Summary
我々は、興奮毒性媒介性脳損傷に関与する分子メカニズムを調べるために使用できる脳切片モデルを開発した。この技術は、生存可能な成熟した脳組織を生成し、部分的に無傷の神経回路、細胞間相互作用、およびシナプス後区画を維持しながら、実験に必要な動物の数を減少させる。
Abstract
全動物系を使用した場合、虚血性脳卒中のような神経病理学的症状に関与する分子メカニズムを調べることは困難であることができる。このように、第一級または「神経様」細胞培養システムは、一般的に利用される。これらのシステムで動作することが比較的容易であり、（例えば、細胞死のような）種々の機能的転帰を容易に定量化することができる有用なモデル系（例えば、興奮毒性により媒介される細胞死経路のような）培養した未熟ニューロンにおける調べ結果および経路であるが、必然的に成熟した脳において観察されたものと同じ、または無傷組織に含まれていない。したがって、成熟した神経組織における細胞機構を調べることができるモデルを開発する必要がある。我々は、無傷の神経組織における分子経路の様々な調査するために使用することができるインビトロ技術を開発した。本明細書に記載された技術は、ラット皮質組織を利用するが、この技術は、組織を使用するように適合させることができるまたは脳領域（例えば、海馬、線条体など ）（例えば、マウス、ウサギ、モルモット、およびニワトリなど）様々な種から。さらに、刺激/治療の様々な（例えば、興奮毒性、阻害剤の投与等 ） を使用することができる。結論として、本明細書に記載の脳切片モデルは、興奮毒性媒介性脳損傷に関与する分子メカニズムの様々な調べるために使用することができる。
Introduction
脳卒中の最も一般的な形態は、脳血管が閉塞したときに発生なる虚血性脳卒中である。血流の停止に起因する組織虚血は、膜興奮性神経伝達物質の放出、細胞死経路1の活性化をもたらす細胞内カルシウムの持続的上昇、の広範な脱分極を引き起こす。このプロセスは、「興奮毒性」と呼ばれ、ストローク2など、病態の多様によって産生される神経細胞死に関与する一般的な経路であるされています。興奮毒性および他の神経細胞死カスケードに関与するシグナル伝達経路の阻害は、脳卒中後の神経損傷を制限するための魅力的なアプローチである。
全動物系を使用した場合興奮毒性および虚血性脳卒中に関与する正確な分子機構を同定することは困難であり得る。このような、一次胚および「ニューロン様」（ 例えば neuroblastoとしてミリアンペアおよび腺癌）は、細胞培養システムがしばしば使用される不死化。これらのモデルの主な利点は、比較的費用対効果の高い、それらは操作が容易であることと、細胞死が容易に測定および定量することができる。しかしながら、シグナル伝達経路、培養3,4使用される条件、および未成熟ニューロンによって変更され、行が異なる受容体を発現し、 成熟脳5-8と比較した場合にシグナル伝達分子ができ不死化することができる。 （共培養システムが使用される場合、または2つ）のインタクトな脳組織が互いに相互作用する様々な細胞型を含有する、不均一であるのに対し、さらに、培養されたニューロンは、一つの細胞型の検査を可能にする。器官型スライス培養系（脳組織の薄い外植片）もまた使用され、それらは、インビボで見出されるように、これらのモデルは、細胞の不均一な集団の研究を可能にする。この技術を使用しかし、組織の限られた量のスライスができ、各動物から得ることができる限り不死化細胞株として培養すること、および長期培養する培地は、スライスの経路と受容体のシグナル伝達における変化をもたらすことができるわけではありません。成熟した脳器官スライスを生成するために使用することができる一方で、未成熟脳からのスライスを培養により適しており、より一般的に利用される。ニューロンのシグナル伝達経路を検討することができる使いやすい無傷の成熟した脳を、模倣し又は表現するモデルを開発する必要性がある。
ここでは、興奮毒性または虚血性傷害後の細胞死に関与する分子メカニズムを解明するために使用することができる無傷の神経組織を含むインビトロ技術が記載されている。この技術は、実験を行うために必要な動物の数を減少させる再現性があり、より大きな器官型スライスに代謝的に同様の様式で挙動する生存可能な組織を生成する。さらに、神経回路、細胞間相互作用、およびシナプス後COmpartmentは、部分的にそのまま残ります。使用生理的バッファーは、「再シール」に、細胞膜を可能にし、元の膜抵抗9を回復するために、細胞を可能にします。この脳切片モデルを忠実に媒介される興奮毒性脳損傷10以下の観察された反応を模倣することができ、脳卒中に関与する分子メカニズムを調べるために使用できる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての手順は、NSW動物研究法、NSW動物研究の規制、およびのための実践オーストラリアコードを含む、関連するガイドラインと規則によれば、だけでなく、ニューカッスル大学動物実験倫理委員会から承認を得て実施しているお手入れと科学的目的のための動物の使用。
1。脳組織の解剖
- 断頭により12週齢の雄性ラットを生け贄に捧げる。ラットは魅力的で断頭により屠殺され得るか、最初の70％のN 2と30％O 2中イソフルラン（5％誘導1.5〜2％で維持）で麻酔し、次いで、断頭することができる。
- 可能な限り迅速に頭蓋骨から脳を削除（理想的には、これは2分未満で実行する必要があります）。
- フリーハンド切開によって皮質を除去します。舞するように、切開は、可能な限り少ない脳への損傷、可能な最小時間で実行されるべきであるスライスの整合性をntain。
- 任意の残留皮膚を除去するために、 等毛皮、血液、37℃のKrebs緩衝液（118 mM塩化ナトリウム、4.7mMの塩化カリウム、1.3mMの塩化カルシウムを少量の（3-5）中脳を浸す1.2mMのリン酸二水素カリウム、1.2mMの硫酸マグネシウム、25mMの炭酸水素ナトリウム、11.7 mMグルコース、95％酸素/ 5％二酸化炭素（カルボゲン）、pH7.4で平衡化した0.03 mMのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA））。
2。 Microslicesの調製
- 濾紙2スライスが配置され、暖かいクレブス緩衝液で湿らされた上でマッキルウェーンチョッパーのステージに脳を置きます。脳と暖かいクレブス緩衝液で湿らせた濾紙を維持しますが、そう濡れていない脳の周りにスライドさせる可能性があります紙の表面上のフリーの液体があった。
- 250μmの冠状切片に脳をスライス。栄養素、酸素、および第廃棄物として通常、血液供給と交換されるのは、孤立した神経組織内の組織を包囲する流体と交換され、スライスのサイズが適切な酸素と栄養交換が発生することができるように、厚さが400μm以下であってはならない。
- マッキルウェーン段階を90°回転。
- 250μmの矢状スライスに脳をスライス。本明細書では、これらの脳切片（組織の厚さに応じて可変長の250ミクロン×250ミクロンスライス）microslicesと呼ばれる。
- 10〜15ミリリットルを37℃クレブス緩衝液（使用クレブス緩衝液の量は組織の量に依存します）と丸底チューブにmicroslicesを配置します。
3。 Microslicesの平衡化
- 静かに、個々のmicroslicesが中断されるまで攪拌した後、彼らは重力下で沈降させる。
- 慎重に新鮮な37℃に起因する浮遊細胞破片に曇っされる、上清を除去し、10ミリリットルを追加クレブスは、チューブにバッファ。
- 破片の大半を除去することになるであろう、この洗浄操作を4回繰り返します。
- これに続いて、穏やかに振とう/反転に37℃でmicroslicesを平衡化し、合計で1時間ごとに15分を緩衝クレブスを変更してください。
- このとき、2ミリリットルの新鮮な37℃のKrebs緩衝液を追加し、平底ポリスチレン15〜20 microslices（microslice懸濁液150μl）を作成できる平滑化エッジ（エキストラワイドボアピペットチップを用いて5 mlチューブP1000チップの端から〜2ミリメートルカット）。各microsliceは含酸素雰囲気から数ミリメートルより一層ならないように、単層チューブの底に均等にmicroslicesを広げた。
4。興奮毒性刺激
- 37℃でmicroslicesをインキュベートし、継続的に位置されるガスラインを使用し、150μlのmicroslice懸濁液の表面にカーボゲン渡す（機械的破壊を避けるため）だけでmicroslice懸濁液の表面の上方編。
- 150μlの5 mMのグルタミン酸+100μMのクレブス緩衝液中のグリシン（興奮毒性刺激：最終濃度2.5 mMのグルタミン酸+50μMのグリシン）のいずれかでmicroslicesを治療または150（無刺激コントロール）を単独でクレブス緩衝液を含有した。種々の刺激は、このステップにおいて使用することができる（これらに限定されないが、AMPA、NMDA +グリシン、KClを脱分極し、酸素/グルコース枯渇）。
- 様々な時間刺激後（0、30、60、90、120、及び300秒）でインキュベーション溶液を除去し、氷冷均質化緩衝液（30mMのトリス、pH7.4、1mMのエチレングリコールを300μlと交換し四酢酸、4 mMのEDTA、100μMモリブデン酸アンモニウム、5mMのピロリン酸ナトリウム、25mMのフッ化ナトリウム、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、1mMのphenylmethanesulfonylfluoride、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）。
- ガラステフロンダウンスホモジナイザーを用いて、氷上でmicroslicesを均質（20ストローク、700回転）。
- ストア-80℃でホモジネート、 等の様々なシグナル伝達分子、細胞死の分子は、ウェスタンブロットによって測定することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この手順を使用して生成されたMicroslicesは、生存可能であり、種々の種（例えば、ラット、マウス、およびニワトリ）がmicroslicesを生成するために使用することができる。生存率の独立した三つの対策が利用されてきた：呼吸速度（ 図1）、アデニンヌクレオチド比（ 図2）、および組織カリウム含量（ 図3）。これらの対策を使用して、microslices少なくとも2時間後の生成のために生存し続けることが実証されている。
microslicesは、種々の刺激に続いて、種々のシグナル伝達分子を調べるために使用できる脳（ 例えば、KClを脱分極[ 図4]、AMPA、NMDA、グルタミン酸刺激10）と、複数の脳領域間のシグナル伝達分子、細胞の応答を比較するためにも使用することができる（ 図4）。さらに、これらの分子上の様々な阻害剤/薬物治療の効果も調べることができる（例えば、キナーゼなどインヒビター10、グルタメート受容体アゴニスト11、キスカル酸12）。
図1。ニワトリ前脳からmicroslicesの呼吸速度以下のように脳組織の呼吸速度を計算した：溶液中の酸素のモル数を乗じて消費される酸素量（実験の開始時と終了時の酸素電極読みの間の差）は、分割されたインキュベーション時間によって（時間）、タンパク質の量（mg）を得た。単離された哺乳動物の大脳皮質の代表的な呼吸速度は55〜80マイクロモルのO 2 / gの通常の条件の下で9新鮮重量/時間の間である。はn = 9。
p_upload/51291/51291fig2highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
図2鶏の前脳からmicroslicesアデニンヌクレオチドの存在のATPを測定する代表的なHPLCトレース：以前に13を説明したように実施し、ADP比。 ATPのレベルを減少し、ADPのレベルを増加させ、一方、高いATPおよびADPの低レベルは、通常、生細胞に見出されるアポトーシス細胞および壊死細胞14に特徴的である。典型的なATP：microslicesのADP比を3:1〜6:1の間で変化させて、より大きな2時間、これらのレベルで維持された。
図3。組織のK +未熟鶏の前脳から脳microslicesの内容。組織カリウムの決定は私たちですeful生存性の尺度、化学のような多くの組織の生理活性は、正常な細胞内のカリウム含有量9を必要とする膜電位に依存している。 microslicesがすぐに細断した後、K +のない緩衝液中で洗浄したところ、組織のK +が単にバックグラウンド（時間0）を上回っていたレベルに枯渇した。しかしながら、クレブス緩衝液とのその後のインキュベーションで、microslicesは急速に周囲の媒体からのK +を蓄積し、そして5分以内にそれらを未処理microslicesと同様の定常状態レベル（ すなわち microslicesを洗浄し、通常の緩衝液中でインキュベート）に達した。 20分間のインキュベーション後のウアバイン（0.2 mM）およびEGTA（2mM）を添加組織K +含有量は8分以内に0まで減少させる。これはmicroslicesは通常積極的にK +ポンプこと、および組織のK +濃度が死んだ組織または間質空間に閉じ込められたK +によるものではないことを実証。 n = 4である。
図4。のKClで脱分極次GluN2BとGluA1リン酸化の経時変化。Microslicesは線条体および雄ラットの感覚皮質から生成された（n = 8）に、均質化され、高K +クレブス緩衝液を使用して脱分極し、（A）を調べGluN2Bリン酸化（Ser1303で）様々な時間刺激後（0〜300秒）でウエスタンブロット法により、（B）GluA1リン酸化（Ser845で）。リン酸化レベルは、総GluN2BとGluA1式（ すなわち 、リン酸化/合計式）に正規化されている。 *脳領域に（p <0.05）との間の統計的有意性を示す。 KClを脱分極は、S1303でGluN2BとGluA1受容体のリン酸化をもたらし、それぞれS845、。 S845でGluA1のリン酸化の速度は皮質と線条体で同じであったのに対し、S1303でGluN2Bリン酸化の速度は、皮質と線条体の間で変化した。その後の実験では、我々は、これは多機能キナーゼの調節、S1303でGluN2Bをリン酸化カルシウム/カルモジュリン刺激性プロテインキナーゼII（CaMKIIの）ではなくS845 10でGluA1差動によるものであることを示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで、無傷の成熟した脳組織における興奮毒性及び虚血媒介性細胞死に関与する分子メカニズムを調べるために使用できるmicroslicesの生成のためのインビトロ技術が記載されている。この技術は、生存組織（ 図1-3）、すなわち、より大きな器官型スライス15に代謝的に類似しているが生成される。さらに、このmicrosliceモデルは密接に生体内 10 での興奮毒性媒介脳損傷後に観察される応答に対応。 AMPA、NMDA、またはグルタミン酸で脳microslicesのインビトロでの刺激での 90秒は、生体内 10 での閉塞の90秒周期などの分子（ 例えば CaMKIIの、GluN2B、およびGluA1）、様々で同じ応答を誘導する。これは、本明細書に記載microsliceモデルは、虚血、興奮毒性に関与する分子機構を調査するために使用することができる有効な方法であることをさらに検証を提供ITY媒介細胞死。
任意の実験手法と同様に、この手順を変えることができ、これらの変動は、または実験結果に影響してもしなくてもよい。経験に基づいて、本明細書に詳述プロトコルは、最高の組織microslice収率および生存率を生成するための最適な条件を表す。このプロトコルは、種（ラット、マウス、およびニワトリからmicroslicesが以前に正常に生成された）種々の使用に適合させることができ、任意の脳領域から（ 図1〜図3は、全前脳由来microslicesを示す、 図4は、派生microslicesを示す皮質および線条体から）。さらに、microslice厚がスライスの生存率の感知できる損失なしに、150〜350ミクロンで変化させることができる。これは、より大きなスライスよりも組織の最高収率、より再現性のあるサンプリングを生産するように、最適なスライス厚は、250μmである。によって製造脳組織の統計的サンプリングmicroslicesのアリコート切片を調製した組織の代表である必要がある。これを行うために、我々は、組織の代表的なサンプリングを確保するために、アリコートあたり最小サイズのスライスを使用する必要がある。この最適条件は、250μmの厚さ、および約15〜20スライス/アリコートに対応する組織タンパク質のmgの1であることが見出された。 microslicesはみじん切り、洗浄されるべきで、温度を用いて生成microslicesの呼吸速度を比較することで、4℃に冷却せずに調べた組織は4℃で置かれたときアシドーシスおよび無酸素の影響を低減することができるが、微小管の再構築は、組織が 冷却される場合に変更され、再加温し、次いで16することができる。細胞骨格のこの再編成は、温めてから一定期間細胞の機能活性に影響することがあります。非冷却microslicesを冷却スライスに比べて、より高い生存率および呼吸数を持っている。さらに、3回の洗浄（3.1〜3.3ステップ）が十分である破片の大部分を除去しcient。バッファ内の周期的変化と平衡期間（ステップ3.4）はmicroslicesがチョッピングから「回復」することを可能にし、（例えば、カルシウムの蓄積など）の様々な機能アッセイで再現性が向上します。
この方法は、様々な刺激、以下の効果を調べるのに適しており、薬/阻害剤で治療後。膜透過性であり、任意の薬物/阻害剤は、この技術を介して検査される可能性を有する、及びウェスタンブロット（または類似の） を介して検出することができる任意の分子を調べることができる。
要約すると、興奮毒性および虚血媒介性細胞死に関与するシグナル伝達カスケードの操作は、脳卒中後の神経細胞死を制限する薬の開発のための魅力的なアプローチを提供します。記載されmicroslice法はそのまま成熟脳におけるこれらのシグナル伝達カスケードの調査を可能に容易に適用できるモデルです組織。この技術は、脳卒中後の神経細胞死を制限する新しい治療法の同定を助けるために使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らがこの原稿内で行わ作品のいずれかについて、利害関係のないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会、ハンター医学研究所、およびニューカッスル大学からの研究資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
