Summary
We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.
Abstract
Onderzoeken moleculaire mechanismen betrokken bij neuropathologische aandoeningen, zoals ischemische beroerte, kan moeilijk zijn wanneer gebruik geheel dierlijke systemen. Als zodanig, primaire of 'neuronale-achtige' celkweek systemen vaak worden gebruikt. Hoewel deze systemen relatief eenvoudig om mee te werken en bruikbaar modelsystemen waarin verschillende functionele resultaten (bijvoorbeeld celdood) gemakkelijk kan worden gekwantificeerd, de onderzochte resultaten en routes in gekweekte onrijpe neuronen (bijvoorbeeld excitotoxiciteit-gemedieerde celdood routes) zijn niet noodzakelijkerwijs dezelfde als die waargenomen in volwassen hersenen, of in intact weefsel. Daarom is er de behoefte om modellen waarin cellulaire mechanismen volwassen neuraal weefsel kan worden onderzocht ontwikkelen. Wij hebben een in vitro techniek die kan worden gebruikt om een verscheidenheid van moleculaire pathways in intacte zenuwweefsel onderzoeken ontwikkeld. De hierin beschreven techniek maakt gebruik van rat corticale weefsels, maar deze techniek kan worden aangepast om weefsel te gebruikenuit diverse soorten (zoals muis, konijn, cavia en kip) of hersenen (bijvoorbeeld, hippocampus, striatum, enz.). Bovendien, een grote stimulaties / behandelingen worden gebruikt (bijvoorbeeld excitotoxische toediening van remmers, enz.). Concluderend kan de hersenen slicemodel hierin beschreven worden gebruikt om een verscheidenheid van moleculaire mechanismen-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken.
Introduction
De meest voorkomende vorm van een beroerte is ischemische beroerte, die optreedt wanneer een cerebraal bloedvat wordt afgesloten. Het weefsel ischemie die het gevolg is van stopzetting van de bloedstroom veroorzaakt wijdverspreide depolarisatie van membranen, afgifte van neurotransmitters prikkelende en aanhoudende verhoging van intracellulair calcium, hetgeen leidt tot de activatie van celdood pathways 1. Dit proces wordt genoemd "excitotoxiciteit 'en een gemeenschappelijke route betrokken bij neuronale dood door een verscheidenheid van ziekten, waaronder beroerte 2. Remming van de signaalwegen betrokken bij excitotoxiciteit en andere neuronale celdood cascades is een aantrekkelijke benadering van neuronale schade na een beroerte te beperken.
Het identificeren van de precieze moleculaire mechanismen betrokken bij excitotoxiciteit en ischemische beroerte kan moeilijk zijn bij het gebruik van hele dieren systemen. Als zodanig primaire embryonale en 'neuronale-achtige' (bv. neuroblastoma en adenocarcinoom onsterfelijk lijnen) celkweek systemen worden vaak gebruikt. De belangrijkste voordelen van deze modellen zijn dat ze gemakkelijk te manipuleren, relatief kosteneffectief en celdood kan gemakkelijk worden gemeten en gekwantificeerd. Echter, signaalwegen worden gewijzigd door de kweekomstandigheden gebruikte 3,4, en onvolwassen neuronen en vereeuwigd lijnen kunnen verschillende receptoren en signaalmoleculen, in vergelijking met de hersenen 5-8 rijpen. Bovendien gekweekte neuronen alleen wordt het onderzoek van een celtype (of twee, als een gemengde cultuursysteem gebruikt), terwijl intact hersenweefsel is heterogeen, met een verscheidenheid aan celtypen die met elkaar. Organotypische slice kweeksystemen (dunne explantaten van hersenweefsel) worden ook gebruikt en deze modellen kan de studie van heterogene populaties van cellen die worden aangetroffen in vivo. Echter, slechts een beperkte hoeveelheid weefsel Van elk dier bij gebruik van deze techniek kan plakkenniet gekweekt zolang geïmmortaliseerde cellijnen en middellange tot lange termijn kweek kan leiden tot veranderingen in signaalwegen en receptoren in de segmenten. Hoewel volwassen hersenen worden gebruikt organotypische plakjes genereren segmenten van onvolwassen hersenen ontvankelijker cultuur, en meer algemeen gebruikt. Er is dan ook de noodzaak om modellen die na te bootsen of te vertegenwoordigen intacte volwassen hersenen, die gemakkelijk te gebruiken zijn, waarin neuronale signaalwegen kan worden onderzocht ontwikkelen.
Hierin wordt een in vitro techniek die intacte zenuwstelsel die kunnen worden gebruikt om moleculaire mechanismen van celdood verhelderen na excitotoxische of ischemische insult beschreven. Deze techniek vermindert het aantal benodigde dieren een experiment uitgevoerd, reproduceerbaar en genereert levensvatbaar weefsel dat zich gedraagt op een metabolisch soortgelijke wijze grotere organotypische plakjes. Bovendien, de neuronale circuits, cellulaire interacties en postsynaptische compartment blijft deels intact. De fysiologische buffer gebruikt kan de celmembranen 'reseal' en stelt cellen hun oorspronkelijke membraanweerstand 9 herstellen. Deze brain slice model kan getrouw nabootsen responsen waargenomen na gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel 10, en kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen betrokken bij beroerte te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures worden uitgevoerd met instemming van de Universiteit van Newcastle Animal Care en ethische commissie, alsmede in overeenstemming met de relevante richtlijnen en regelgeving, waaronder de NSW Animal Research Act, de NSW Animal Research verordening, en de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden.
1. Dissectie van hersenweefsel
- Sacrifice twaalf weken oude mannelijke ratten door onthoofding. Ratten kunnen ofwel worden opgeofferd door prachtige en onthoofding, of kan eerst worden verdoofd met isofluraan (5% inductie, 1,5-2% onderhoud) in 70% N2 en 30% O 2, en vervolgens onthoofd.
- Verwijder de hersenen uit de schedel zo snel mogelijk (idealiter, moet dit worden uitgevoerd in minder dan 2 minuten).
- Verwijder de cortex door de vrije hand dissectie. De dissectie moeten worden uitgevoerd in de minimale tijd mogelijk, met zo weinig schade aan de hersenen mogelijk om maintain de integriteit van de segmenten.
- Om eventuele resterende huid te verwijderen, bont, bloed, enz., dompel de hersenen in een kleine hoeveelheid (3-5 ml) van 37 ° C Krebs buffer (118 mM natriumchloride, 4,7 mM kaliumchloride, 1,3 mM calciumchloride, 1,2 mM kaliumdiwaterstoffosfaat, 1,2 mM magnesiumsulfaat, 25 mM natriumwaterstofcarbonaat, 11,7 mM glucose, 0,03 mM dinatrium-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), in evenwicht gebracht met 95% zuurstof / 5% kooldioxide (carbogen), pH 7,4).
2. Bereiding van Microslices
- Plaats de hersenen op het podium van een McIlwain chopper waarop twee segmenten filtreerpapier zijn geplaatst en bevochtigd met warm Krebs buffer. Houd de hersenen en filterpapier bevochtigd met warm Krebs buffer, maar niet zo nat dat er vrije vloeistof op het oppervlak van het papier kan de hersenen wegglijden.
- Snijd de hersenen in 250 micrometer coronale secties. Als voedingsstoffen, zuurstof en afvalstoffen thop zijn doorgaans uitgewisseld met de bloedtoevoer worden uitgewisseld met een vloeistof die het weefsel omgeeft in geïsoleerde neuraal weefsel, moet de omvang van de segmenten niet meer dan 400 pm dik zodat voldoende zuurstof en voedingsstoffen uitwisseling plaatsvinden.
- Draai de McIlwain fase 90 °.
- Snijd hersenen tot 250 micrometer sagittale plakjes. Hierin deze hersengebieden secties (250 urn x 250 urn plakjes variabele lengte, afhankelijk van de dikte van het weefsel) worden aangeduid als microslices.
- Plaats de microslices een ronde bodem buis met 10-15 ml 37 ° C Krebs buffer (de hoeveelheid Krebs buffer zal afhangen van de hoeveelheid weefsel).
3. Gelijkschakeling van de Microslices
- Schud voorzichtig totdat de individuele microslices worden opgeschort, en vervolgens laat ze bezinken onder zwaartekracht.
- Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof, die troebel vanwege opgeschort cel puin zal zijn, en voeg 10 ml vers 37 ° CKrebs buffer op de buis.
- Herhaal deze wasprocedure viermaal, wat zal resulteren in verwijdering van het meeste vuil.
- Vervolgens evenwicht de microslices bij 37 ° C onder zacht schudden / inversie, en wijzigt de Krebs buffer elke 15 min gedurende 1 uur in totaal.
- Op dit moment, voeg 2 ml vers 37 ° C Krebs buffer en overdracht 15-20 microslices (150 pl microslice suspensie) te platbodem polystyreen 5 ml buisjes met een wijde boring pipetpunt met afgevlakte randen (die kan worden gecreëerd door snijden ~ 2 mm van het uiteinde van een P1000 tip). Spreid de microslices gelijkmatig over de bodem van de buis in een enkele laag, zodat elke microslice niet verder dan enkele millimeters van het geoxygeneerde atmosfeer.
4. Excitotoxische Stimulatie
- Incubeer de microslices bij 37 ° C, en voortdurend langs carbogen over het oppervlak van de 150 ul microslice suspensie via een gasleiding die positieed net boven het oppervlak van de microslice suspensie (mechanische verstoring te vermijden).
- Behandel microslices met ofwel 150 pi 5 mM glutamaat + 100 uM glycine in Krebsbuffer (excitotoxische stimulus: eindconcentratie 2,5 mM glutamaat + 50 uM glycine) of 150 ul Krebsbuffer alleen (controle nonstimulated). Een verscheidenheid aan stimuli kan worden gebruikt in deze stap (waaronder, maar niet beperkt tot AMPA, NMDA + glycine, KCl depolarisatie en zuurstof / glucose ontbering).
- Verwijder de incubatieoplossing op verschillende tijdstippen na stimulatie (0, 30, 60, 90, 120 en 300 seconden) en vervangen door 300 ul ijskoude homogenisatiebuffer (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM ethyleenglycol azijnzuur, 4 mM EDTA, 100 uM ammoniummolybdaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 25 mM natriumfluoride, 1 mM natriumorthovanadaat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, volledige proteaseremmer cocktail).
- Homogeniseren microslices op ijs, met behulp van een glas-Teflon Dounce Homogenizer(20 slagen; 700 rpm).
- WINKEL homogenaten bij -80 ° C en verschillende signaalmoleculen, dood moleculen, etc. worden gemeten door Western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microslices gegenereerd deze procedure levensvatbaar en een aantal soorten (bijvoorbeeld rat, muis, kip en) kunnen worden gebruikt microslices produceren. Drie onafhankelijke maatregelen van de levensvatbaarheid zijn gebruikt: ademhalingsfrequentie (figuur 1), adenine nucleotide ratio's (figuur 2), en weefsel kaliumgehalte (figuur 3). Met deze maatregelen is aangetoond dat microslices blijven nog gedurende ten minste 2 uur na generatie.
Brain microslices kunnen worden gebruikt om verschillende signaalmoleculen onderzocht na diverse stimuli (bijv. KCl depolarisatie [Figuur 4] AMPA, NMDA, glutamaat stimulatie 10), en kan ook worden gebruikt om responsen van cellen signaalmoleculen tussen verschillende hersenengebieden vergelijken (Figuur 4). Bovendien kan het effect van verschillende remmers / drugbehandelingen van deze moleculen worden onderzocht (zoals kinase remmers 10, glutamaat receptor agonisten 11, quisqualic zuur 12).
Figuur 1. Ademhaling van microslices van kip voorhersenen De ademhaling van hersenweefsel werden als volgt berekend:. De hoeveelheid verbruikte zuurstof (verschil tussen de zuurstof elektrode waarden aan het begin en einde van het experiment) vermenigvuldigd met het aantal mol zuurstof in oplossing verdeeld de incubatietijd (uur) en de hoeveelheid eiwit (mg). Typische ademhaling van geïsoleerde zoogdieren hersenschors zijn tussen 55-80 umol O 2 / g verse wt / uur onder normale omstandigheden 9. n = 9.
p_upload/51291/51291fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
.. Figuur 2 Aanwezigheid van adenine nucleotiden microslices van kippen voorhersenen Representatieve HPLC spoor meten ATP: ADP, uitgevoerd zoals eerder beschreven 13. Hoge en lage ATP ADP niveaus zijn meestal te vinden in levensvatbare cellen, terwijl verlaagde niveaus van ATP en verhoogde niveaus van ADP zijn karakteristiek voor apoptotische en necrotische cellen 14. Typische ATP: ADP verhoudingen microslices varieerde 3:01-06:01 en werden op deze niveaus gedurende meer dan 2 uur.
Figuur 3. Tissue K + inhoud van de hersenen microslices van onrijpe kip voorhersenen. De bepaling van weefsel kalium is een onseful mate van levensvatbaarheid, zoals veel van de chemische en fysiologische activiteiten van een weefsel zijn afhankelijk van membraan potentieel, dat een normale intracellulaire kaliumgehalte 9 vereist. Wanneer microslices in K +-vrije buffer werden gewassen onmiddellijk na het hakken, werd weefsel K + verarmd tot niveaus die net boven de achtergrond (tijd 0) waren. Echter, daaropvolgende incubatie met Krebs buffer, de microslices snel geaccumuleerd K + uit het omringende medium, en binnen 5 minuten in die steady state niveau vergelijkbaar met dat van onbehandelde microslices (dwz microslices gewassen en geïncubeerd in normale buffer) had bereikt. De toevoeging van ouabaïne (0,2 mM) en EGTA (2 mM) na 20 minuten incubatie veroorzaakt weefsel K + inhoud afnemen tot 0 binnen 8 minuten. Dit toont aan dat de microslices normaal actief pomp K +, en dat het weefsel K + niveaus zijn niet te wijten aan K + gevangen in dood weefsel of interstitiële ruimten. n = 4.
Figuur 4. Tijdsverloop van GluN2B en GluA1 fosforylering na depolarisatie KCl. Microslices werden gegenereerd uit het striatum en sensorische cortex van mannelijke ratten (n = 8), gedepolariseerd met hoge K + Krebs buffer gehomogeniseerd en onderzocht (A) GluN2B fosforylering (at Ser1303) en (B) GluA1 fosforylering (at Ser845) door Western blotting op verschillende tijdstippen na stimulatie (0-300 sec). Fosforylering niveaus zijn genormaliseerd om de totale GluN2B en GluA1 expressie (dwz fosforylering / totaal expressie). * Geeft statistische significantie tussen hersengebieden (p <0,05). Depolarisatie met KCl resulteerde in fosforylering van GluN2B en GluA1 receptoren op S1303 enS845, respectievelijk. Het tarief van GluN2B fosforylering bij S1303 varieerde tussen cortex en striatum, terwijl de snelheid van GluA1 fosforylering bij S845 was hetzelfde in de cortex en het striatum. In verdere experimenten, hebben we aangetoond dat dit te wijten is aan regulering van de multifunctionele kinase differentiële, calcium / calmodulin-gestimuleerde proteïne kinase II (CaMKII), die GluN2B fosforyleert op S1303, maar niet GluA1 bij S845 10. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin wordt een in vitro methode voor het genereren van microslices die kunnen worden gebruikt om de moleculaire mechanismen betrokken bij excitotoxiciteit en ischemie-gemedieerde celdood in intacte volwassen hersenweefsel onderzoeken beschreven. Deze techniek produceert levensvatbaar weefsel (figuren 1-3), dat is metabolisch vergelijkbaar met grotere organotypische plakjes 15. Bovendien is dit model microslice nauw overeenkomt met de respons waargenomen na excitotoxicity gemedieerde hersenletsel in vivo 10. Een 90 tweede in vitro stimuleren van de hersenen microslices met AMPA, NMDA of glutamaat induceert dezelfde reacties in een verscheidenheid van moleculen (bv. CaMKII, GluN2B en GluA1) als een 90 tweede periode van occlusie in vivo 10. Dit is een bevestiging dat de microslice model hierin beschreven is een valide methode die gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij ischemie en excitotoxische onderzoekenheid gemedieerde celdood.
Zoals bij elke experimentele techniek kan deze procedure worden gevarieerd, en deze variaties kunnen al dan niet van invloed experimenteel resultaat. Gebaseerd op ervaring, het protocol hierin beschreven staat voor de optimale omstandigheden voor het genereren van de hoogste weefsel opbrengst en microslice levensvatbaarheid. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik in een verscheidenheid van soorten (microslices van ratten, muizen, kippen en eerder succes gegenereerd), en van alle hersenregio (Figuren 1-3 tonen microslices afkomstig van hele voorhersenen, Figuur 4 toont microslices afgeleide van cortex en striatum). Bovendien kan de dikte worden aangepast microslice 150-350 urn, zonder noemenswaardig levensvatbaarheid van de segmenten. De optimale slice dikte 250 urn, aangezien dit tot de hoogste opbrengst van weefsel, en meer reproduceerbare monsters dan voor grotere segmenten. De statistische bemonstering van hersenweefsel doorde fracties van microslices moet representatief zijn voor het weefsel waaruit de plakjes werden voorbereid zijn. Om dit te doen, moeten we het kleinste formaat plakjes per portie gebruiken om een representatieve steekproef van het weefsel zorgen. De optimale condities voor deze bleken 250 urn dikte en 1 mg weefsel eiwit, waarvan ~ 15-20 segmenten / hoeveelheid overeenkomt. De temperatuur waarbij microslices worden gesneden en gewassen werd onderzocht door vergelijking van de ademhaling van microslices gemaakt met en zonder koelen tot 4 ° C. Hoewel de effecten van acidose en anoxie kunnen worden verminderd wanneer het weefsel wordt geplaatst bij 4 ° C, kan microtubuli montage worden gewijzigd wanneer weefsel gekoeld en vervolgens opgewarmd 16. Deze reorganisatie van het cytoskelet kan de functionele activiteit van cellen voor een bepaalde periode van kracht na het opwarmen. Noncooled microslices een hogere levensvatbaarheid en ademhalingsfrequentie vergeleken met gekoelde segmenten. Verder drie wasbeurten (stappen 3,1-3,3) zijn voldoendedoende de meeste vuil te verwijderen. De equilibratieperiode (stap 3.4) met periodieke veranderingen in buffer maakt het microslices te 'herstellen' van het hakken, en verbetert de reproduceerbaarheid in verschillende functionele assays (zoals calcium accumulatie).
De methode is geschikt om de effecten na diverse stimuli onderzocht en na behandeling met geneesmiddelen / inhibitoren. Elk geneesmiddel / remmer die permeabel membraan heeft het potentieel via deze techniek, en elk molecuul dat via Western blot (of dergelijke) kan worden opgespoord kunnen onderzocht worden onderzocht.
Samengevat, de manipulatie van signalerende cascades betrokken bij excitotoxiciteit en ischemie gemedieerde celdood een aantrekkelijke benadering voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die neuronale celdood na beroerte beperken. De beschreven microslice methode is een eenvoudig toepasbaar model dat het onderzoek van deze signaleringscascades in intacte volwassen hersenen mogelijk maaktweefsel. Deze techniek kan worden gebruikt bij het identificeren van nieuwe behandelingen die neuronale celdood na beroerte beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict met betrekking tot een van de werkzaamheden binnen dit manuscript.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de middelen voor onderzoek van de National Health and Medical Research Council of Australia, de Hunter Medical Research Institute en de Universiteit van Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
