Summary
Bu yazıda anlatılan yöntemleri eşzamanlı UV polimerizasyon ile bir bioprinter içine ticari bir mürekkep püskürtmeli yazıcı dönüştürmek için nasıl gösterir. Yazıcı hücreleri ve biyomalzeme 3D doku yapısı oluşturmak yeteneğine sahiptir. Burada gösterilen çalışma 3D neocartilage inşa.
Abstract
Termal mürekkep püskürtmeli baskı dayanmaktadır Bioprinting, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında en cazip kılan teknolojileri biridir. Dijital kontrol hücreleri, iskeleler, ve büyüme faktörleri hassas üç boyutlu (3D) konumları hızla istenen iki boyutlu (2D) yatırılması edilebilir ile. Bu nedenle, bu teknolojinin kendi ana anatomik yapılarını taklit dokuları imal için ideal bir yaklaşımdır. Yerli bölgeli organizasyon, hücre dışı matris (ECM), ve mekanik özelliklere sahip kıkırdak mühendisi için, biz 3D kıkırdak doku mühendisliği için yetenekli eşzamanlı fotopolimerizasyon ile ticari bir mürekkep püskürtmeli yazıcı kullanarak bir bioprinting platform geliştirdi. Poli (etilen glikol) diakrilat (Pegda) içinde süspansiyon haline getirilmiş insan kondrosit katman-katman düzeneği ile 3D neocartilage yapımı için basıldı. Basılı hücreler Gem tarafından desteklenen, kendi orijinal tevdi pozisyonlarında tespit edildieşzamanlı fotopolimerizasyon iskelesi unding. Basılı doku mekanik özellikleri, doğal kıkırdak benzerdi. Daha fazla UV ışınlarına maruz kalma, doku gerektiren geleneksel imalat, ile karşılaştırıldığında, aynı anda fotopolimerizasyonu ile basılı hücrelerin canlılığı anlamlı ölçüde yüksekti. Baskılı neocartilage çok glikozaminoglikan (GAG) ve gen ekspresyonu ile tutarlıdır kollajen tip II üretimi göstermiştir. Bu nedenle, bu platform anatomik doku mühendisliği için doğru hücre dağılımı ve düzenlenmesi için idealdir.
Introduction
Termal mürekkep püskürtmeli baskı dayalı Bioprinting doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında en umut verici sağlayan teknolojilerden biridir. Dijital kontrol ve yüksek verimli baskı kafaları, hücreleri, iskeleler, ve büyüme faktörleri tam olarak üç boyutlu (3D) pozisyonları hızla istenen iki boyutlu (2D) yatırılması ve edilebilir. Birçok başarılı uygulamaları doku mühendisliği ve rejeneratif tıp 1-9, bu teknoloji kullanılarak elde edilmiştir. Bu yazıda, bir bioprinting platformu değiştirilmiş bir Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 termal mürekkep püskürtmeli yazıcı ve eşzamanlı fotopolimerizasyon sistemi ile kurulmuştur. Poli (etilen glikol) (PEG) ile formüle sentetik hidrojeller kondrosit canlılığını muhafaza ve kondrojenik ECM üretimini teşvik 10,11 kapasitesini göstermiştir. Buna ek olarak, aynı anda photocrosslinkable PEG Polimer için idealdir düşük viskoziteli, su içinde yüksek ölçüde çözünen3D bioprinting sırasında haklara ait. Bu yazıda, poli (etilen) glikol diakrilat (Pegda; MW 3400) içinde süspanse insan kıkırdaklan tam 3D çözünürlükte 1.400 dpi ile neocartilage katman-katman oluşturmak için basıldı. 3 boyutlu iskele yatırılır hücrelerinin homojen dağılımı çok iyi mekanik özellikleri ve gelişmiş ECM üretimi ile kıkırdak dokuyu meydana getirdiği gözlenmiştir. Buna karşılık, manuel imalatı nedeniyle kültür 2,3 ardından homojen olmayan bir kıkırdak oluşumuna yol açan yavaş iskele polimerizasyonu için yerine kendi ilk tevdi pozisyonların jel altındaki biriken hücreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Bioprinting Platformu kurulması
Yazıcı değişiklik bir HP Deskjet 500 termal mürekkep püskürtmeli yazıcı ve HP 51626a siyah mürekkep kartuşunun dayanmaktadır.
- Yazıcının üst plastik kapağı çıkarın ve dikkatle kapağından kontrol panelini çıkarın.
- Yazıcının üst kısmı ve tabanı arasındaki 3 kablo bağlantılarını ayırın. Tabanından yazıcı üst kısmını çıkarmak.
- Yazıcının üst kısmında, mürekkep kartuşunun altındaki sağ tarafında küçük plastik ve kauçuk aksesuarları (yazıcı kafası temizleme sistemi) çıkarın.
- Yaylar ile kağıt tepsisinin tabanını çıkarın.
- Plastik kağıt besleme bar kapsayan metalik plakasını sökün.
- Bir el testeresi ya da diğer kesici alet kullanarak orta besleme tekerlek pozisyonda plastik kağıt besleme barı kesti.
- Önceki adımdan sonra maruz 2 kağıt besleme tekerlekleri çıkarın. Tekerlekli plastik çok sert ve bir elektronik olduğunutestere yararlı olacaktır.
- Konserve hava ve etanol mendil kullanarak toz ve enkaz temizlemek.
- Tabanına yazıcı üst kısmını takın.
- Kullanmadan önce, bir laminar akış başlığı içinde, en az 2 saat boyunca değiştirilmiş yazıcı sterilize UV.
- Bir el testeresi ya da diğer kesici alet kullanarak bir HP 51626a mürekkep kartuşunun kapağını kesti.
- Mürekkebi boşaltın ve kıkırdak alt iyi rezervuar kapakları filtreyi kaldırmak.
- Iyice akan musluk suyu kullanarak kartuşu durulayın.
- Ultrasonicate 10 dakika boyunca iyonu giderilmiş (Di) su içinde kartuş, mürekkep kaldırın.
- Emin tüm mürekkep kaldırıldı yapmak için kartuşunu inceleyin. Steril DI ardından su sterilizasyon için% 70 etanol ile iyice kartuş, veya sprey yıkayın.
- Eşzamanlı fotopolimerizasyon kapasitesini sağlamak için baskı platformu üzerinde uzun dalga boylu ultraviyole lamba kurmak.
- UV ışık kullanarak baskı platformda UV yoğunluğunu ölçünölçer. Baskı konuya şiddeti 4-8 arasında mW / cm 2 (yazıcı platformuna lamba yaklaşık 25 cm) yani UV lamba ve yazıcı platformu arasındaki mesafeyi ayarlayın.
2.. Bioink Hazırlık
- Tek tabakalı Kondrosit genişleme
- Dulbeccos hücre genişlemesi için her bir T175 doku kültürü şişesi içine Plate 5000000 insan kondrosit% 10 dana serumu ve 1 x penisilin-streptomisin-glutamin (PSG) ile desteklenmiş Eagles Medium (DMEM) Modifiye. % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş hava ile 37 ° C 'de kültür hücreleri. Şişe% 85 izdiham kadar her 3 günde bir kültür ortamı değiştirin. Aynı geçit hücreleri kullanın.
- % 10 a / h bir nihai konsantrasyona PBS içinde çözülür Pegda % 0.05 a / h bir nihai konsantrasyona kadar foto-başlatıcı I-2959 ekleme Çözüm sterilize Filtre.
- 5 x 10 6 hücre Pegda hazırlanan çözelti içinde kültürlenmiş insan kondrositler Askıya /ml.
3.. Kıkırdak Doku Baskı
- Yazıcı ve dizüstü bilgisayarı açın.
- Microsoft Word veya Adobe Photoshop kullanarak çapı 4 mm ile sağlam bir dairenin bir baskı deseni oluşturun.
- Desen konumunu ayarlayın ve plastik kalıp içine tam olarak yazdıracaktır emin olun.
- Iskele, istenen kalınlığa ulaşmak için gerekli baskı sayısını hesaplayın. Yüksekliği 4 mm, 220 baskılar istenen iskele oluşturmak için gereklidir.
- Mürekkep kartuşunun içine bioink yükleyin. Yazdırma sırasında doğrudan UV ışınlarına maruz korumak için alüminyum folyo ile örtün kartuşu.
- Yazıcıya yazdırma komutunu gönderin. Yazıcı yazdırmaya başladığında kağıt sensörü çekin. Bütün baskı işlemi çapı 4 mm ve yüksekliği 4 mm olan bir yapı iskelesi için en az 4 dakika sürer.
- Aktarım, 24-iyi levhaya neocartilage basılı ve her bir oyuğa 1.5 ml kültür ortamı ilave edin.
- Karanlıkta 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ölü / canlı Canlılık / Sitotoksisite çalışma çözeltisi içinde basılı neocartilage inkübe edin.
- Yarısında hücre yüklü hidrojel kesilmiş ve kesim alanının floresan görüntüleri çekmek.
- Beş rastgele çekilen görüntüleri bir kör gözlemci tarafından (yeşil) ve ölü (kırmızı) hücreleri canlı saymak. Canlı ve ölü hücre toplam sayısı, canlı hücre sayısına bölünmesiyle hücre canlılığı hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modifiye termal mürekkep püskürtmeli yazıcı, yüksek verimlilik ve mükemmel hücre canlılığı de hücre ve iskele birikimi için yetenekli oldu. Eşzamanlı fotopolimerizasyon ve ışığa biyomalzeme ile birleştiren bu teknoloji, başlangıçta yatırılan yerlere hücreleri ve diğer basılı maddeleri düzeltmek mümkün değildir. Modifiye termal mürekkep püskürtmeli yazıcı özelliklerine göre, 2B baskı çözünürlüğü 130 pl tek bir mürekkep damla hacmi ile 300 dpi oldu. 3.6 kHz frekans 12,13 ile her yazıcı kafasında 50 ateşleme memeleri vardır. Bu nedenle 4 mm çapında ve 4 mm yükseklik, hacim ve katman-katman yapımı sırasında her bir basılmış tabaka kalınlığı temsil eden bir yapı için sırasıyla 0.23 ve 18 | il um idi. Tüm baskı işlemi kıkırdak doku (Şekil 1) oluşturmak için en az 4 dakika sürdü.
Şekil 2A prin eşit bir hücre dağılımıted nedeniyle hücre yerleştirilmesi sırasında çevredeki skafoldun eşzamanlı fotopolimerizasyon için 3 boyutlu iskele kondrositlerin. Bunun tersine, aynı anda fotopolimerizasyon (cep iskele sonra tohumlama, polimerize olmadan), biriken hücreler yerine ağırlık (Şekil 2B) nedeniyle başlangıçta biriken yerle altındaki ya da bölgesel arayüzüne çöktü. Bu hücre birikimi de kıkırdak doku 14,15 manuel fabrikasyon önceki raporlarda gözlendi. 3D PEG hidrojel basılmış insan kondrosit kondrojenik fenotipi geri kazanılır ve kültür sırasında giderek artmıştır proteoglikan üretimi (Şekil 3) 3 gösterdi.
Şekil 1.. Neocartilage doku basılmıştır. A) eşzamanlı fotopolimerizasyon ile kıkırdak bioprinting şematik ve yattıçapı 4 mm ve yüksekliği 4 mm er-by-tabaka montajı. B) bir basılı neocartilage doku. = 2 mm Ölçek Bar. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2,. Yeşil ve turuncu florasan boya ile işaretlenmiş Kondrositler bölgeli kıkırdak bioprinting uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. A) Basım hücreler 3D hidrojel kendi ilk tevdi konumlarını muhafaza. Baskı ve fotopolimerizasyon işlemi 4% 90 arasında, hücre canlılığı ile dakika (n = 3). B) kaynaklanan eşzamanlı fotopolimerizasyon çekimi için alt veya arayüz kartı Hücreler tamamlanmıştır. Bu hücre canlılığının ile A'nın aynı boyutta olan yapı jel UV ışınlarına maruz kalma 10 dakika sürdü% 63 (n = 3). Ölçek bar = 100 mikron.
PEG hidrojel şovlarında basılmış kondroitlerin Şekil 3.. Safranin-O boyama kültür sırasında proteoglikan üretimini artırdı. = 100 mm Ölçek barlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eş zamanlı fotopolimerizasyon kapasiteli Bu 3D bioprinting sistemi, hücresel aljinat hidrojel 16 kalıptan şırınga kullanılarak osteokondral defektlerin in situ baskı en iyi ve en önce bildirilen yönteme göre önemli ölçüde daha büyük bir baskı çözünürlüğü sağlar. Yüksek baskı çözünürlüğü anatomik kıkırdak bölgeli organizasyonu geri kıkırdak doku mühendisliği için özellikle önemlidir. Tabaka-by-katman montaj sırasında simültane fotopolimerizasyon 3D yapımı için hücre ve biyomalzeme iskelelerde hassas birikimini korumak için çok önemlidir. Her bir basılmış tabaka ile Mikro ve aynı zamanda nedeniyle delaminasyona bozulma potansiyelini en aza indirmek, bölgesel tabakalar arasında yumuşak geçişler ile sonuçlanmıştır. Tam bioprinting parametreleri ve bioink bileşenleri ayarlayarak, kıkırdak lezyon geniş bir yelpazede iyileştirmek için gerekli olan karmaşık 3D yapılar imal etmek mümkün olacaktır.
Güzel günler ilergistic büyüme faktörü uyarımı, bioprinted neocartilage en kondrojenik fenotip ve en çok hücre çoğalmasını 3 vardı. Uygun büyüme faktörleri ile muamele edilmiş, bu nedenle, bioprinting için uygun olan, bu çalışmada kullanılan hücre tohum yoğunluğu, aynı zamanda kıkırdak rejenerasyonu için idealdir. Otolog kıkırdak kullanarak kıkırdak onarımı büyük ölçüde nedeniyle biyopside hasat kondroitlerin sınırlı sayıda klinik uygulamalarda sınırlıdır. Tek tabakalı genişleme olmadan kıkırdak tamiri için biyomalzeme ile birlikte doğrudan hasat otolog kıkırdak veya mezenkimal kök hücreler (MKH) implante derece çekici. Bu nedenle, hücre sayıları sınırlı verilen kıkırdak matrisinin kalitesinden ödün vermeden kıkırdak oluşumu için gerekli olan en uygun hücre yoğunluğu için basılı hücre sayıları genişletmek için çok önemlidir. Ayrıca, başlangıç hücre yoğunluğu sınırlayıcı ölçüde optimize etmek ve bioprinting çözünürlüğünü en üst düzeye çıkaracaktır. Bu nedenle, bioprinBurada tarif edilen yöntem, ting klinik bir ortamda düşük hücre sayıları ile tam olarak uyumludur ve kıkırdak doku mühendisliği için kullanılacak olan bir potansiyele sahiptir.
Sonuç olarak, bizim iş kesin hedef pozisyonlara Kondrositlerin ve biyomalzeme iskele malzemeleri sunarak anatomik kıkırdak yapıları imalatı yapılabilirliğini gösterir. Insan kondrosit olan bir PEG hidrojel sürekli tabaka-katman düzeneği ile bioprinted edildi. Aynı anda fotopolimerizasyon başlangıç bırakılmış konumlarında basılı hücreler muhafaza ve fototoksisite azaltmıştır. Basılı neocartilage hücreler tutarlı gen ifadesi ve biyokimyasal analiz 2 ile kondrojenik fenotip yapılmaktadır. Bu nedenle, bu teknoloji anatomik kıkırdak doku mühendisliği için umut verici bir gelişmedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışmada herhangi bir mali ilgi var.
Acknowledgments
Yazarlar New York Capital Region Araştırma İttifak Grant desteğini kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
