Summary
De er beskrevet i dette papir metoder viser, hvordan man kan konvertere en kommerciel inkjet printer til en bioprinter med samtidig UV polymerisering. Printeren er i stand til at konstruere 3D-væv struktur med celler og biomaterialer. Undersøgelsen viste her opbygget en 3D neocartilage.
Abstract
Bioprinting, som er baseret på termisk inkjet print, er en af de mest attraktive støtteteknologier inden for tissue engineering og regenerativ medicin. Med digital kontrol celler, stilladser og vækstfaktorer kan nøjagtigt deponeres til den ønskede todimensionale (2D) og tre-dimensionelle (3D) placeringer hurtigt. Derfor er denne teknologi er en ideel metode til at fabrikere væv efterligner deres oprindelige anatomiske strukturer. For at konstruere brusk med indfødte zoner organisation, ekstracellulær matrix sammensætning (ECM) og mekaniske egenskaber, har vi udviklet et bioprinting platform ved hjælp af en kommerciel inkjet printer med samtidig fotopolymerisation stand til 3D-brusk tissue engineering. Humane chondrocytter suspenderet i poly (ethylenglycol) diacrylat (PEGDA) blev trykt for 3D neocartilage konstruktion via lag-for-lag forsamling. De trykte celler blev fastsat til deres oprindelige deponerede positioner, støttet af o.INANSIERING stillads i samtidige fotopolymerisation. De mekaniske egenskaber af det trykte væv svarede til det native brusk. Sammenlignet med konventionelle væv fabrikation, som kræver længere UV-eksponering, levedygtigheden af de trykte celler med simultan fotopolymerisation var betydeligt højere. Trykt neocartilage demonstreret fremragende glycosaminoglycan (GAG) og kollagen type II produktion, hvilket var i overensstemmelse med genekspression. Derfor er denne platform er ideel for præcis celle distribution og arrangement for anatomisk tissue engineering.
Introduction
Bioprinting baseret på termisk inkjet trykning er en af de mest lovende teknologier, der muliggør inden for tissue engineering og regenerativ medicin. Med digital kontrol og high throughput printhoveder celler, stilladser og vækstfaktorer kan nøjagtigt deponeres til den ønskede todimensionale (2D) og tre-dimensionelle (3D) positioner hurtigt. Mange succesfulde ansøgninger er blevet opnået ved hjælp af denne teknologi i tissue engineering og regenerativ medicin 1-9. I dette papir, blev en bioprinting platform etableret med en modificeret Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 termisk inkjet printer og en samtidig fotopolymeriserings system. Syntetiske hydrogeler er formuleret ud fra poly (ethylenglycol) (PEG) har vist evne til at opretholde chondrocyt levedygtighed og fremme chondrogenese ECM produktion 10,11. Desuden fotokrydsbindbart PEG er letopløseligt i vand med lav viskositet, hvilket gør det ideelt til samtidig polymefinitioner, godkendelse under 3D-bioprinting. I dette papir, menneskelige chondrocytter suspenderet i poly (ethylen) glycol diacrylat (PEGDA, MW 3.400), blev netop trykt at konstruere neocartilage lag-for-lag med 1.400 dpi i 3D opløsning. Homogen fordeling af deponerede celler i en 3D stillads blev observeret, hvilket genererede bruskvæv med fremragende mekaniske egenskaber og forbedret ECM produktion. Derimod i manuel fremstilling celler akkumulerede i bunden af gelen i stedet for deres oprindeligt deponeret positioner grund langsommere stillads polymerisation, hvilket førte til inhomogen bruskdannelse efter dyrkning 2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Bioprinting Platform Establishment
Printeren ændring var baseret på en HP Deskjet 500 termisk inkjet printer og HP 51626A sort blækpatron.
- Fjern det øverste plastlåg på printeren og forsigtigt tages betjeningspanelet fra dækslet.
- Frigør de 3 kabelforbindelser mellem printeren øverste del og base. Fjern printerens topdel fra basen.
- På printerens øverste del, fjern lille plastik og gummi tilbehør (printhoved rengøring system) på højre side under blækpatronen.
- Fjern bunden af papirbakken med fjedre.
- Fjern metalpladen dækker plast papir fodring bar.
- Skær plastik papirfremføring bar i midten fødehjulet position ved hjælp af en håndsav eller andet skæreværktøj.
- Fjern de 2 papir fodring hjul udsættes efter det foregående trin. Hjulet plast er meget hårdt og en elektronisksav vil være nyttig.
- Rengør støv og snavs ved hjælp af dåse luft og ethanol klude.
- Fastgør printeren topdel til basen.
- UV sterilisere den modificerede printer mindst 2 timer i en laminar flow hætte, før du bruger.
- Skær hætten på en 51626A patron ved hjælp af en håndsav eller andet skæreværktøj HP-blæk.
- Tøm blæk og fjerne det filter, der dækker den nederste godt reservoir af brusk.
- Skyl patronen grundigt med rindende vand.
- Ultralydsbehandles patronen i vand afioniseret (DI) i 10 minutter for at fjerne den resterende blæk.
- Undersøg patronen for at sikre alle blækket er blevet fjernet. Skyl eller spray patronen grundigt med 70% ethanol til sterilisering efterfulgt af steriliseret DI vand.
- Opsæt en lang bølgelængde ultraviolet lampe over trykning platform for at yde samtidig fotopolymeriserings kapacitet.
- Måle UV intensitet ved udskrivning platform bestående af en UV-lysmeter. Juster afstanden mellem UV-lampen og printeren platformen, så intensiteten ved trykning emne er mellem 4-8 mW / cm 2 (ca. 25 cm fra lampen til printeren platform).
2.. Bioink Fremstilling
- Enkeltlags kondrocyt ekspansion
- Plate 5 millioner humane chondrocytter i hvert T175 vævskulturkolbe for celle ekspansion i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% kalveserum og 1x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG). Kultur-celler ved 37 ° C med fugtig luft indeholdende 5% CO2. Skift dyrkningsmediet hver 3 dage, indtil kolben 85% konfluens. Brug af celler fra den samme passage.
- Opløs PEGDA i PBS til en slutkoncentration på 10% w / v. Tilføj fotoinitiator I-2959 til en endelig koncentration på 0,05% w / v. Foretage sterilisere opløsningen.
- Suspendere dyrkede humane chondrocytter i forberedt PEGDA løsningen på 5 x 10 6 celler /ml.
3.. Bruskvæv udskrivning
- Tænd printeren og laptop.
- Opret en udskrivning mønster af en massiv cirkel med 4 mm i diameter ved hjælp af Microsoft Word eller Adobe Photoshop.
- Justere placeringen af mønsteret og sørg for at det vil blive udskrevet præcis i plast støber.
- Beregn antallet af udskrifter, der er nødvendige for at nå den ønskede tykkelse af stilladset. For 4 mm i højden, er 220 prints kræves for at skabe den ønskede stillads.
- Indlæse bioink i blækpatronen. Dæk patronen med aluminiumfolie for at beskytte den direkte UV-eksponering under udskrivning.
- Send udskrivning kommando til printeren. Træk papiret sensoren, når printeren begynder at udskrive. Hele trykprocessen bør tage mindre end 4 min til et stillads med 4 mm i diameter og 4 mm i højden.
- Overførsel trykt neocartilage til en plade med 24 brønde, og der tilsættes 1,5 ml dyrkningsmedium til hver brønd.
- Inkubér trykte neocartilage i LIVE / DEAD levedygtighed / Cytotoxicity brugsopløsning ved stuetemperatur i 15 minutter i mørke.
- Skær celle-laden hydrogel i halve og tage fluorescerende billeder af skæreområdet.
- Tæl levende (grøn) og døde (røde) celler ved en blindet observatør på fem tilfældigt taget billeder. Beregn celleviabilitet ved at dividere antallet af levende celler med det samlede antal af levende og døde celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den modificerede termisk inkjet printer var i stand til celle og stillads deposition på high throughput og fremragende levedygtighed celle. Ved at kombinere med samtidig fotopolymerisation og lysfølsomme biomaterialer, denne teknologi er i stand til at løse de celler og andre trykte stoffer til de oprindeligt deponerede placeringer. Ifølge de egenskaber af den modificerede termisk inkjet printer, 2D udskrivningsopløsningen var 300 dpi med en enkelt blæk dråbe volumen på 130 pl. Der er 50 fyring dyser i hvert printhoved med 3,6 kHz affyringsfrekvens 12,13. Derfor for en repræsentativ konstruktion på 4 mm i diameter og 4 mm højde, mængden og tykkelsen af hver udskrevet lag under lag af lag-konstruktion var 0,23 pi og 18 um, hhv. Hele trykning tog mindre end 4 min at konstruere bruskvæv (figur 1).
Figur 2A viser en endnu celle fordeling af prinTED chondrocytter i 3D stillads på grund af samtidig fotopolymerisation af det omgivende stillads under celle deposition. Derimod uden samtidig fotopolymerisering (stillads polymeriseret efter cellepodning) de deponerede celler sank til bunds eller zoner brugerflade i stedet for deres oprindeligt deponerede steder på grund af tyngdekraften (Figur 2B). Denne ophobning celle blev også observeret i tidligere rapporter for manuel fremstilling af brusk væv 14,15. De trykte menneskelige chondrocytter i 3D PEG hydrogel genvundet chondrogen fænotype og viste gradvist proteoglycan produktion i kultur (figur 3) 3.
Fig. 1. Trykt neocartilage væv. A) Skematisk af brusk bioprinting med samtidig fotopolymerisation og læggeis af lag-samling. B) En trykt neocartilage væv med 4 mm i diameter og 4 mm i højden. Målestokken = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Chondrocytter mærket med grønne og orange fluorescerende farvestoffer viste zoner brusk bioprinting gennemførlighed. A) Trykte celler fastholdt deres oprindeligt deponerede positioner i 3D-hydrogel. Trykning og fotopolymerisation proces afsluttet i 4 min med cellelevedygtighed på 90% (n = 3). B) Celler akkumuleret på bunden eller grænsefladen på grund af tyngdekraften uden samtidig fotopolymerisation. Det tog 10 minutter for UV-eksponering til gel konstruktionen med den samme størrelse af A med en celle levedygtighed63% (n = 3). Skalapanelerne = 100 um.
Figur 3.. Safranin-O farvning af trykte chondrocytter i PEG hydrogel shows øgede proteoglycan produktion i kulturen. Skalapanelerne = 100 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne 3D bioprinting-telefonsystem med simultan fotopolymeriserings kapacitet giver et væsentligt større udskrivning opløsning end den bedste tidligere rapporterede metode til in situ trykning af osteochondrale defekter ved hjælp af sprøjte ekstruderet et cellulært alginat hydrogel 16. Højere udskrivningsopløsningen er særlig kritisk for brusk tissue engineering for at genskabe den anatomiske brusk zone organisation. Samtidig fotopolymerisation under lag af lag-samling er afgørende for at opretholde en præcis aflejring af celler og biomateriale stilladser til 3D-konstruktion. Microfabrication med hver udskrevet lag også resulteret i glidende overgange mellem zoneinddeles lag, hvilket minimerer risikoen for nedbrydning på grund af delaminering. Ved at justere bioprinting parametre og komponenter af bioink, vil vi være i stand til at fremstille de komplekse 3D-strukturer, der kræves til at helbrede en lang række brusk læsioner.
Med Synergistic vækstfaktorstimulering den bioprinted neocartilage havde den bedste chondrogene fænotype og mest celleproliferation 3. Derfor cellepodning densitet anvendt i denne undersøgelse, der er muligt for bioprinting, er også ideel til bruskregenerering, når de behandles med passende vækstfaktorer. Bruskheling ved hjælp af autologe chondrocytter er stærkt begrænset i kliniske anvendelser på grund af det begrænsede antal af chondrocytter høstet i biopsi. Implantere direkte høstet autologe chondrocytter eller mesenkyme stamceller (MSC'er) sammen med biomaterialer til bruskheling uden monolag ekspansion er overordentlig attraktiv. Derfor er det vigtigt at udvide den trykte celleantal til den optimale celledensitet kræves for bruskdannelse uden at forringe kvaliteten af brusken betragtning af de begrænsede antal celler. Endvidere begrænser begyndelsen er celletætheden i høj grad vil optimere og maksimere bioprinting opløsning. Således bioprinTing metode beskrevet her er fuldt kompatibel med de lave celletal i kliniske omgivelser og har potentialet til at blive brugt til brusk tissue engineering.
Konklusionen er, vores arbejde demonstrerer muligheden for opdigte anatomiske bruskstrukturer ved at levere kondrocytter og biomateriale stillads materialer til præcise målrettede positioner. En PEG-hydrogel med humane chondrocytter blev løbende bioprinted via lag-for-lag forsamling. Samtidig fotopolymerisering fastholdt de trykte celler på deres oprindelige, indsat positioner og reduceret fototoksicitet. Celler i den trykte neocartilage opretholdt chondrogen fænotype med konsekvent genekspression og biokemiske analyser 2. Derfor er denne teknologi er et lovende fremskridt for anatomisk brusk tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomisk interesse i dette studie.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den støtte fra New York Region Hovedstaden Research Alliance Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
