El más rápido de Occidente en la ciudad: un toque contemporáneo en el análisis clásico de Western Blot

Summary

Este protocolo explora los últimos avances en la realización de análisis de Western blot. Estas nuevas modificaciones emplean un sistema de gel Bis-Tris con una electroforesis en tiempo de ejecución 35 min, un sistema de transferencia Blot seco 7 min, y detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo y formación de imágenes que genera una resolución más alta, la calidad, la sensibilidad, y la mejora de la precisión de los datos occidentales.

Abstract

Las técnicas de transferencia Western que se establecieron originalmente en la década de 1970 todavía se utilizan activamente en la actualidad. Sin embargo, este método tradicional de la transferencia Western tiene varios inconvenientes que incluyen la resolución de baja calidad, bandas espurias, disminución de la sensibilidad, y la pobre integridad de la proteína. Los avances recientes han mejorado drásticamente numerosos aspectos del protocolo de transferencia Western estándar para obtener datos cualitativos y cuantitativos más elevados. El sistema de gel Bis-Tris, una alternativa al sistema de Laemmli convencional, genera una mejor separación y la resolución de la proteína, mantiene la integridad de la proteína, y reduce la electroforesis a un tiempo de 35 min de ejecución. Por otra parte, el sistema de transferencia seco iBlot, mejora drásticamente la eficacia y la velocidad de la transferencia de la proteína a la membrana en 7 min, lo que es en contraste con los métodos de transferencia de proteínas tradicionales que son a menudo más ineficiente con largos tiempos de transferencia. En combinación con estas modificaciones altamente innovadoras, proteína Detection usando infrarrojos resultados de imagen fluorescente de mayor calidad, más precisa y de datos en comparación con la técnica de Western Blot estándar de quimioluminiscencia. Esta tecnología puede detectar simultáneamente dos antígenos diferentes en la misma membrana mediante la utilización de dos colores tintes de infrarrojo cercano que se visualizan en diferentes canales fluorescentes. Además, la linealidad y rango dinámico amplio de imagen fluorescente permite la cuantificación precisa de las bandas de proteínas tanto fuertes y débiles. Por lo tanto, este protocolo se describen las mejoras clave para el método de transferencia Western clásico, en el que estos avances aumentan significativamente la calidad de los datos al tiempo que reduce enormemente el tiempo el rendimiento de este experimento.

Introduction

La técnica de Western Blot se desarrolló por primera vez entre 1977 y 1979 con el fin de crear un mejor método para la detección de proteínas utilizando anticuerpos ^1-3. Este procedimiento utiliza la transferencia electroforética de las proteínas a las membranas de los geles de SDS-PAGE con proteínas diana visualizados utilizando anticuerpos secundarios y detectadas por autorradiografía, la luz ultravioleta, o un producto de reacción de la peroxidasa ^3. Por lo tanto, estos mismos principios básicos siguen siendo ampliamente utilizados en los protocolos de transferencia de Western de hoy. Sin embargo, esta clásica técnica de Western Blot sí presenta muchos inconvenientes, como los tiempos de ejecución lentos electroforesis, baja resolución y bandas de proteínas artificiales, la susceptibilidad a la degradación de las proteínas, y una sensibilidad limitada, así como la mala calidad de los datos ^4. Por lo tanto, este protocolo se describen los avances y mejoras significativas para el procedimiento de transferencia Western estándar que genera los datos cualitativos y cuantitativos más precisos.

"> El sistema de Laemmli para la separación de una amplia gama de proteínas utilizando SDS-PAGE es el sistema de gel más utilizado para el Western Blot ^5. A pesar de la popularidad de este sistema de Western Blot, este método puede dar lugar a una distorsión de la banda, la pérdida de resolución, y bandas espurias ^4. Esto puede ser una consecuencia de la desaminación y de alquilación de las proteínas debido a la alto pH (9,5) de la separación de gel, la reoxidación de la reducción de enlaces disulfuro debido a la variación de estado redox del gel, y la escisión de aspartil-prolil bonos debido al calentamiento de la proteína en tampón de Laemmli (pH 5,2) ^4,6 peptídicos. El sistema de gel Bis-Tris, que opera a un pH neutro (7.0), proporciona beneficios significativos sobre el sistema Lamemmli. Este sistema mejora la estabilidad de la proteína, minimiza modificaciones de la proteína, mantiene las proteínas en sus estados reducidos, impide la división aspartil-prolil durante la electroforesis, y lo más importante, el tiempo de electroforesis ejecutar es 35 min ^4,6,7. Además, Tsistema de gel Bis-Tris él también produce bandas más nítidas, mayor resolución y separación, y aumento de la sensibilidad que resulta en datos más fiables ^4.

En conjunto con el sistema de gel Bis-Tris, el sistema de transferencia seco iBlot utiliza alta intensidad de campo y corrientes para reducir significativamente el tiempo de transferencia de las proteínas a partir de geles a membranas dentro de 7 min ^8. Este sistema de transferencia se basa en el método de transferencia en seco que genera una transferencia más eficiente y fiable de las proteínas de ^8. Para una comparación detallada de la eficacia del sistema de transferencia iBlot a los sistemas convencionales de transferencia, consulte la siguiente página web: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Se utiliza una pila ánodo y el cátodo, que se compone de una matriz de gel que contiene los tampones de transferencia adecuados, que actúan como reservorios de iones ^8. Durante la transferencia, la electrólisis del agua ayuda a prevenir la generación de oxígeno del ánodo de cobre que resulta en una transferencia de proteínas más consistente sin causar la distorsión de la banda ^8. Por otra parte, este sistema de transferencia también aumenta la velocidad de transferencia reduciendo la distancia entre los electrodos ^8.

Aunque quimioluminiscencia es la técnica más común y tradicional para la detección de proteínas de análisis de Western blot, la detección fluorescente en el infrarrojo de dos colores mejora en gran medida la sensibilidad, la calidad y precisión de los datos de transferencia de Western. Este método de detección utiliza excitación de láser infrarrojo en dos longitudes de onda óptimas, 700 nmy 800 nm, para generar una imagen clara de datos con la mayor relación señal-ruido y alta sensibilidad ^9. Por lo tanto, dos proteínas diana pueden ser visualizados simultáneamente en la misma membrana utilizando el 700 nm y 800 canales de detección fluorescentes nm. Más importante aún, la linealidad y rango dinámico de fluorescencia infrarroja permite el análisis cuantitativo preciso de bandas tanto fuertes y débiles de proteínas ^9. Además, este protocolo ofrece enormes ventajas y mejoras sobre la clásica técnica de Western Blot por la disminución de la electroforesis y los tiempos de transferencia de este experimento sin comprometer la eficacia de estos procesos y la utilización de detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo para producir mayores Western blot datos cualitativos y cuantitativos.

Protocol

1. Preparación de lisados ​​de células enteras de cultivo celular

1. Coloque placas de cultivo de células en hielo y añadir PBS frío con EDTA 5 mM (por ejemplo, 5 ml de PBS con 5 mM EDTA/10 cm ² placas). Retire las células adherentes de la placa utilizando un raspador de células y luego transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml de frío.
2. Sedimenten las suspensiones de células por centrifugación a baja velocidad a 1.000 rpm (230 xg) durante 5 min a 4 ° C. Colocar tubos cónicos en hielo y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
3. Lavar el pellet con 1 ml de PBS con EDTA 5 mM y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 1,5 ml en frío. Suspensión de giro rápido a 13.000 rpm (13.226 xg) durante 10 segundos para sedimentar las células. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar los tubos de pellets y colocar en hielo.
4. Resuspender el precipitado en 25-200 l (dependiendo del tamaño de los gránulos, es decir, para 3 x 10 ⁶ células ~ añadir 150 l de tampón RIPA) enTampón RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 10 mM NaF, 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio 0,5%, 1% de NP-40) que contiene la proteasa recién añadido y inhibidores de la fosfatasa a una concentración final de 2x. En resumen vórtice cada tubo y se incuba la suspensión durante 20-30 min en hielo. Nota: hay varios tampones de lisis que se pueden usar para extraer las proteínas, que difieren en su capacidad para solubilizar proteínas y fuerza de su detergente de desnaturalización (es decir, SDS, Triton X-100, o NP-40). Tampón RIPA es útil para la preparación de lisados ​​de células enteras y perturbar las interacciones proteína-proteína.
5. Para crear una fracción post-nuclear, lisados ​​de centrifugación a 14.000 rpm (15.339 xg) durante 5 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo sin interrumpir los tubos de pellets y lugar nucleares enriquecido en hielo. Nota: el pellet nuclear enriquecido también puede desprenderse del tubo mientras se extrae el sobrenadante. Para evitar recoger el sedimento nuclear enriquecido, coloque la punta de la pipeta directamente into el sedimento nuclear enriquecido viscosa y dibujarlo con la pipeta con el fin de disponer de él.
6. Determinar las concentraciones de proteína de cada muestra de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando tales ensayos de cuantificación de proteína como de BCA o de Bradford.

2. Preparación de la muestra y electroforesis

1. Prepare cada muestra de acuerdo con el siguiente cuadro se detalla a continuación. Como alternativa, β-mercaptoetanol también se puede utilizar a una concentración final de 2,5%. Sin embargo, el agente reductor debe añadirse a cada muestra hasta una hora antes de cargar el gel. Las cuentas de volumen total de las variaciones de pipeteo con sólo 20 l de cada muestra preparada cargados por pocillo.

   REACTIVO	MUESTRA REDUCIDA
   Proteína de la muestra	X l
   Sample Buffer 4x LDS	6 l
   500 nM de DTT RojoAgente ucing	2.4 l
   Agua desionizada	Hasta 15,6 l
   Volumen Total	24 l

2. Muestras de calor a 70 ° C durante 10 min. Mientras que las muestras se están calentando, prepare 1000 ml de MES 1x o MOPS funcionamiento de amortiguación (50 ml 20x MES o MOPS funcionamiento de amortiguación, más 950 ml de agua desionizada). MOPS funcionamiento de amortiguación resuelve proteínas de tamaño entre 14-200 kDa, mientras MES Running Buffer resuelve las proteínas de peso molecular más pequeños entre 2-200 kDa con un pKa menor, lo que permite a los MES Running Buffer para correr más rápido que los MOPS ^4. Por lo tanto, estas dos memorias intermedias han de contraste efectos sobre la migración de iones dentro del gel de apilamiento que conduce a diferencias en la separación de las bandas de proteínas ^4. Ponga a un lado y se combinan 200 ml de MES 1x o MOPS funcionamiento de amortiguación con 500 l de antioxidantes, los cuales serán utilizados para llenar la Sala Constitucional del Alto Min Bufferunidad de electroforesis i-Cell.
3. Una vez que las muestras se acaban de calefacción, muestras vuelta rápida antes de colocarlos en hielo.
4. Para el montaje de los prefabricados de hormigón Bis-Tris geles en la unidad Mini-Cell para electroforesis siga las instrucciones del fabricante. Nota: asegúrese de que cada gel está orientado de tal manera que el casete más corto (más pequeño) de cada gel se enfrenta hacia el interior del Buffer Core y los geles son de nivel y firmemente presionado contra el Buffer Core para evitar fugas de la Cámara de búfer superior.
5. Llene la cámara de amortiguación superior con los 200 ml de MES o MOPS Running Buffer que contiene el antioxidante y la Cámara de búfer inferior de la unidad Mini-Cell con unos 600 ml de MES o MOPS Running Buffer 1x 1x. El extra de 200 a 300 ml de tampón se pueden guardar para su uso posterior. Sin embargo, no se recomienda para reciclar el tampón utilizado durante la ejecución de la electroforesis como el pH y la calidad de la memoria intermedia pueden ser alterados.
6. Cargue 20 l de cada samp proteínaLe en cada pocillo. Si el corte de la membrana en varias tiras con el fin de sondear para múltiples anticuerpos (es decir, más de 2), es muy recomendable para cargar 2-5 l de la proteína estándar prestained en los primeros y últimos pocillos de cada gel ya que esto servirá como guías de corte para la separación de las diferentes secciones de la membrana sin afectar a la formación de imágenes de las bandas de proteínas.
7. Geles de funcionar a 200 V constante durante 35 minutos con una corriente esperado de 110-125 mA / gel en la salida y 70-80 mA por gel al final. La electroforesis es completa cuando el colorante migra hacia el seguimiento de alambre de platino a lo largo del tampón Core.

3. Transfer Protein Usando el Sistema Blotting iBlot seco

1. Completamente separar los mini-geles rompiendo las partes unidas de la casete (esto puede producir un ruido crepitante). Deseche la placa más corta (más pequeño) y transfiera con cuidado el gel de la (ranurado) ya la placa en un recipiente con agua desionizada yeliminar la porción de espesor de pierna del gel situado en la parte inferior. Nota: en casos poco frecuentes, el gel puede conectar a la placa más corta en lugar de la más larga, la placa ranurada. En este caso, desechar la, placa ya ranurada y quitar la parte gruesa pierna del gel localizado en la parte inferior. Entonces, transferir cuidadosamente el gel de la placa más corta a agua desionizada.
2. Montar las pilas de transferencia de ánodo y cátodo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: las membranas tanto de nitrocelulosa o PVDF proporcionan alta calidad y eficiente transferencia de las proteínas y son compatibles con la detección fluorescente ^8. Sin embargo, la membrana de PVDF tiene una capacidad de unión más alta (240 g / cm ³⁾ de nitrocelulosa (200 g / cm ^{3) 8.}
3. Quite cuidadosamente cualquier burbuja o el aire atrapado entre el gel y la membrana, ya que esto evitará que cualquier distorsión de las bandas de proteínas durante la transferencia. Nota: no se recorte la membrana o la transfer apilar para adaptarse a su tamaño de gel, ya que esto hará que el contacto directo entre las pilas de ánodo y cátodo.
4. Después de ensamblar correctamente las pilas de transferencia en el dispositivo secante seco, seleccione el programa voltaje apropiado (es decir, el Programa 3: 20 V durante 7 min) y comenzar la transferencia. Nota: Las proteínas de más de 150 kDa suelen migrar más lentamente y pueden requerir un tiempo de transferencia más larga de 8-10 min. Además, la incubación previa del gel en etanol al 20% durante 5-10 min también ayudará a mejorar la eficiencia de la transferencia de estas grandes proteínas. Una vez que el programa de transferencia se haya completado, el dispositivo se apagará automáticamente la corriente. Lo mejor es retirar inmediatamente la membrana y continuar con el procedimiento de bloqueo para asegurar una mejor detección de la proteína y evitar la desecación de la membrana.

4. Detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo

1. Bloquear la membrana (s) en un mínimo de 0,8 ml / cm ² de Odyssey tampón de bloqueo (no añadir Tween-20) durante 1 hora ola noche a 4 ° C. Membrana (s) también puede ser bloqueada con leche en polvo sin grasa, sin embargo esto puede causar mayor fondo e interferir con la detección de la proteína.
2. Incubar la membrana (s) en el anticuerpo primario a la concentración deseada en la Odisea tampón de bloqueo con 0,1% de Tween-20 durante la noche a 4 ° C. Para la detección de dos colores, en el que dos antígenos diferentes se visualizan en la misma transferencia, los dos anticuerpos primarios deben ser derivados de diferentes especies huésped y se añaden simultáneamente a la membrana (s). Nota: antes de la incubación de la membrana (s) en el anticuerpo primario, la membrana (s) puede ser seccionado en varias piezas con el fin de sondear para múltiples anticuerpos (es decir, más de 2) en la misma membrana.
3. Lavar la membrana (s) de 3x durante 10 min en TBS más 0,1% de Tween-20 con agitación suave.
4. Incubar la membrana (s) con los anticuerpos secundarios fluorescentemente marcado a una dilución de 1:20.000 para el canal de 700 nm y 1:6,000-1:10,000 para el canal de 800 nm en Odyssey tampón de bloqueo con 0,1% de Tween-20 durante 30-60 minutos (incubando la membrana (s) durante más de 1 hora puede aumentar el fondo). Protege la membrana (s) de la luz. Nota: los anticuerpos secundarios necesitan ser derivado de la misma especie hospedadora como cada uno de los anticuerpos primarios y etiquetados con diferentes fluoróforos.
5. Lavar la membrana (s) de 3x durante 10 min en TBS más 0,1% de Tween-20 con agitación suave. Protege la membrana (s) de la luz.
6. Membrana (s) puede secarse o almacenarse en cualquiera de TBS o PBS sin Tween-20 a 4 º C hasta su escaneado y la imagen con un sistema de imagen de infrarrojos. Señal de fluorescencia se mantendrá estable durante varios meses si se protege adecuadamente de la luz.

Representative Results

Dos colores de fluorescencia infrarroja detecta bandas tanto fuertes y débiles en la misma membrana con aumento de la sensibilidad y la relación más alta de señal a ruido para producir imágenes de Western blot claras. Los resultados típicos generados por dos colores de detección de transferencia de Western visualizado tanto en el 700 nm y 800 nm canales fluorescentes se ejemplifican en las Figuras 1 y 2. El Western blot más superior en la Figura 1 muestra el concurrente (superposición) de detección del total de ERK1 / 2 en el canal de 800 nm (verde) y β-actina en el canal de 700 nm (rojo) de diluciones en serie de dos veces de los lisados ​​de la humana derivados de la línea celular de melanoma, WM793. Además, esta membrana también se ha cortado en secciones basadas en los pesos moleculares de las proteínas diana deseadas con el fin de permitir más de dos anticuerpos que se examinarán en la misma transferencia. Por ejemplo, la membrana analizado en la Figura 1 se redujo a la mitad con el fin de sondear el puerto inferiorde iones de la membrana con un tercer anticuerpo, BIM total de (700 nm-canal rojo) sin inferir con la detección de tanto total de ERK1 / 2 y β-actina. El primer panel de la Figura 2 demuestra la bicolor Western blot detección fluorescente de fosfato ERK1 / 2 (800 nm-canal verde) y el total de ERK1 / 2 (700 nm-canal rojo) con la superposición de señales ERK fosfo-ERK y el total de muestra en amarillo de WM793 células de melanoma tratadas en presencia y ausencia del inhibidor de MEK1 / 2, PD0325901 (meki), que suprime la vía de señalización de ERK1 / 2 MAP quinasa. Por otra parte, el 700 nm y 800 nm imágenes fluorescentes también pueden ser convertidos a las imágenes de Western blot en blanco y negro estándar para cada anticuerpo (Figuras 1 y 2). En general, la mayoría de las imágenes de Western blot producidos por este protocolo se traducirá en imágenes de alta calidad según lo exhibido en las figuras 1 y 2. Sin embargo, dependiendo de la selectividad, especificidad,y la calidad del anticuerpo primario, menos de imágenes óptimas puede dar lugar a una pequeña porción de los borrones analizados por esta metodología. Por ejemplo, como se observa en los dos paneles inferiores de la Figura 2, la calidad insatisfactoria del anticuerpo fosfo-BIM en las células de melanoma WM793 tratados con y sin inhibición de MEK resultó en una imagen de transferencia de Western con bandas de proteínas débiles y extremadamente alto fondo de membrana.

De imagen fluorescente de infrarrojos simultánea de dos objetivos también puede proporcionar la oportunidad para el análisis cuantitativo de los borrones de Western sobre un amplio rango dinámico, lineal eficiente y precisa la detección de bandas tanto fuertes y débiles en la misma membrana. La cuantificación de las bandas de proteínas se calcula como una intensidad integrada, que es proporcional a la cantidad de anticuerpos marcados con fluorescencia en la membrana y es independiente tanto de tamaño de la forma dibujado alrededor de la banda y resolución. Esto se basa en los siguientes criterios: 1) estánuna de la forma; 2) número de píxeles incluidas en la forma; 3) la intensidad media de los píxeles seleccionados como el fondo y;. 4) la intensidad total de los píxeles cerrados en la forma dada ¹⁰ La Figura 3A muestra la cuantificación de proteínas de la Western blots ilustran en la Figura 1. La cuantificación del total de ERK1 / 2, β-actina, y exposición total de BIM una relación lineal entre el aumento de la intensidad integrada de la señal fluorescente y el aumento de la concentración de proteína (Figura 3A). Por otra parte, la Figura 3B es otro ejemplo de la forma de cuantificar los niveles de proteína de Western blots fluorescentes, que muestra la cuantificación de proteínas de fosfato ERK1 / 2 normalizaron a los niveles totales de ERK1 / 2 de proteínas de células de melanoma WM793 tratados con y sin inhibición de MEK a partir de la Figura 2 . De esta cuantificación, los fosforilados ERK1 / 2 niveles se pueden calcular como un porcentaje de los niveles de control. En este caSE, los niveles de fosfo-ERK de células de melanoma tratados con el inhibidor de MEK fueron 0,6% del control.

Figura 1. Análisis de transferencia de Western usando dos colores infrarrojos detección de la proteína fluorescente. Lisados ​​de doble diluciones seriadas de proteína de melanoma humano derivado de WM793 se separaron usando un gel NuPAGE Novex Bis-Tris con proteínas se transfirieron a membrana de PVDF utilizando el aparato de transferencia iBlot . Las membranas fueron bloqueadas en el Odyssey tampón de bloqueo y probaron con los siguientes anticuerpos primarios: conejo anti-ERK1 total / 2, de conejo anti-total de BIM, y el ratón anti-β-actina. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron utilizando cabra anti-conejo fluorescente IRDye 800 (verde) o 680 (rojo) y de cabra anti-ratón IRDye 680 (rojo) anticuerpos secundarios, respectivamente,y visualiza con el sistema de imágenes por infrarrojos Odyssey Classic LI-COR. El primer panel de transferencia Western es la superposición de la detección simultánea de ERK1 / 2 (800 nm-canal verde) y β-actina (700 nm-canal rojo) señales fluorescentes totales. El segundo panel es la detección fluorescente de un solo canal de BIM total en la misma membrana separada por medio de una cuchilla de afeitar sobre la base de los pesos moleculares de estas proteínas diana. Los tres paneles de Western blot inferiores son las imágenes en blanco y negro de las imágenes fluorescentes de un solo canal separados.

Figura 2. Un ejemplo de una imagen tanto de Western blot de alta y de baja calidad utilizando fluorescencia infrarroja. WM793 células de melanoma tratadas con DMSO (CTL) o 2 mM del inhibidor de MEK, PD0325 901 (meki), durante 18 horas se analizaron como se describe en la Figura 1. La membrana se probaron con conejo anti-fosfato ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), ratón anti-total de ERK1 / 2 y un ratón anti-fosfo-BIM (Ser69) con los complejos antígeno-anticuerpo detectadas con anticuerpo de cabra anti-conejo IRDye 800 (verde) y de cabra anti-ratón IRDye 680 (rojo). El primer panel de transferencia Western es la superposición de la detección simultánea de ambos ERK1 / 2 (700 nm-canal rojo) señales fluorescentes total de fosfato ERK1 / 2 (800 nm-canal verde) y. El segundo y tercer paneles son las imágenes en blanco y negro de las imágenes fluorescentes de un solo canal de fosfato y el total de ERK1 / 2. Los dos paneles inferiores son las imágenes fluorescentes y blancos y negros de fosfo-BIM. Estas imágenes representan un ejemplo de una transferencia Western que puede resultar insatisfactoria con este método debido a la calidad deficiente del anticuerpo primario.

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Figura 3. Ejemplos de la cuantificación de proteínas de los infrarrojos Western blots fluorescentes. A) Cuantificación del total de ERK1 / 2, β-actina, y niveles de proteína total BIM se determinó mediante el cálculo de la intensidad integrada de cada banda de proteína. La intensidad integrada es proporcional a la cantidad de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia en la membrana. También se utilizaron los valores R-cuadrado para evaluar la regresión lineal para cada uno de los anticuerpos analizados en la Figura 1. B) Cuantificación de fosfato ERK1 / 2 normalizado a ERK1 / 2 niveles de proteína total de la Figura 2 se calculó utilizando la intensidad integrada de la señal fluorescente y los datos se presentan como un porcentaje del control de DMSO.

Discussion

Los pasos críticos en la generación de alta calidad, transferencias de Western cuantitativos en función de este protocolo son las siguientes: 1) la medición de las concentraciones de proteínas, 2) la preparación de la muestra, y 3) el bloqueo de la membrana y, 4) la calidad y el calibre de la primaria de anticuerpos.

La precisión de la medición de las concentraciones de proteína total puede tener un impacto importante en la cuantificación de las bandas de proteínas ya que la excepcional sensibilidad de detección fluorescente infrarrojo amplificará caso de pequeños cambios que se encuentran en la concentración de proteínas de las muestras. Para evitar discrepancias en la determinación de la concentración de proteína, generando una curva estándar con una línea de regresión lineal o valor R cuadrado lo más cercano a 1 como sea posible (R ² ≥ 0,99 o mejor) es importante en el cálculo preciso de la concentración de proteína de cada muestra . Por ejemplo, si el valor de I ² cae por debajo de 0,99, la preparación de patrones de BSA frescas con agua ultrapura y repitiendo cuidadosamente laensayo de cuantificación de proteínas puede ayudar a aumentar el valor de R ^2. También es mejor evitar el uso de una pipeta multicanal, ya que esto va a generar inconsistencias en pipeteo que pueden contribuir a la reducción de los valores R ² e inexactitudes en las concentraciones de proteína de las muestras.

Preparación de la muestra juega un papel significativo en la determinación de la calidad de las bandas de proteínas, que también puede tener un efecto directo sobre la cuantificación de estas bandas. Cuando se utiliza el sistema de gel Bis-Tris, se recomienda que las muestras se prepararon con tampón de muestra de LDS porque el pH ligeramente alcalino (8.5) de este tampón proporciona la condición óptima para la reducción de los enlaces disulfuro y la desnaturalización ^4. Este tampón de muestra contiene también un colorante de seguimiento de Coomassie G250 que produce un frente de colorante agudo que migra con el frente de iones en movimiento, lo que ayuda a asegurar que los pequeños péptidos no corren el gel ^4. Más importante aún, la muestra de LDSTampón minimiza la escisión de enlaces peptídicos aspartil-prolil cuando las muestras se calientan a 70 ° C debido a que el pH del tampón de cambio de 8,5 a 8,0 ^4. Esto resulta en un ambiente ideal para la reducción y alquilación de las proteínas al mismo tiempo preservar la integridad de la proteína. Sin embargo, si un tampón de muestras de Tris-Glicina SDS se usa en lugar del tampón de muestra de LDS, esto dará lugar a la escisión de los enlaces aspartil-prolil, una disminución de la nitidez de las bandas de proteína, y un aumento de la fragmentación de la proteína ^4. También es pertinente para añadir el antioxidante a la Cámara de la unidad de electroforesis Mini-Cell Buffer superior. Dado que el antioxidante es capaz de comigraba con las muestras a pH neutro en el sistema de gel Bis-Tris, esto puede ayudar a mantener las proteínas en un estado reducido y proteger enlaces disulfuro, así como los aminoácidos sensibles a la oxidación, mientras que la ausencia de la antioxidante puede dar lugar a bandas de proteínas difusas ^4. Por último, es muyrecomienda usar cualquiera MES o MOPS funcionamiento de amortiguación con Bis-Tris geles en lugar de utilizar Tris-Glicina SDS funcionamiento de amortiguación con este tipo de geles. La combinación de Tris-glicina SDS y tampón de Bis-Tris geles resultados en la lenta migración de iones de glicina que causa un aumento dramático en el tiempo de electroforesis ejecutar con bandas que aparecen más comprimido y en forma de copa ^4.

La etapa de bloqueo también es crucial para la producción de imágenes de transferencia de Western de alta calidad usando la detección fluorescente ya que muchos de los diversos agentes de bloqueo pueden generar un alto fondo de membrana. Para la detección de fluorescencia infrarroja, lo mejor es utilizar la Odisea tampón de bloqueo porque este agente bloqueante específico aumenta la sensibilidad de la detección de proteínas, mientras que el mantenimiento de bajo fondo. Aunque la leche en polvo sin grasa, caseína, o BSA también podrían ser utilizados como agentes de bloqueo alternativos, estos tipos de soluciones pueden causar mayor fondo de membrana y, en algunos casos una disminución en el binding afinidad del anticuerpo primario ^10. Además, los bloqueadores a base de leche pueden contener IgG que pueden reaccionar de manera cruzada con fosfo-epítopos y anticuerpos anti-cabra, lo que podría interferir con la precisión de la detección de la proteína y el anticuerpo adecuado vinculante ^9,11. Sin embargo, si una imagen de transferencia de Western está plagado por un fondo elevado, bandas no específicas, o débil / ninguna señal, entonces la utilización de uno de estos agentes de bloqueo alternativos puede ayudar a mejorar la calidad de la imagen. Por otra parte, también se recomienda para evitar la adición de detergente a la etapa de bloqueo y las incubaciones de bloqueo largos ya que esto puede conducir a un aumento en el fondo y / o la pérdida de la proteína diana de la membrana de ^9,12.

Detectar simultáneamente dos antígenos diferentes en el mismo blot utilizando anticuerpos infrarrojos marcados con un 700 nm y 800 nm de tinte canal requiere una selección prudente de tanto los anticuerpos primarios y secundarios. Los dos anticuerpos primarios deben ser derivados de diferentes hosespecies t. Por ejemplo, si un anticuerpo primario se deriva de conejo, a continuación, el segundo anticuerpo primario necesita ser derivada de una especie diferente que no sean de conejo, como ratón. Del mismo modo, los anticuerpos secundarios infrarrojos también tienen que ser derivado de la misma especie hospedadora que cada uno de los anticuerpos primarios y etiquetados con diferentes fluoróforos. Por ejemplo, un anticuerpo de cabra anti-conejo en el canal de 800 nm se puede combinar con un anticuerpo de cabra anti-ratón en el canal de 700 nm con el fin de observar con precisión la señal de la proteína a partir de dos anticuerpos primarios diferentes que se derivan de conejo y de ratón.

Los anticuerpos primarios varían considerablemente en su calidad, afinidad, y la sensibilidad para su antígeno. Esto puede resultar en una reducción significativa de la señal o un aumento en la unión no específica de proteínas a la membrana creando así dificultades en visualizar con precisión la proteína diana. Por lo tanto, mediante el uso de una solución de bloqueo alternativa, tal como leche en polvo sin grasa ocaseína disuelto en PBS, puede ayudar a mejorar la detección de proteínas con anticuerpos primarios de baja calidad ^10. Además, la concentración de detergente también puede afectar a la unión del anticuerpo primario al antígeno diana y la precaución debe tenerse en cuenta al determinar la concentración de detergente con el fin de evitar el lavado de distancia del anticuerpo. Una baja concentración de SDS (0,01-0,02%) puede reducir el fondo y la unión no específica cuando se añade al anticuerpo secundario diluido, especialmente cuando se utiliza una membrana de PVDF ^10. Sin embargo, SDS también puede interrumpir unión antígeno-anticuerpo que conduce a una severa reducción en la intensidad de la señal.

Por otra parte, las nuevas modificaciones descritas en este protocolo ejemplifica un enfoque moderno de la técnica de Western Blot tradicional. Estos avances de vanguardia mejoran drásticamente la eficacia, la coherencia y la sensibilidad de los datos occidentales y permite la cuantificación precisa de múltiples proteínas dianaen la misma membrana independientemente de su intensidad de señal. Más importante, estas alteraciones valiosos también reducen significativamente el tiempo experimental de la realización de una transferencia de Western, mientras que la producción de altos datos cualitativos y cuantitativos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A