugen.

Probenherstellung spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Qualität der Proteinbanden, die auch eine direkte Auswirkung auf die Quantifizierung dieser Bänder. Bei der Verwendung des Bis-Tris-Gel-System, ist es sehr empfehlenswert, dass die Proben mit LDS Sample Buffer bereit, weil die leicht alkalischen pH-Wert (8,5) von diesem Puffer bietet die optimale Voraussetzung für die Reduktion von Disulfidbrücken und Denaturierung ^4. Diese Probenpuffer enthält auch eine Coomassie G250 Tracking-Farbstoff, der eine scharfe Farbfront, die mit dem beweglichen Ionen-Front, die sicherstellen, dass kleine Peptide laufen nicht aus dem Gel ⁴ hilft wandert produziert. Noch wichtiger ist, das LDS-ProbenPuffer minimiert die Spaltung von Aspartyl-Prolyl-Peptidbindungen, wenn die Proben bei 70 ° C aufgrund der pH-Wert des Puffers verändert 8,5-8,0 ⁴ erhitzt. Dies ergibt eine ideale Umgebung für die Reduktion und Alkylierung von Proteinen gleichzeitig die Integrität des Proteins. Wenn jedoch ein Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer wird anstelle der LDS-Probenpuffer verwendet wird, wird dies zu der Spaltung der Aspartyl-Prolyl-Bindungen, eine Abnahme der Schärfe der Proteinbanden, und eine Erhöhung Proteinfragmentierung ⁴ führen. Es ist auch relevant für die Antioxidationsmittel in die obere Pufferkammer der Mini-Cell Elektrophorese-Einheit hinzuzufügen. Da die Antioxidationsmittel in der Lage, mit den Proben, die bei neutralem pH-Wert in der Bis-Tris-Gel-System comigrate, kann dies helfen, Proteine ​​in einem reduzierten Zustand und Disulfidbrücken sowie empfindliche Aminosäuren schützen vor Oxidation, während der Abwesenheit des Antioxidans führen zu diffusen Proteinbanden ^4. Schließlich ist es höchstempfohlen, entweder MES-oder MOPS-Laufpuffer mit Bis-Tris-Gele, im Gegensatz zur Verwendung von Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer mit diesen Arten von Gelen zu verwenden. Die Kombination von Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer und Bis-Tris-Gele ergibt die langsame Wanderung von Glycin Ionen verursacht eine dramatische Zunahme in der Elektrophorese-Laufzeit mit Bands mehr komprimiert und becherförmige ⁴ erscheinen.

Der Blockierungsschritt ist entscheidend für die Herstellung qualitativ hochwertiger Bilder Western-Blot unter Verwendung von Fluoreszenzdetektion, wie viele der verschiedenen Blockierungsmittel kann eine hohe Membran Hintergrund erzeugen. Für Infrarot-Fluoreszenzdetektion, ist es am besten verwenden Sie die Odyssey Blocking Buffer, weil diese spezifische Blockierungsmittel erhöht die Empfindlichkeit der Proteindetektion und zu günstigen Hintergrund. Obwohl fettfreier Trockenmilch, Kasein, BSA oder auch als Alternative Blockierungsmittel verwendet werden, können diese Arten von Lösungen höhere Membran Hintergrund verursachen und in einigen Fällen eine Verringerung der binding Affinität des primären Antikörpers ^10. Zusätzlich kann auf Milchbasis Blocker IgG enthalten, die eine Kreuzreaktion mit Phospho-Epitope und Anti-Ziege-Antikörper, die mit der Genauigkeit der Detektion und richtige Proteinantikörperbindung ^9,11 stören könnten. Wenn jedoch eine Western-Blot-Bild durch hohe Hinter unspezifische Banden oder schwach / kein Signal geplagt, kann dann unter Verwendung eines dieser alternativen Blockierungsmittel helfen, die Qualität des Bildes zu verbessern. Darüber hinaus ist es auch empfehlenswert, um das Hinzufügen von Reinigungsmittel in die Blockierungsschritt und lange Sperr Inkubationen, da dies zu einer Erhöhung der Hintergrund und / oder Verlust des Zielproteins aus der Membran ^9,12 führen.

Simultanen Detektion zwei verschiedene Antigene auf derselben Blot unter Verwendung von Infrarot Antikörper mit einer 700 nm und 800 nm Kanal Farbstoff markiert ist eine umsichtige Auswahl sowohl der primären und sekundären Antikörpern. Die beiden primären Antikörper müssen aus verschiedenen hos abgeleitet werdent Arten. Wenn beispielsweise eine primäre Antikörper aus Kaninchen abgeleitet, muss der zweite primäre Antikörper von einer anderen Spezies als Kaninchen unterschiedlichen Spezies, wie Maus abgeleitet werden. Ebenso müssen die Infrarot-Sekundärantikörper auch aus den gleichen Wirtsspezies wie jede der primären Antikörpern abgeleitet und mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert werden. Zum Beispiel kann ein Ziegen-Anti-Kaninchen in der 800 nm-Kanal mit einem Ziege-anti-Maus im 700nm-Kanal, um die Proteinsignal genau beobachten aus zwei verschiedenen primären Antikörper, die aus Kaninchen-und Maus abgeleitet sind kombinierbar.

Primärantikörper variieren erheblich in ihrer Qualität, Affinität und Empfindlichkeit für ihr Antigen. Dies kann zu einer signifikanten Verringerung der Signal oder eine Erhöhung der nichtspezifischen Bindung von Proteinen an der Membran dadurch zu Schwierigkeiten bei der genauen Visualisierung des Zielproteins führen. Somit kann durch Verwendung eines alternativen Blockierungslösung, wie fettfreie Trockenmilch oderCasein in PBS gelöst, kann helfen, die Proteindetektion mit schlechter Qualität Primärantikörper ¹⁰ zu verbessern. Darüber hinaus kann die Reinigungsmittelkonzentration auch auf die Bindung des primären Antikörpers an das Zielantigen und Vorsicht sollte bei der Bestimmung der Konzentration des Detergens, um das Waschen des Antikörpers zu vermeiden, entfernt werden. Eine niedrige Konzentration von SDS (0,01-0,02%) können Hintergrund und unspezifische Bindung zu reduzieren, wenn der verdünnten sekundären Antikörper zugegeben, vor allem bei der Verwendung von PVDF-Membran ^10. Allerdings kann auch stören SDS-Antigen-Antikörper-Bindung führt zu einer starken Reduzierung der Signalstärke.

Darüber hinaus sind die in diesem Protokoll beschriebenen neuen Änderungen veranschaulicht eine moderne Annäherung an den traditionellen Western-Blot-Technik. Diese innovative Entwicklungen drastisch verbessern die Effizienz, Konsistenz, und die Empfindlichkeit der West Daten und ermöglicht die genaue Quantifizierung von mehreren Zielproteineauf der gleichen Membran unabhängig von der Signalstärke. Noch wichtiger ist, diese wertvollen Veränderungen auch deutlich die experimentelle Zeit der Durchführung einer Western-Blot, während die Herstellung qualitativ qualitative und quantitative Daten zu reduzieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A