Summary
Vi har udviklet en hjernesnit model, som kan anvendes til at undersøge molekylære mekanismer involveret i excitotoksicitet medieret hjerneskade. Denne teknik genererer levedygtige modne hjernevæv og reducerer antallet af dyr, der kræves for at eksperimentere, samtidig med at den neuronale kredsløb, cellulære interaktioner og postsynaptiske rum delvis intakt.
Abstract
Undersøgelse molekylære mekanismer involveret i neuropatologiske tilstande, såsom iskæmisk slagtilfælde, kan være svært, når anvendelse af hele dyresystemer. Som sådan primær eller 'neuronal-lignende "cellekultursystemer almindeligvis udnyttes. Selv om disse systemer er relativt let at arbejde med, og er nyttige modelsystemer, hvor forskellige funktionelle udfald (såsom celledød) kan let kvantificeres, de undersøgte resultater og veje i dyrkede umodne neuroner (såsom excitotoksicitet medieret celledødsveje) er ikke nødvendigvis de samme som dem, der observeres i modne hjernen eller i intakt væv. Derfor er der behov for at udvikle modeller, der kan undersøges cellulære mekanismer i moden nervevæv. Vi har udviklet en in vitro-teknik, der kan bruges til at undersøge en række molekylære veje i intakte nervevæv. Den beskrevne teknik anvender rotte cortexvæv, men denne teknik kan tilpasses til at anvende vævfra en række forskellige arter (såsom mus, kaniner, marsvin og kylling) eller hjerne-regioner (for eksempel, hippocampus, striatum, osv.). Derudover kan der anvendes en række stimulationer / behandling (for eksempel excitotoksisk indgivelse af inhibitorer, osv.). Sammenfattende kan hjernen skive model beskrevet heri anvendes til at undersøge en række molekylære mekanismer involveret i excitotoksicitet medieret hjerneskade.
Introduction
Den mest almindelige form for slagtilfælde er iskæmisk slagtilfælde, der opstår, når en cerebral blodkar bliver okkluderet. Den vævsiskæmi som resulterer fra ophør af blodgennemstrømning forårsager omfattende depolarisering af membraner, frigivelse af excitatoriske neurotransmittere og vedvarende forøgelse af intracellulært calcium, hvilket fører til aktivering af celledødsveje 1. Denne proces er blevet kaldt "excitotoksicitet" og er en fælles pathway involveret i neuronal død produceres ved en række af sygdomme, herunder slagtilfælde 2. Hæmning af signalveje, der er involveret i excitotoxicity og andre neuroncelledød kaskader er en tiltalende tilgang til at begrænse nerveskader efter slagtilfælde.
Identifikation af præcise molekylære mekanismer involveret i excitotoxicity og iskæmisk slagtilfælde kan være svært, når du bruger hele dyresystemer. Som sådan primær embryonale og "neuronal-lignende" (f.eks neuroblastoma og adenocarcinom udødeliggjort linjer) cellekultursystemer anvendes ofte. De vigtigste fordele ved disse modeller er, at de er nemme at manipulere, forholdsvis omkostningseffektive, og celledød let kan måles og kvantificeres. Dog kan signalveje ændres af de anvendte dyrkningsbetingelser 3,4, og umodne neuroner og udødeliggjorte linier kan udtrykke forskellige receptorer og signalmolekyler i forhold til modne hjerne 5-8. Desuden dyrkede neuroner kun mulighed for at undersøge en celletype (eller to, hvis der anvendes en cokultur-system), mens intakt hjernevæv er heterogen, som indeholder en række celletyper, der interagerer med hinanden. Organotypiske slice dyrkningssystemer (tynde eksplantater af hjernevæv) bruges også, og disse modeller tillader undersøgelse af heterogene populationer af celler, som de er fundet in vivo. Dog kan kun en begrænset mængde af væv opnås fra hvert dyr, når du bruger denne teknik, skiver kanikke dyrkes så længe udødeliggjort cellelinjer, og på mellemlang til lang sigt kultur kan resultere i ændringer i signalveje og receptorer i skiver. Mens modne hjerne kan bruges til at generere organotypiske skiver, skiver fra umodne hjernen er mere modtagelig for kultur, og er mere almindeligt anvendt. Der er derfor behov for at udvikle modeller, der efterligner eller repræsenterer intakte modne hjerne, der er nemme at bruge, hvor der kan undersøges neuronale signalveje.
Heri er en in vitro-teknik, der involverer intakt nervevæv, der kan anvendes til at belyse molekylære mekanismer, der er involveret i celledød efter en excitotoksisk eller iskæmiske skade beskrevet. Denne teknik reducerer antallet af dyr, der kræves for at udføre et eksperiment, er reproducerbar og frembringer levedygtige væv, der opfører sig på en metabolisk måde svarende til større organotypiske skiver. Derudover neuronale kredsløb, cellulære interaktioner og postsynaptiske compartment forbliver delvist intakt. Den fysiologiske buffer anvendte tillader cellemembranerne 'genlukningsindretning', og giver celler til at genvinde deres oprindelige membran modstand 9. Denne hjerne skive model er i stand til trofast efterligne observeret respons efter excitotoxicity medieret hjerneskader 10, og kan bruges til at undersøge de molekylære mekanismer involveret i slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer udføres med godkendelse fra University of Newcastle Animal Care og etiske komité, samt i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og regler, herunder NSW Animal Research Act, NSW Animal Research forordningen, og det australske Code of Practice for Pleje og anvendelse af dyr til videnskabelige formål.
1.. Dissektion af hjernevæv
- Sacrifice tolv uger gamle hanrotter ved halshugning. Rotter kan enten aflives ved bedøvelse og halshugning eller kan først bedøvet med isofluran (5% induktion, 1,5-2% vedligeholdelse) i 70% N2 og 30% O 2, og derefter halshugget.
- Fjern hjerne fra kraniet så hurtigt som muligt (ideelt, bør dette udføres i mindre end 2 min.)
- Fjern cortex ved fri hånd dissektion. Dissektion skal udføres i den kortest mulige periode, med så lidt skade på hjernen som muligt, således at maintain integritet skiver.
- For at fjerne enhver rest af hud, pels, blod, etc., nedsænkes hjernen i en lille mængde (3-5 ml) på 37 ° C Krebs-puffer (118 mM natriumchlorid, 4,7 mM kaliumchlorid, 1,3 mM calciumchlorid, 1,2 mM kaliumdihydrogenphosphat, 1,2 mM magnesiumsulfat, 25 mM natriumhydrogencarbonat, 11,7 mM glucose, 0,03 mM dinatrium ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), ækvilibreret med 95% oxygen / 5% carbondioxid (carbogen), pH 7,4).
2. Fremstilling af Microslices
- Placer hjernen på scenen af en McIlwain helikopter som to skiver filterpapir er blevet placeret, og fugtet med varmt Krebs buffer. Hold hjernen og filterpapir fugtet med varmt Krebs buffer, men ikke så våd, at der er fri væske på overfladen af papiret, der kan forårsage hjernen til at glide rundt.
- Skær hjernen til 250 um koronale sektioner. Som næringsstoffer, ilt og affaldsstoffer thved normalt udveksles med blodforsyningen udveksles med en væske, der omgiver vævet i isolerede neurale væv, bør størrelsen af skiverne ikke være mere end 400 um i tykkelse for at tillade tilstrækkelig iltning og næringsstoffer udveksling at forekomme.
- Drej McIlwain stadie 90 °.
- Skær hjerner i 250 mM sagittale skiver. Heri disse hjerne sektioner (250 um x 250 um skiver af varierende længde afhængigt af tykkelsen af vævet) benævnes microslices.
- Placer microslices i en rundbundet rør med 10-15 ml 37 ° C Krebs-puffer (mængden af Krebs-puffer anvendes, vil afhænge af mængden af væv).
3. Ligevægt af Microslices
- Agitere forsigtigt, indtil de enkelte microslices er suspenderet, og derefter lade dem bosætte under tyngdekraften.
- Fjern forsigtigt supernatanten, som vil være uklar på grund af suspenderet celle debris, og der tilsættes 10 ml frisk 37 ° CKrebs buffer til glasset.
- Gentag denne vaskeprocedure fire gange, hvilket vil resultere i fjernelse af størstedelen af støv.
- Efter dette ækvilibrere microslices ved 37 ° C med forsigtig rystning / inversion og ændre Krebs buffer hver 15 min i 1 time i alt.
- På dette tidspunkt, tilsættes 2 ml frisk 37 ° C Krebs buffer, og overføre 15-20 microslices (150 pi microslice hjulophæng) til flad bund polystyren 5 ml rør ved hjælp af en ekstra bred boring pipettespids med udglattede kanter (som kan skabes ved skæring ~ 2 mm fra enden af en P1000 spids). Spred microslices jævnt over bunden af glasset i et enkelt lag, således at hver microslice er ikke længere end nogle få millimeter fra oxygeneret atmosfære.
4.. Excitotoksisk Stimulation
- Inkuber microslices ved 37 ° C og kontinuerligt passere carbogen over overfladen af 150 pi microslice suspension ved hjælp af en gasledning, der er positioned lige over overfladen af microslice suspension (for at undgå mekanisk forstyrrelse).
- Behandl microslices med enten 150 ul 5 mM glutamat + 100 pM glycin i Krebs-puffer (excitotoksisk stimulus: slutkoncentration 2,5 mM glutamat + 50 uM glycin) eller 150 pi Krebs puffer alene (kontrol-stimulerede). En række af stimuli kan anvendes på dette trin (herunder, men ikke begrænset til, AMPA, NMDA + glycin, KCl-depolarisering, og oxygen / glucosemangel).
- Fjern inkubationsopløsningen på forskellige tidspunkter efter stimulering (0, 30, 60, 90, 120 og 300 sek), og erstatte det med 300 pi iskold homogeniseringsbuffer (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM ethylenglycol tetraeddikesyre, 4 mM EDTA, 100 uM ammoniummolybdat, 5 mM natriumpyrophosphat, 25 mM natriumfluorid, 1 mM natriumorthovanadat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, komplet proteaseinhibitor cocktail).
- Homogenisere microslices på is, ved hjælp af et glas-Teflon Dounce Homogenizer(20 slag; 700 rpm).
- Opbevar homogenater ved -80 ° C, og forskellige signalmolekyler, død molekyler, osv. kan måles ved western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microslices genereres ved hjælp af denne procedure er levedygtige, og en række forskellige arter (for eksempel rotte, mus og kylling) kan anvendes til at fremstille microslices. Tre uafhængige foranstaltninger levedygtighed er blevet anvendt: respirationsfrekvens (figur 1), adeninnukleotid forhold (figur 2), væv indhold kalium (figur 3). Ved hjælp af disse foranstaltninger er det blevet påvist, at microslices forbliver levedygtige i mindst 2 timer efter generation.
Brain microslices kan anvendes til at undersøge forskellige signalmolekyler efter en mange forskellige stimuli (f.eks KCl depolarisering [Figur 4], AMPA, NMDA, glutamat stimulation 10), og kan også anvendes til at sammenligne reaktioner celle signalmolekyler mellem flere områder af hjernen (figur 4). Derudover kan effekten af forskellige inhibitorer / narkotika behandlinger på disse molekyler også undersøges (såsom kinase inhibitorer 10, glutamatreceptoragonister 11, quisqualic syre 12).
Figur 1. Respirationsfrekvenser af microslices fra kylling forebrain respiration satser for hjernevæv blev beregnet som følger:. Mængden af ilt, der forbruges (forskellen mellem ilt elektrode aflæsninger ved begyndelsen og slutningen af eksperimentet) multipliceret med antallet af mol af ilt i opløsning, delt af inkubationstiden (timer), og mængden af protein (mg). Typiske respirationsfrekvenser af isolerede pattedyr hjernebarken er mellem 55-80 pmol O 2 / g frisk vægt / hr under almindelige betingelser 9. n = 9.
p_upload/51291/51291fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
.. Figur 2. Tilstedeværelse af adeninnukleotider i microslices fra kylling forhjerne Repræsentant HPLC spor måling ATP: ADP nøgletal, der udføres som tidligere beskrevet 13. Høj ATP og lavt ADP niveauer er normalt findes i levedygtige celler, mens nedsat niveau af ATP og forhøjede niveauer af ADP er karakteristisk for apoptotiske og nekrotiske celler 14. Typisk ATP: ADP nøgletal microslices varierede fra 3:01 til 6:01, og blev fastholdt på disse niveauer i mere end 2 timer.
Figur 3. Tissue K + indhold i hjernen microslices fra umodne kylling forebrain. Bestemmelsen af væv kalium er et oseful mål for bæredygtighed, da mange af de kemiske og fysiologiske aktiviteter af et væv er afhængig membran potentiale, som kræver en normal intracellulær kalium indhold 9. Når microslices blev vasket i K +-fri buffer umiddelbart efter hakke, blev vævet K + forarmet til niveauer, som var lige over baggrunden (tid 0). Men på efterfølgende inkubation med Krebs buffer, de microslices hurtigt akkumuleret K + fra det omgivende medium, og inden for 5 min, de havde nået et steady state niveau svarende til det for ubehandlet microslices (dvs. microslices vasket og inkuberet i normal buffer). Tilføjelsen af ouabain (0,2 mM) og EGTA (2 mM) efter 20 min inkubation forårsagede væv K + indhold at falde til 0 indenfor 8 min. Dette viser, at microslices normalt aktivt pumpe K +, og at væv K +-niveauer skyldes ikke K + fanget i dødt væv eller interstitielle rum. n = 4.
Figur 4.. Tidsforløb for GluN2B og GluA1 phosphorylering efter depolarisering med KCI. Microslices blev genereret fra striatum og sensorisk cortex hos hanrotter (n = 8), depolariseres ved hjælp af høj K + Krebs puffer, homogeniseret og undersøgt for (A) GluN2B phosphorylering (ved Ser1303) og (B) GluA1 phosphorylering (ved Ser845) ved western-blotting på forskellige tidspunkter efter stimulering (0-300 sek). Phosphorylering niveauer er normaliseret til total GluN2B og GluA1 udtryk (dvs. phosphorylering / samlet udtryk). * Angiver statistisk signifikans mellem hjerneregioner (p <0,05). Depolarisering med KCI resulterede i phosphorylering af GluN2B og GluA1 receptorer på S1303 ogS845, hhv. Satsen for GluN2B fosforylering på S1303 varierede mellem cortex og striatum, mens satsen for GluA1 fosforylering på S845 var den samme i cortex og striatum. I efterfølgende eksperimenter, har vi vist, at dette skyldes differentieret regulering af multifunktionelle kinase, calcium / calmodulin-stimuleret protein kinase II (CaMKII), som phosphorylerer GluN2B på S1303, men ikke GluA1 på S845 10. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri er en in vitro-teknik til generering af microslices, der kan bruges til at undersøge de molekylære mekanismer involveret i excitotoxicity og iskæmi-medieret celledød i intakt modne hjernevæv beskrevet. Denne teknik frembringer levedygtige væv (fig. 1-3), der er metabolisk ligner større organotypiske skiver 15. Desuden er denne microslice model nøje svarer til den respons efter excitotoxicity medieret hjerneskader in vivo 10. En 90 sekunder in vitro stimulus af hjerne microslices med AMPA, NMDA eller glutamat inducerer de samme svar i en række forskellige molekyler (f.eks CaMKII, GluN2B og GluA1) som en 90 sekunders periode med okklusion in vivo 10. Dette tilvejebringer yderligere bekræftelse på, at microslice model beskrevet heri er en gyldig metode, der kan anvendes til at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i iskæmi og excitotoksiskity-medieret celledød.
Som med enhver eksperimentel teknik, kan denne procedure varieres, og disse variationer kan eller ikke kan påvirke eksperimentel resultat. Baseret på erfaring, protokollen beskrevet heri repræsenterer de optimale betingelser for at skabe den højeste væv udbytte og microslice levedygtighed. Denne protokol kan tilpasses til anvendelse i en række forskellige arter (microslices fra rotter, mus og høns har tidligere blevet frembragt), og fra en hvilken som helst område af hjernen (figur 1-3 viser microslices afledt fra hele forhjerne, figur 4 viser microslices afledt fra cortex og striatum). Derudover kan microslice tykkelse ændres fra 150 til 350 um, uden væsentlig tab af levedygtighed skiver. Den optimale skive tykkelse er 250 um, da dette giver det højeste udbytte af væv, og mere reproducerbar prøveudtagning end for større skiver. Den statistiske prøvetagning af hjernevæv produceret afDe portioner af microslices skal være repræsentativ for det væv, hvorfra skiverne blev fremstillet. For at gøre dette, er vi nødt til at bruge de mindste mellemstore skiver pr portion for at sikre en repræsentativ prøveudtagning af vævet. De optimale betingelser for dette viste sig at være 250 um tykkelse og 1 mg vævsprotein, hvilket svarer til ~ 15-20 skiver / portion. Den temperatur, ved hvilken microslices skal kløves og vaskes blev undersøgt ved at sammenligne respiration satser microslices genereret med og uden køling til 4 ° C. Selv om virkningerne af acidose og iltmangel kan reduceres når væv anbringes ved 4 ° C, kan mikrotubulus samling ændres, hvis væv er kølet og derefter rewarmed 16. Denne reorganisering af cytoskelettet kan påvirke den funktionelle aktivitet af celler i en periode efter opvarmning. Noncooled microslices har en højere rentabilitet og respirationsfrekvens i forhold til afkølede skiver. Desuden tre vaske (trin 3.1-3.3), er tilstræktilstrækkelig til at fjerne det meste af vragrester. Ækvilibreringsperioden (trin 3.4) med periodiske ændringer i buffer tillader microslices at "komme sig" fra hakke, og forbedrer reproducerbarhed i forskellige funktionelle assays (såsom calcium ophobning).
Metoden er velegnet til at undersøge virkningerne efter en række stimuli, og efter behandling med medicin / hæmmere. Ethvert lægemiddel / inhibitor, der er membranpermeabel har potentialet til at blive undersøgt ved hjælp af denne teknik, og helst molekyle, der kan detekteres via Western blot (eller lignende) kan undersøges.
Sammenfattende manipulation af signalering kaskader involveret i excitotoksicitet og iskæmi-medieret celledød tilbyder en attraktiv tilgang til udviklingen af lægemidler, der begrænser nervecelledød efter slagtilfælde. Den beskrevne microslice metode er en let anvendelig model, der tillader undersøgelse af disse signaleringskaskader i intakt modne hjernevæv. Denne teknik kan anvendes til at hjælpe med at identificere nye behandlinger, der begrænser nervecelledød efter slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt om nogen af det arbejde, der udføres inden for dette manuskript.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsmidler fra Sundhed og Medical Research Council National Australien, Hunter Medical Research Institute og University of Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
