Summary
Vi har utvecklat en hjärna skiva modell som kan användas för att undersöka molekylära mekanismer som är involverade i excitotoxicity-medierad hjärnskada. Denna teknik genererar livskraftig mogna hjärnvävnad och minskar antalet djur som krävs för experiment, samtidigt som den neuronala kretsar, cellulära interaktioner, och postsynaptiska fack delvis intakt.
Abstract
Undersöka molekylära mekanismer som är involverade i neuropatologiska tillstånd, såsom ischemisk stroke, kan vara svårt när man använder hela djursystem. Som sådan primär eller "neuronal-liknande" cellkultursystem är vanligen används. Även om dessa system är relativt lätt att arbeta med, och är användbara modellsystem där olika funktionella resultat (såsom celldöd) lätt kan kvantifieras, de undersökta utfall och vägar i odlade omogna nervceller (t.ex. excitotoxicity-medierad celldöd vägar) är inte nödvändigtvis de samma som de som observerats i mogna hjärnan, eller i intakt vävnad. Därför finns det behov av att utveckla modeller där cellulära mekanismer i mogen nervvävnad kan undersökas. Vi har utvecklat en in vitro-teknik som kan användas för att undersöka en rad olika molekylära vägar i vävnad intakt nervös. Den beskrivna tekniken utnyttjar häri råtta kortikal vävnad, men denna teknik kan anpassas för att använda vävnadfrån ett antal olika arter (t.ex. mus, kanin, marsvin och kyckling), eller områden i hjärnan (t.ex. hippocampus, striatum, etc.). Dessutom kan en mängd olika stimuli / behandlingar (t.ex. excitotoxiska, administrering av hämmare, etc.). Sammanfattningsvis kan hjärnan slice modell som beskrivs här användas för att undersöka en rad olika molekylära mekanismer som är involverade i excitotoxicity-medierad hjärnskada.
Introduction
Den vanligaste formen av stroke är ischemisk stroke, vilket sker när en cerebral blodkärl blir tilltäppt. Vävnaden ischemi som resulterar från upphörande av blodflöde orsakar utbredd depolarisation av membran, frisättning av excitatoriska neurotransmittorer och ihållande ökning av intracellulärt kalcium, vilket leder till aktivering av vägar med celldöd 1. Denna process har kallats "excitotoxicitet", och är en gemensam väg som deltar i neuronal död produceras av en mängd olika sjukdomar, inklusive stroke 2. Hämning av de signalvägar som är involverade i excitotoxicity och andra nervcellsdöd kaskader är en tilltalande strategi för att begränsa neuronal skada efter stroke.
Identifiera de exakta molekylära mekanismer som är inblandade i excitotoxicity och ischemisk stroke kan vara svårt när man använder hela djursystem. Som sådan primära embryonala och "neuronal-liknande" (t.ex. neuroblastoma och adenocarcinom odödliga rader) cellodlingssystem används ofta. De främsta fördelarna med dessa modeller är att de är lätta att manipulera, relativt kostnadseffektiv, och celldöd lätt kan mätas och kvantifieras. Däremot kan signalvägar ändras av de odlingsförhållanden som används 3,4, och omogna nervceller och förevigade linjer kan uttrycka olika receptorer och signalmolekyler jämfört med mogna hjärnan 5-8. Vidare endast odlade neuroner tillåta undersökning av en celltyp (eller två, om en coculture system används), medan intakt hjärnvävnad är heterogen, som innehåller en mängd olika celltyper som interagerar med varandra. Organotypiska skiva kultursystem (tunna Explantat av hjärnvävnad) används också, och dessa modeller kan studiet av heterogena populationer av celler eftersom de finns i vivo. Dock kan endast en begränsad mängd vävnad erhållas från varje djur vid användning av denna teknik, skivor kaninte odlas så länge som odödliga cellinjer, och på medellång till lång sikt kultur kan leda till förändringar i signalvägar och receptorer i skivorna. Även mogna hjärnan kan användas för att generera organotypic skivor, skivor från omogna hjärnan är mer mottaglig för kultur, och är mer vanligt utnyttjas. Det finns därför behov av att utveckla modeller som efterliknar eller representerar intakta mogna hjärnan, som är lätta att använda, där neuronala signalvägar kan undersökas.
Häri används en i tekniken vitro inbegriper vävnad intakt nervös som kan användas för att belysa molekylära mekanismer som är involverade i celldöd efter en excitotoxisk eller ischemisk insult beskrivas. Denna teknik minskar antalet djur som behövs för att utföra ett experiment, är reproducerbar och genererar livskraftig vävnad som beter sig på ett metaboliskt sätt liknande större organotypic skivor. Dessutom, den neuronala kretsar, cellulära interaktioner, och postsynaptiska compartment fortfarande delvis intakt. Den fysiologiska bufferten som används gör cellmembranen till "återförslutning" och gör att cellerna att återfå sin ursprungliga membranmotståndet 9. Denna hjärna skiva modell kan troget efterlikna reaktioner observerade efter excitotoxicitet medierad hjärnskador 10, och kan användas för att undersöka de molekylära mekanismer som är involverade i stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utförs med godkännande från universitetet i Newcastle Djurvård och etikkommittén, samt i enlighet med de riktlinjer och regler, inklusive NSW Animal Research Act, NSW Animal Research förordningen, och den australiska uppförandekod för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål.
1. Dissektion av hjärnvävnad
- Offer tolv veckor gamla hanråttor genom dekapitering. Råttor kan antingen offras av bedövning och halshuggning, eller kan först bedövas med isofluran (5% induktion, 1,5-2% underhåll) i 70% N2 och 30% O2, och sedan halshöggs.
- Ta bort hjärnan från skallen så snabbt som möjligt (helst detta bör utföras på mindre än 2 minuter).
- Ta cortex genom fri hand dissekering. Den dissektion bör utföras på minsta möjliga tid, med så lite skador på hjärnan som möjligt, så att maintain integriteten hos skivorna.
- I syfte att avlägsna eventuellt kvarvarande skinn, päls, blod, etc., fördjupa hjärnan i en liten mängd (3-5 ml) av 37 ° C Krebs-buffert (118 mM natriumklorid, 4,7 mM kaliumklorid, 1,3 mM kalciumklorid, 1,2 mM kaliumdivätefosfat, 1,2 mM magnesiumsulfat, 25 mM natriumvätekarbonat, 11,7 mM glukos, 0,03 mM dinatrium-etylendiamintetraättiksyra (EDTA), jämviktad med 95% syre / 5% koldioxid (carbogen), pH 7,4).
2. Framställning av Microslices
- Placera hjärnan på scenen av en McIlwain chopper på vilken två skivor av filterpapper har placerats och fuktats med varmt Krebs buffert. Håll hjärnan och filterpapper som fuktats med varm Krebs-buffert, men inte så våta att det finns fri vätska på ytan av det papper som kan orsaka hjärnan att glida runt.
- Skiva hjärnan i 250 ìm koronalt sektioner. Som näringsämnen, syre och avfallsmaterial thvid normalt utväxlas med blodtillförseln byts ut med en vätska, som omger den vävnad i isolerad neural vävnad, bör storleken av skivorna inte vara mer än 400 ^ m i tjocklek för att medge adekvat syresättning och näringsämne utbyte skall ske.
- Vrid McIlwain steget 90 °.
- Skiva hjärnor i 250 | im sagittal slice. Häri dessa hjärnsektioner (250 ^ m x 250 | im skivor av varierande längd beroende på tjockleken hos vävnaden) kallas microslices.
- Placera microslices i en rundbottnad rör med 10 till 15 ml 37 ° C Krebs-buffert (mängden Krebs-buffert som används kommer att bero på mängden av vävnad).
3. Jämviktsinställning Microslices
- Skaka försiktigt tills enskilda microslices är upphängda, och sedan låta dem bosätta sig i tyngdkraften.
- Ta försiktigt bort supernatanten, som kommer att vara grumlig på grund av suspenderade cellrester, och tillsätt 10 ml färsk 37 ° CKrebs-buffert till röret.
- Upprepa detta tvättförfarande fyra gånger, vilket kommer att resultera i avlägsnande av större delen av skräp.
- Efter detta, jämvikta de microslices vid 37 ° C med varsam skakning / inversion, och ändra Krebs buffert var 15 min i 1 h totalt.
- Vid denna tid, tillsätt 2 ml färsk 37 ° C Krebs buffert och överför 15-20 microslices (150 fil microslice fjädring) på plan botten polystyren 5 ml rör med hjälp av en extra bred borrning pipettspetsen med utjämnade kanter (som kan skapas genom skärning ~ 2 mm från slutet på en P1000 spets). Sprid microslices jämnt över basen av röret i ett enda skikt, så att varje microslice är inte längre än några få millimeter från syresatt atmosfär.
4. Excitotoxisk Stimulering
- Inkubera microslices vid 37 ° C, samt att kontinuerligt passera karbogen över ytan av det 150 ul microslice suspension, med användning av en gasledning som är lägesed precis ovanför ytan av microslice suspension (för att undvika mekanisk sönderdelning).
- Behandla microslices med antingen 150 pl 5 mM glutamat + 100 ^ M glycin i Krebs buffert (excitotoxisk stimulus: slutlig koncentration 2,5 mM glutamat + 50 ^ M glycin) eller 150 ^ Krebs buffert enbart (kontroll nonstimulated). Olika stimuli kan användas i detta steg (inklusive, men inte begränsat till, AMPA, NMDA + glycin, KCl depolarisering, och syre / glukosbrist).
- Avlägsna inkubationslösningen vid olika tidpunkter efter stimulering (0, 30, 60, 90, 120 och 300 sek), och ersätta det med 300 | il iskall homogeniseringsbuffert (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM etylenglykol tetraättiksyra, 4 mM EDTA, 100 ^ iM ammoniummolybdat, 5 mM natriumpyrofosfat, 25 mM natriumfluorid, 1 mM natriumortovanadat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, fullständig proteasinhibitorcocktail).
- Homogenisera microslices på is med användning av en glas-Teflon Dounce-homogenisator(20 slag, 700 rpm).
- Store homogenat vid -80 ° C och olika signalmolekyler, dödsmolekyler etc. kan mätas genom western blöt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microslices som genereras med hjälp av denna procedur är livskraftiga, och en mängd olika arter (t.ex. råtta, mus och kyckling) kan användas för att producera microslices. Tre oberoende mått på lönsamheten har utnyttjats: andningsfrekvens (figur 1), adenin nukleotid förhållanden (figur 2), och vävnadskaliuminnehåll (Figur 3). Med hjälp av dessa åtgärder har det visats att microslices förbli livsduglig under åtminstone 2 h efter generation.
Hjärn microslices kan användas för att undersöka olika signalmolekyler, efter en mängd olika stimuli (t.ex. KCl depolarisation [Bild 4], AMPA, NMDA, glutamat stimulering 10), och kan också användas för att jämföra svaren från cell signalmolekyler mellan flera områden i hjärnan (Figur 4). Dessutom kan även undersökt effekten av olika hämmare / läkemedelsbehandlingar på dessa molekyler (t.ex. kinas inhibitorer 10, glutamat receptoragonister 11, quisqualic syra 12).
Figur 1. Andningsfrekvens av microslices från hönshjärnan Den andningsfrekvens av hjärnvävnad har beräknats enligt följande:. Den mängd syre som förbrukas (skillnaden mellan syreelektrodavläsningarna i början och slutet av försöket) multiplicerat med antalet mol syre i lösning, uppdelade av inkubationstiden (timmar) och mängden protein (mg). Typiska andningsfrekvens av isolerade däggdjurs hjärnbarken är mellan 55-80 mikromol O2 / g färsk vikt / h under normala förhållanden 9. n = 9.
p_upload/51291/51291fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
.. Figur 2 Förekomst av adeninnukleotider i microslices från hönshjärnan Representant HPLC spår mäta ATP: ADP nyckeltal, som utförs som tidigare beskrivits 13. Hög ATP och låga ADP nivåer finns vanligen i levande celler, medan minskade nivåer av ATP och ökade nivåer av ADP är karakteristiska för apoptotiska och nekrotiska celler 14. Typisk ATP: ADP förhållanden av microslices varierade från 3:01 till 6:01, och låg kvar på dessa nivåer i mer än 2 timmar.
Figur 3. Vävnads K + innehåll av hjärn microslices från omogen kyckling framhjärnan. Bestämningen av vävnad kalium är ett osseful mått på lönsamheten, eftersom många av de kemiska och fysiologiska aktiviteter av en vävnad är beroende av membranpotential, vilket kräver en normal intracellulär kalium 9. När microslices tvättades i K +-buffert omedelbart efter hackades vävnaden K + utarmat till nivåer som var strax över bakgrunden (tid 0). Men den efterföljande inkubation med Krebs buffert, de microslices snabbt ackumulerade K + från det omgivande mediet, och inom 5 minuter hade de nått en steady state nivå liknande den för obehandlade microslices (dvs. microslices tvättas och inkuberas i normal buffert). Tillägget av ouabain (0,2 mM) och EGTA (2 mM) efter 20 min inkubation orsakade vävnads K + innehåll att sjunka till 0 inom 8 min. Detta visar att microslices normalt aktivt pump K +, och att vävnads K + nivåer beror inte på K + fångade i död vävnad eller mellanliggande utrymmen. n = 4.
Figur 4. Tidsförlopp för GluN2B och GluA1 fosforylering efter depolarisation med KCl. Microslices alstrades från striatum och sensoriska cortex hos hanråttor (n = 8), depolariserad använder hög K + Krebs-buffert, homogeniserades och undersöktes med avseende på (A) GluN2B fosforylering (vid Ser1303) och (B) GluA1 fosforylering (vid Ser845) genom western-blotting vid olika tidpunkter efter stimulering (0-300 sek). Fosforyleringsnivåer är normaliserat till totalt GluN2B och GluA1 uttryck (dvs. fosforylering / total uttryck). * Anger statistisk signifikans mellan hjärnregioner (P <0,05). Depolarisation med KCl gav fosforylering av GluN2B och GluA1 receptorer vid S1303 ochS845, respektive. Hastigheten för GluN2B fosforylering vid S1303 varierade mellan cortex och striatum, medan hastigheten för GluA1 fosforylering vid S845 var densamma i cortex och striatum. I senare experiment har vi visat att det är på grund av differentiell reglering av multifunktionella kinas, kalcium / calmodulin stimulerad proteinkinas II (CaMKII), som fosforylerar GluN2B på S1303, men inte GluA1 på S845 10. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri är en in vitro-metod för generering av microslices som kan användas för att undersöka de molekylära mekanismer som är involverade i excitotoxicitet och ischemi-förmedlad celldöd i intakta mogna hjärnvävnad beskrivits. Tekniken ger livsduglig vävnad (figurerna 1-3), som är metaboliskt liknar större organotypic skivor 15. Dessutom, detta microslice modell motsvarar nära svaret observerades efter excitotoxicitet medierad hjärnskador in vivo 10. En 90 andra in vitro stimulans av hjärn microslices med AMPA, NMDA eller glutamat inducerar samma svar i en rad olika molekyler (t.ex. CaMKII, GluN2B och GluA1) som en andra period 90 av ocklusion in vivo 10. Detta ger ytterligare bekräftelse på att den microslice modellen som beskrivs här är en giltig metod som kan användas för att undersöka de molekylära mekanismer som är inblandade i ischemi och excitotoxiskahet-förmedlad celldöd.
Som med alla experimentell teknik, kan detta förfarande varieras, och dessa variationer kan eller inte kan påverka försöksresultat. Baserat på erfarenheter, det protokoll som beskrivs häri representerar de optimala förutsättningarna för att generera den högsta vävnads avkastning och microslice livskraft. Detta protokoll kan anpassas för att användas i en mängd olika arter (microslices från råttor, möss och kycklingar har tidigare framgångsrikt genereras), och från varje hjärna region (figur 1-3 visar microslices härrör från hela framhjärnan, Figur 4 visar microslices härrör från cortex och striatum). Dessutom kan microslice tjockleken ändras från 150 till 350 | im, utan någon märkbar förlust i viabilitet av skivorna. Den optimala snittjocklek är 250 pm, eftersom det ger den högsta avkastningen av vävnad, och mer reproducerbar provtagning än för större skivor. Den statistiska provtagning av hjärnvävnad som produceras avalikvoter microslices behöver vara representativt för den vävnad från vilken skivorna framställdes. För att göra detta måste vi använda de minsta stora skivor per portion för att säkerställa en representativ provtagning av vävnaden. De optimala förutsättningar för detta befanns vara 250 um tjocklek, och 1 mg av vävnadsprotein, vilket motsvarar ~ 15-20 skivor / portion. Den temperatur vid vilken microslices ska klyvas och tvättades undersöktes genom att jämföra respirationshastigheter microslices alstrade med och utan kylning till 4 ° C. Även om effekterna av acidos och anoxi kan minskas när vävnaden placeras vid 4 ° C kan mikrotubulus återsammansättning ändras om vävnaden är kyld och sedan rewarmed 16. Denna omorganisation av cytoskelettet kan påverka den funktionella aktiviteten av celler för någon period efter värmning. Noncooled microslices har en högre lönsamhet och andningsfrekvens jämfört med kylda skivor. Dessutom tre tvättar (steg från 3,1 till 3,3) är tillräckligträckliga för att avlägsna det mesta av skräpet. Jämviktsperioden (steg 3.4) med periodiska förändringar i buffert tillåter microslices att "återhämta sig" från hackning, och förbättrar reproducerbarhet i olika funktionella analyser (såsom kalcium ackumulering).
Metoden lämpar sig för att undersöka följderna av en mängd olika stimuli, och efter behandling med läkemedel / hämmare. Alla läkemedel / hämmare som är membranet permeabelt har potential att undersökas genom denna teknik, och varje molekyl som kan detekteras genom western blöt (eller liknande) kan undersökas.
Sammanfattningsvis manipulering av signaleringskaskader som är involverade i excitotoxicitet och ischemi-förmedlad celldöd erbjuda ett attraktivt tillvägagångssätt för utveckling av droger som begränsar neuronal celldöd efter stroke. Den beskrivna microslice metoden är en lätt tillämplig modell som gör utredningen av dessa signaleringskaskader i intakt mogna hjärnanvävnad. Denna teknik kan användas för att hjälpa till att identifiera nya behandlingar som begränsar neuronal celldöd efter stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt om något av det arbete som bedrivs inom detta manuskript.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsmedel från det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien, Hunter Medical Research Institute och universitetet i Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
