Summary
Hemos desarrollado un modelo de cortes de cerebro que se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada. Esta técnica genera tejido cerebral madura viable y reduce el número de animales necesarios para la experimentación, mientras que mantiene los circuitos neuronales, las interacciones celulares y compartimentos postsinápticos parcialmente intacta.
Abstract
El examen de los mecanismos moleculares implicados en condiciones neuropatológicos, tales como accidente cerebrovascular isquémico, puede ser difícil cuando se utilizan sistemas de animales enteros. Como sistemas de cultivo neuronal '-como' células tales, primaria o se utilizan comúnmente. Si bien estos sistemas son relativamente fáciles de trabajar con, y son sistemas modelo útil en el que diversos resultados funcionales (tales como la muerte celular) pueden cuantificarse fácilmente, los resultados examinados y vías en neuronas inmaduras cultivadas (tales como vías de la muerte celular mediada por excitotoxicidad-) no son necesariamente los mismos que los observados en el cerebro maduro, o en el tejido intacto. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar modelos en los que los mecanismos celulares en el tejido neural madura puede ser examinado. Hemos desarrollado una técnica in vitro que se puede utilizar para investigar una variedad de vías moleculares en el tejido nervioso intacto. La técnica descrita en este documento utiliza tejido cortical de rata, pero esta técnica se puede adaptar para utilizar el tejidoa partir de una variedad de especies (tales como ratón, conejo, conejillo de indias, y pollo) o regiones del cerebro (por ejemplo, hipocampo, cuerpo estriado, etc.) Además, una variedad de estímulos / tratamientos se puede utilizar (por ejemplo, excitotoxicidad, la administración de inhibidores, etc). En conclusión, el modelo de cortes de cerebro se describe en el presente documento puede usarse para examinar una variedad de mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada.
Introduction
La forma más común de accidente cerebrovascular es el accidente cerebrovascular isquémico, que se produce cuando un vaso sanguíneo cerebral se ocluye. La isquemia tisular que resulta de la cesación del flujo de sangre causa la despolarización de las membranas generalizada, liberación de neurotransmisores excitadores, y la elevación sostenida de calcio intracelular, lo que conduce a la activación de la muerte celular pathways 1. Este proceso ha sido denominado 'excitotoxicidad', y es una vía común implicado en la muerte neuronal producida por una variedad de patologías, incluyendo accidente cerebrovascular 2. La inhibición de las vías de señalización implicadas en la excitotoxicidad y otras cascadas de muerte celular neuronal es un enfoque atractivo para limitar el daño neuronal después de un accidente cerebrovascular.
La identificación de los mecanismos moleculares exactos involucrados en la excitotoxicidad y el ictus isquémico puede ser difícil cuando se utilizan sistemas de animales enteros. Como tal, embrionaria primaria y 'tipo neuronal "(por ejemplo neuroblastoma y de adenocarcinoma de líneas inmortalizadas) se utilizan a menudo sistemas de cultivo celular. Las principales ventajas de estos modelos es que son fáciles de manipular, relativamente rentable, y la muerte celular se pueden medir fácilmente y se cuantificaron. Sin embargo, las vías de señalización pueden ser alterados por las condiciones de cultivo utilizadas 3,4, y las neuronas inmaduras y líneas inmortalizadas pueden expresar diferentes receptores y moléculas de señalización en comparación con madurar cerebro 5-8. Además, las neuronas cultivadas sólo permiten el examen de un tipo de célula (o dos, si se utiliza un sistema de cocultivo), mientras que el tejido cerebral intacta es heterogéneo, que contiene una variedad de tipos de células que interactúan entre sí. También se utilizan sistemas de cultivo de cortes organotípicos (explantes delgadas de tejido cerebral), y estos modelos permiten el estudio de poblaciones heterogéneas de células como se encuentran in vivo. Sin embargo, sólo una cantidad limitada de tejido se puede obtener de cada animal cuando se utiliza esta técnica, las rebanadas puedeNo se cultivaron durante tanto tiempo como líneas celulares inmortalizadas, y medio para el cultivo a largo plazo puede dar lugar a alteraciones en las vías de señalización y los receptores en las rebanadas. Mientras que el cerebro madura puede ser utilizado para generar rebanadas organotípicos, rodajas de cerebro inmaduro son más susceptibles a la cultura, y son más comúnmente utilizados. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar modelos que imitan o representan cerebro maduro intacto, que son fáciles de usar, en la que las vías de señalización neuronales pueden ser examinados.
En la presente memoria, se describe una técnica in vitro que implica tejido nervioso intacto que se puede utilizar para elucidar los mecanismos moleculares implicados en la muerte celular después de un insulto excitotóxica o isquémica. Esta técnica reduce el número de animales necesarios para llevar a cabo un experimento, es reproducible, y genera tejido viable que se comporta de una manera similar a metabólicamente rebanadas organotípicos más grandes. Además, la circuitería neuronal, las interacciones celulares, y co postsinápticampartment permanece parcialmente intacta. El tampón fisiológico utilizado permite que las membranas celulares para 'resellado ", y permite que las células recuperan su resistencia de la membrana 9 original. Este modelo de cortes de cerebro es capaz de imitar fielmente respuestas observadas después de la excitotoxicidad mediada por lesiones cerebrales 10, y se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en el accidente cerebrovascular.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de la Universidad de Newcastle Cuidado de Animales y el Comité de Ética, así como de conformidad con las directrices y normas pertinentes, entre ellas la Ley de NSW Investigación Animal, Animal Reglamento Investigación NSW, y el Código Australiano de Prácticas para la cuidado y uso de animales con fines científicos.
1. La disección del tejido cerebral
- Sacrificio doce semanas de edad ratas macho por decapitación. Las ratas pueden o bien ser sacrificados por el aturdimiento y la decapitación, o pueden ser primero anestesiados con isoflurano (5% de la inducción, mantenimiento 1,5-2%) en el 70% de N2 y 30% de O 2, y luego decapitados.
- Retire el cerebro contra el cráneo lo más rápidamente posible (idealmente, esto debería llevarse a cabo en menos de 2 minutos).
- Retirar la corteza por la disección a mano alzada. La disección se debe realizar en el menor tiempo posible, con el menor daño al cerebro como sea posible a fin de maintain la integridad de las rebanadas.
- Con el fin de eliminar cualquier residual de la piel, piel, sangre, etc, sumerja el cerebro en una pequeña cantidad (3-5 ml) de 37 ° C tampón de Krebs (118 mM de cloruro de sodio, cloruro de potasio 4,7 mM, cloruro de calcio 1,3 mM, 1,2 mM de potasio dihidrógeno fosfato, sulfato de magnesio 1,2 mM, carbonato de hidrógeno de sodio 25 mM, glucosa 11,7 mM, 0,03 mM de disodio de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), equilibrada con 95% de oxígeno / dióxido de carbono al 5% (carbógeno), pH 7,4).
2. Preparación de Microslices
- Coloque el cerebro en el escenario de un helicóptero McIlwain en el que se han colocado dos rebanadas de papel de filtro y humedecido con tampón de Krebs caliente. Mantener el cerebro y papel de filtro humedecido con tampón de Krebs caliente, pero no tan húmeda que hay líquido libre en la superficie del papel que puede causar que el cerebro se deslice alrededor.
- Cortar el cerebro en 250 micras secciones coronales. Como nutrientes, oxígeno y materiales de desecho ªen el que normalmente se intercambian con el suministro de sangre se intercambian con un fluido que rodea el tejido en el tejido neural aislado, el tamaño de las rodajas no debe ser más de 400 m de espesor para permitir la oxigenación adecuada de nutrientes y de cambio que se produzca.
- Gire la etapa McIlwain 90 °.
- Cortar cerebros en 250 micras sagital. En la presente memoria, estas secciones de cerebro (250 micras x 250 micras rebanadas de longitud variable en función del espesor del tejido) se conocen como microslices.
- Coloque los microslices en un tubo de fondo redondo con 10-15 ml de tampón C 37 ° de Krebs (la cantidad de tampón de Krebs utilizado dependerá de la cantidad de tejido).
3. La equilibración de Microslices
- Agitar suavemente hasta que se suspenden microslices individuales, y luego permitir que se asienten por gravedad.
- Retire con cuidado el sobrenadante, que será turbia debido a los desechos de células en suspensión, y añadir 10 ml fresco 37 ° CKrebs búfer al tubo.
- Repita este procedimiento de lavado cuatro veces, lo que se traducirá en la eliminación de la mayoría de los desechos.
- Después de esto, se equilibren las microslices a 37 ° C con agitación suave / inversión, y cambiar el tampón Krebs cada 15 minutos durante 1 hora en total.
- En este momento, añadir 2 ml de tampón de 37 ° C Krebs fresco, y transferir 15-20 microslices (150 l de suspensión MicroSlice) al poliestireno de fondo plano de tubos de 5 ml usando una punta de pipeta de calibre extra ancho con bordes suavizados (que pueden ser creados por de corte ~ 2 mm desde el extremo de una punta de P1000). Extender las microslices de manera uniforme sobre la base del tubo en una sola capa, de manera que cada MicroSlice no está a más de unos pocos milímetros de la atmósfera oxigenada.
4. La estimulación excitotóxica
- Incubar las microslices a 37 ° C, y pasar continuamente CARBOGEN sobre la superficie de la suspensión 150 l MicroSlice, utilizando una línea de gas que es la posicióned justo por encima de la superficie de la suspensión MicroSlice (para evitar la interrupción mecánica).
- Tratar microslices con ya sea el glutamato 150 l 5 mm + 100 mM de glicina en tampón de Krebs (estímulo excitotóxica: concentración final 2,5 mM de glutamato + 50 mM glicina) o 150 l de tampón de Krebs solo (control nonstimulated). Una variedad de estímulos se puede utilizar en este paso (incluyendo, pero no limitado a, AMPA, NMDA + glicina, KCl despolarización, y el oxígeno / glucosa privación).
- Eliminar la solución de incubación a varios tiempos después de la estimulación (0, 30, 60, 90, 120, y 300 seg), y reemplazarla con 300 l de helado de tampón de homogeneización (30 mM de Tris, pH 7,4, 1 mM de etileno glicol ácido tetraacético, EDTA 4 mM, 100 mM de molibdato de amonio, pirofosfato de sodio 5 mM, fluoruro de sodio 25 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa completo).
- Homogeneizar microslices en hielo, con un vaso de teflón Dounce Homogeneizador(20 golpes; 700 rpm).
- Homogeneizados Almacenar a -80 ° C, y varias moléculas de señalización, las moléculas de muerte, etc se pueden medir por Western blot.
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Representative Results
Microslices generados usando este procedimiento son viables, y una variedad de especies (por ejemplo, rata, ratón y pollo) se pueden utilizar para producir microslices. Se han utilizado tres medidas independientes de viabilidad: la tasa de respiración (Figura 1), los coeficientes de nucleótidos adenina (Figura 2), y contenido de potasio tisular (Figura 3). El uso de estas medidas, se ha demostrado que microslices permanecen viables durante al menos 2 horas después de la generación.
Microslices cerebrales pueden ser utilizados para examinar diversas moléculas de señalización, después de una variedad de estímulos (por ejemplo, despolarización de KCl [Figura 4], AMPA, NMDA, estimulación de glutamato 10), y puede también ser utilizado para comparar las respuestas de las moléculas de señalización celular entre múltiples regiones del cerebro (Figura 4). Además, el efecto de diversos tratamientos inhibidores / de drogas en estas moléculas también puede ser examinada (tales como quinasa inhibidores 10, agonistas de los receptores de glutamato, ácido 11 quisquálico 12).
Figura 1. Las tasas de respiración de microslices de cerebro anterior de pollo Las tasas de respiración de tejido cerebral se calcularon de la siguiente manera:. La cantidad de oxígeno consumido (diferencia entre las lecturas de electrodos de oxígeno al inicio y al final del experimento) multiplicado por los moles de oxígeno en solución, dividida por el tiempo de incubación (horas) y la cantidad de proteína (mg). Las tasas de respiración típicos de aislados de mamíferos corteza cerebral son entre 55-80 mmol O 2 / g de peso fresco / h en condiciones normales 9. n = 9.
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.. Figura 2 Presencia de nucleótidos de adenina en microslices de cerebro anterior de pollo Representante de HPLC de medición de ATP: ADP proporciones, realizadas anteriormente descritos 13. Alta ATP y los bajos niveles de ADP se encuentran generalmente en las células viables, mientras que los niveles de ATP y aumento de los niveles de ADP disminuyó son característicos de las células apoptóticas y necróticas 14. ATP típico: ratios de ADP de microslices variaron 03:01-06:01, y se mantuvieron a estos niveles durante más de 2 horas.
Figura 3. Tejido K + contenido de microslices cerebrales de cerebro anterior de pollo inmaduro. La determinación de los tejidos de potasio es un nosotroseful medida de la viabilidad, como muchos de la química y actividades fisiológicas de un tejido son dependientes de potencial de membrana, lo que requiere un contenido de potasio intracelular normal de 9. Cuando microslices se lavaron en tampón K + libre inmediatamente después de picar, el tejido K + se agotó a los niveles que estaban justo encima de fondo (tiempo 0). Sin embargo, en la posterior incubación con tampón de Krebs, los microslices K + desde el medio circundante acumulan rápidamente, y dentro de 5 min habían llegado a un nivel de estado estacionario similar a la de microslices no tratados (es decir, microslices lavaron y se incubaron en tampón normal). La adición de ouabaína (0,2 mM) y EGTA (2 mM) después de 20 min de incubación causada tejido de K + contenido de negarse a 0 dentro de 8 min. Esto demuestra que los microslices normalmente bombean activamente K +, y que los niveles de K + de tejidos no se deben a K + atrapado en el tejido muerto o espacios intersticiales. n = 4.
Figura 4. Curso temporal de GluN2B y Glu-A1 fosforilación siguiente despolarización con KCl. Microslices se genera a partir del cuerpo estriado y la corteza sensorial de ratas macho (n = 8), despolariza usando alta de K + de Krebs tampón, se homogeneizó, y se examina para (A) GluN2B fosforilación (a Ser1303) y (B) la fosforilación de Glu-A1 (en Ser845) por el Western Blot en diversos momentos después de la estimulación (0-300 sec). Niveles de fosforilación se normalizan a GluN2B total y expresión Glu-A1 (es decir, la fosforilación / expresión total). * Denota significación estadística entre las regiones del cerebro (p <0,05). La despolarización con KCl resultó en la fosforilación de receptores GluN2B y Glu-A1 en S1303 yS845, respectivamente. La tasa de GluN2B fosforilación en S1303 varió entre la corteza y el cuerpo estriado, mientras que la tasa de Glu-A1 fosforilación en S845 era la misma en la corteza y el cuerpo estriado. En experimentos posteriores, se ha demostrado que esto es debido a la diferencia de la regulación de la quinasa multifuncional, calcio / calmodulina estimulada por la proteína quinasa II (CaMKII), que fosforila GluN2B en S1303, pero no en Glu-A1 S845 10. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
En la presente memoria, se describe una técnica in vitro para la generación de microslices que se pueden utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la excitotoxicidad y muerte celular mediada por la isquemia en el tejido cerebral madura intacta. Esta técnica produce tejido viable (Figuras 1-3), que es metabólicamente similar a rebanadas organotípicos más grandes 15. Además, este modelo MicroSlice corresponde estrechamente a la respuesta observada después de la excitotoxicidad mediada por lesiones cerebrales in vivo 10. Un 90 segundos en estímulo vitro de microslices cerebrales con AMPA, NMDA, o glutamato induce las mismas respuestas en una variedad de moléculas (por ejemplo, CaMKII, GluN2B, y Glu-A1) como un segundo período de oclusión 90 in vivo 10. Esto proporciona una validación adicional de que el modelo MicroSlice se describe en el presente documento es un método válido que se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares implicados en la isquemia y excitotoxicidaddad mediada por la muerte celular.
Como con cualquier técnica experimental, este procedimiento se puede variar, y estas variaciones puede o no puede afectar el resultado experimental. Basado en la experiencia, el protocolo detallado en el presente documento representa las condiciones óptimas para la generación del mayor rendimiento de tejido y la viabilidad MicroSlice. Este protocolo puede ser adaptado para su uso en una variedad de especies (microslices de ratas, ratones y pollos han sido previamente generado correctamente), y de cualquier región del cerebro (Figuras 1-3 representan microslices derivados de toda cerebro anterior; Figura 4 representa microslices derivados de la corteza y el cuerpo estriado). Además, el espesor MicroSlice puede ser alterado desde 150 hasta 350 micras, sin ninguna pérdida apreciable de viabilidad de las rebanadas. El espesor óptimo rebanada es de 250 micras, ya que esto produce el rendimiento más alto de tejido, y el muestreo más reproducible que para rebanadas más grandes. El muestreo estadístico de tejido cerebral producida porlas alícuotas de microslices tiene que ser representativa del tejido a partir del cual se prepararon las rebanadas. Para ello, tenemos que utilizar las rodajas de menor tamaño por alícuota para asegurar una muestra representativa del tejido. Se encontró que las condiciones óptimas para que esto sea 250 espesor m, y 1 mg de proteína del tejido, lo que corresponde a ~ 15-20 / Corte de alícuota. La temperatura a la que microslices deben ser cortados y lavados se investigó mediante la comparación de las tasas de respiración de microslices generados con y sin refrigeración a 4 ° C. Aunque los efectos de la acidosis y la anoxia pueden reducirse cuando el tejido se coloca a 4 º C, el reensamblaje de microtúbulos puede ser alterada si el tejido es enfriado y luego recalentado 16. Esta reorganización del citoesqueleto puede afectar a la actividad funcional de las células para un cierto período después del calentamiento. Microslices Noncooled tienen una mayor viabilidad y la frecuencia respiratoria en comparación con las rebanadas refrigerados. Por otra parte, tres lavados (pasos 3.1 a 3.3) son suficiente para eliminar la mayor parte de los escombros. El período de equilibrio (paso 3,4) con cambios periódicos en tampón permite a los microslices 'recuperan' de cortar, y mejora la reproducibilidad en diversos ensayos funcionales (tales como la acumulación de calcio).
El método es adecuado para examinar los efectos siguientes una variedad de estímulos, y después del tratamiento con drogas / inhibidores. Cualquier fármaco / inhibidor que es membrana permeable tiene el potencial de ser examinado a través de esta técnica, y cualquier molécula que puede ser detectada a través de western blot (o similar) puede ser investigado.
En resumen, la manipulación de las cascadas de señalización implicadas en la excitotoxicidad y muerte celular mediada por la isquemia ofrecen un enfoque atractivo para el desarrollo de fármacos que limitan la muerte celular neuronal tras el accidente cerebrovascular. El método MicroSlice descrito es un modelo de fácil aplicación que permite la investigación de estas cascadas de señalización en el cerebro maduro intactotejido. Esta técnica se puede usar para ayudar a identificar nuevos tratamientos que limitan la muerte celular neuronal tras el accidente cerebrovascular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses con respecto a cualquiera de los trabajos realizados en este manuscrito.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación de la Salud y medicina Consejo de Investigación Nacional de Australia, el Instituto de Investigación Médica de Hunter, y la Universidad de Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
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