Summary
Les méthodes décrites dans le présent document montrent comment convertir une imprimante à jet d'encre commerciale dans un bioprinter la polymérisation UV simultanée. L'imprimante est capable de construire une structure de tissu 3D avec des cellules et des biomatériaux. L'étude a démontré ici construit une néocartilage 3D.
Abstract
Bioprinting, qui est basé sur l'impression jet d'encre thermique, est l'une des technologies permettant les plus attrayantes dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. Avec les cellules de contrôle numérique, des échafaudages et des facteurs de croissance peuvent être déposées avec précision à deux dimensions (2D) et désirée (3D) des emplacements tridimensionnels rapidement. Par conséquent, cette technologie est une approche idéale pour fabriquer des tissus imitant leurs structures anatomiques indigènes. Afin de concevoir cartilage à l'organisation indigène zonal, la composition de la matrice extracellulaire (ECM), et les propriétés mécaniques, nous avons développé une plate-forme de bioprinting aide d'une imprimante à jet d'encre commerciale avec photopolymérisation simultanée capable pour la 3D cartilage ingénierie tissulaire. Chondrocytes humains en suspension dans le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA) ont été imprimés pour la construction néocartilage 3D via assemblage couche par couche. Les cellules imprimées ont été fixés à leurs positions originales déposées, soutenu par le surroUnding échafaud photopolymérisation simultanée. Les propriétés mécaniques du tissu imprimé, se rapprochent du cartilage natif. Par rapport à la fabrication des tissus classique, qui nécessite plus l'exposition aux UV, la viabilité des cellules imprimées avec photopolymérisation simultanée était significativement plus élevée. Néocartilage imprimé démontré une excellente glycosaminoglycanes (GAG) et de la production de collagène de type II, ce qui était en accord avec l'expression du gène. Par conséquent, cette plate-forme est idéale pour la distribution précise de la cellule et l'agencement pour l'ingénierie tissulaire anatomique.
Introduction
Bioprinting basé sur l'impression jet d'encre thermique est l'une des technologies permettant plus prometteurs dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. Avec des têtes d'impression de contrôle numérique et haut débit facteurs cellules, échafaudages, et de croissance peuvent être déposés précisément à deux dimensions (2D) souhaitée et positions (3D) en trois dimensions rapidement. De nombreuses applications réussies ont été obtenus en utilisant cette technologie en ingénierie tissulaire et la médecine régénérative 1-9. Dans ce papier, une plate-forme de bioprinting a été établi avec un Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 imprimante à jet d'encre thermique modifié et un système de photopolymérisation simultanée. Hydrogels synthétiques formulés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) ont montré la capacité de maintenir la viabilité des chondrocytes et promouvoir chondrogène production ECM 10,11. En outre, photoréticulable PEG est très soluble dans l'eau avec une faible viscosité, ce qui le rend idéal pour polyme simultanéerisation pendant bioprinting 3D. Dans cet article, les chondrocytes humains en suspension dans le poly (éthylène) de diacrylate (PEGDA; MW 3400) ont été imprimés précisément de construire néocartilage couche-par-couche avec 1400 dpi en résolution 3D. Répartition homogène des cellules déposées dans un échafaudage 3D a été observée, ce qui a généré le tissu cartilagineux avec d'excellentes propriétés mécaniques et une production accrue de l'ECM. En revanche, dans les cellules de fabrication manuelle accumulés au fond du gel à la place de leurs positions initialement déposées en raison de la polymérisation d'échafaudage plus lente, ce qui conduit à la formation de cartilage non homogène après culture 2,3.
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Protocol
1. Bioprinting plate-forme mise en place
La modification de l'imprimante a été basé sur une imprimante à jet d'encre thermique HP Deskjet 500 et HP 51626A cartouche d'encre noire.
- Retirez le couvercle en plastique haut de l'imprimante et soigneusement détacher le panneau de contrôle de la couverture.
- Détachez les 3 câbles de connexion entre la partie supérieur de l'imprimante et de la base. Retirer la partie supérieur de l'imprimante à partir de la base.
- Sur la partie supérieure de l'imprimante, retirez le petit plastique et accessoires en caoutchouc (système de nettoyage de tête d'impression) sur le côté de la main droite sous la cartouche d'encre.
- Retirez la base du bac à papier avec des ressorts.
- Retirer la plaque métallique recouvrant la barre d'alimentation de papier plastique.
- Coupez la barre d'alimentation de papier plastique à la position de la roue d'alimentation milieu à l'aide d'une scie à main ou un autre outil de coupe.
- Déposer les roues 2 d'alimentation papier exposées après l'étape précédente. Le plastique de la roue est très difficile et une électroniquescie sera utile.
- Nettoyez la poussière et les débris en utilisant des lingettes d'air et de l'éthanol en conserve.
- Fixez la partie supérieur de l'imprimante à la base.
- UV stériliser l'imprimante modifiée pour au moins 2 heures dans une hotte à flux laminaire avant de l'utiliser.
- Coupez le capuchon de la cartouche d'encre HP 51626A aide d'une scie à main ou un autre outil de coupe.
- Vider l'encre et retirez le filtre qui recouvre le réservoir de fond de puits du cartilage.
- Rincez la cartouche à fond en utilisant l'eau du robinet.
- Ultrasonicate la cartouche dans désionisée (DI) de l'eau pendant 10 minutes pour enlever l'encre résiduelle.
- Examinez la cartouche pour vous assurer que toute l'encre a été éliminée. Rincer la cartouche ou de pulvérisation à fond avec de l'éthanol à 70% pour la stérilisation, puis de l'eau déminéralisée stérilisée.
- Mettre en place une lampe à ultraviolets longueur d'onde sur la plate-forme d'impression pour fournir une capacité de photopolymérisation simultanée.
- Mesurer l'intensité des UV à la plate-forme d'impression en utilisant une lumière UVmètre. Régler la distance entre la lampe UV et la plate-forme d'impression pour l'intensité de l'objet d'impression est comprise entre 8.4 mW / cm 2 (environ 25 cm de la lampe à la plate-forme de l'imprimante).
2. Préparation Bioink
- L'expansion monocouche de chondrocytes
- Plate 5000000 chondrocytes humains dans chaque flacon de culture de tissu T175 pour l'expansion des cellules dans Dulbecco Modifié Eagles Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau et 1 x pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG). des cellules de culture à 37 ° C avec de l'air humidifié contenant 5% de CO 2. Changer le milieu de culture tous les 3 jours jusqu'à ce que le ballon est de 85% de confluence. Utiliser des cellules à partir du même passage.
- Dissoudre PEGDA dans du PBS à une concentration finale de 10% p / v Ajouter photo-initiateur I-2959 à une concentration finale de 0,05% p / v Filtre stériliser la solution.
- Suspendre chondrocytes humains cultivés dans la solution PEGDA préparé à 5 x 10 6 cellules /ml.
3. Impression de tissu cartilagineux
- Mettez l'imprimante et l'ordinateur portable.
- Créer un motif d'impression d'un cercle plein avec 4 mm de diamètre à l'aide de Microsoft Word ou Adobe Photoshop.
- Ajustez la position du motif et assurez-vous qu'il sera imprimé exactement dans le moule en plastique.
- Calculer le nombre de copies nécessaires pour atteindre l'épaisseur désirée de l'échafaudage. Pour 4 mm de hauteur, 220 gravures sont nécessaires pour créer l'échafaud souhaitée.
- Charger le bioink dans la cartouche d'encre. Couvrir la cartouche avec du papier d'aluminium pour le protéger de l'exposition directe aux rayons UV pendant l'impression.
- Envoyer commande d'impression à l'imprimante. Tirez le capteur de papier lorsque l'imprimante commence à imprimer. L'ensemble du processus d'impression devrait prendre moins de 4 min pour un échafaudage de 4 mm de diamètre et 4 mm de hauteur.
- Transfert imprimé néocartilage à une plaque de 24 puits et ajouter 1,5 ml de milieu de culture dans chaque puits.
- Incuber la néocartilage imprimé en solution, LIVE / DEAD viabilité / cytotoxicité travailler à température ambiante pendant 15 minutes dans l'obscurité.
- Couper l'hydrogel de cellule en demi-charge et prendre des images de fluorescence de la zone de coupe.
- Comptez en direct (vert) et les cellules mortes (rouges) par un observateur impartial à cinq images prises au hasard. Calculer la viabilité cellulaire en divisant le nombre de cellules vivantes par le nombre total de cellules vivantes et mortes.
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Representative Results
L'imprimante à jet d'encre thermique modifiée est capable de cellule et le dépôt d'échafaudage à un débit élevé et une excellente viabilité cellulaire. Combinant avec photopolymérisation simultanée et biomatériaux photosensibles, cette technologie est en mesure de fixer les cellules et d'autres substances imprimés aux emplacements initialement déposés. Selon les propriétés de l'imprimante à jet d'encre thermique modifiée, la résolution d'impression est de 300 dpi 2D avec un volume de goutte d'encre unique de 130 pl. Il ya 50 buses de tir dans chaque tête d'impression avec une fréquence de 3,6 kHz de tir 12,13. Par conséquent, pour un produit d'assemblage représentant de 4 mm de diamètre et 4 mm de hauteur, le volume et l'épaisseur de chaque couche d'impression au cours de la construction couche par couche était de 0,23 ul et 18 pm, respectivement. Le processus d'impression a pris moins de 4 min pour la construction du tissu de cartilage (figure 1).
La figure 2A montre une répartition uniforme de la cellule de principeted chondrocytes dans échafaud 3D en raison de photopolymérisation simultanée de l'échafaudage entourant lors du dépôt de la cellule. En revanche, sans photopolymérisation simultanée (échafaudage polymérisé après l'ensemencement des cellules), les cellules déposées coulé au fond ou à l'interface de zone à la place de leurs emplacements initialement déposées en raison de la gravité (figure 2B). Cette accumulation de cellules a également été observée dans les rapports précédents de la fabrication manuelle de cartilage 14,15 tissulaire. Les chondrocytes humains imprimés en 3D hydrogel de PEG récupérés phénotype chondrogénique et ont démontré la production de protéoglycanes augmenté progressivement au cours de la culture (Figure 3) 3.
Figure 1. Imprimé tissu néocartilage. A) Schéma de cartilage bioprinting avec photopolymérisation simultanée et de jetertissu néocartilage assemblage er-par-couche. B) Un imprimé avec 4 mm de diamètre et 4 mm de hauteur. Barre d'échelle = 2 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Chondrocytes marqués avec des colorants fluorescents verts et oranges démontré le cartilage zonal bioprinting faisabilité. A) Des cellules imprimées ont maintenu leurs positions initialement déposés dans l'hydrogel 3D. Le processus d'impression et de photopolymérisation achevée en 4 min avec la viabilité cellulaire de 90% (n = 3). B) Les cellules accumulées au fond ou à l'interface de la pesanteur sans photopolymérisation simultanée. Il a fallu 10 minutes d'exposition aux UV pour gélifier le produit d'assemblage avec la même taille de A avec une viabilité cellulaire d'63% (n = 3). Barres d'échelle = 100 um.
Figure 3. Safranine-O coloration des chondrocytes imprimés en PEG hydrogel spectacles a augmenté la production de protéoglycanes au cours de la culture. Barres d'échelle = 100 um.
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Discussion
Ce système de bioprinting 3D avec une capacité de photopolymérisation simultanée fournit une résolution d'impression de manière significative plus grande que la meilleure méthode d'impression précédemment rapporté in situ des défauts ostéochondraux extrudée à l'aide de la seringue un hydrogel d'alginate cellulaire dans 16. Résolution d'impression plus élevée est particulièrement critique pour l'ingénierie des tissus cartilagineux pour rétablir l'organisation anatomique de zone de cartilage. Photopolymérisation simultanée lors de l'assemblage couche par couche est crucial de maintenir le dépôt précis des cellules et des échafaudages de biomatériaux pour la construction 3D. Microfabrication avec chaque couche imprimée a également abouti à des transitions fluides entre les couches de zone, minimisant les risques de dégradation due à la délamination. En réglant avec précision les paramètres et les composants de la bioink bioprinting, nous serons en mesure de fabriquer les structures 3D complexes nécessaires pour guérir une grande variété de lésions du cartilage.
Avec synela stimulation du facteur de croissance rgistic, le néocartilage bioprinted avait la meilleure phénotype chondrogénique et plus la prolifération des cellules 3. Par conséquent, la densité d'ensemencement des cellules utilisées dans cette étude, ce qui est réalisable pour bioprinting, est également idéale pour la régénération du cartilage lorsqu'ils sont traités avec des facteurs de croissance appropriés. la réparation du cartilage en utilisant des chondrocytes autologues est fortement limitée dans les applications cliniques en raison du nombre limité de chondrocytes récoltées dans une biopsie. L'implantation de chondrocytes autologues directement les récoltés ou cellules souches mésenchymateuses (CSM) ainsi que des biomatériaux pour la réparation du cartilage sans expansion de la monocouche est extrêmement attrayant. Par conséquent, il est essentiel d'accroître le nombre de cellules imprimées à la densité cellulaire optimale requise pour la formation de cartilage sans compromettre la qualité de la matrice de cartilage étant donné le nombre de cellules limitées. En outre, en limitant la densité cellulaire initiale grandement optimiser et de maximiser la résolution de bioprinting. Ainsi, la bioprinProcédé tion décrite ici est entièrement compatible avec le faible nombre de cellules en milieu clinique et a le potentiel d'être utilisé pour l'ingénierie des tissus cartilagineux.
En conclusion, notre travail démontre la faisabilité de la fabrication de structures anatomiques du cartilage en fournissant les chondrocytes et les matériaux biomatériau d'échafaudage à des postes ciblés précis. Un hydrogel de PEG avec les chondrocytes humains en continu via bioprinted assemblage couche par couche. Photopolymérisation simultanée maintenu les cellules imprimées à leurs positions initiales dépositaires et réduit la phototoxicité. Les cellules de la néocartilage imprimé maintenues phénotype chondrogénique avec l'expression des gènes et l'analyse biochimique cohérente 2. Par conséquent, cette technologie constitue un progrès prometteur pour anatomique cartilage ingénierie tissulaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt financier dans cette étude.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la New York Région Capital Alliance subvention de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
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