Summary
השיטות מתוארות במאמר זה להראות כיצד להמיר מדפסת הזרקת דיו מסחרית לbioprinter עם פילמור UV בו זמנית. המדפסת מסוגלת בניית מבנה רקמות 3D עם תאים וחומרים ביולוגיים. המחקר הראה כאן נבנה neocartilage 3D.
Abstract
Bioprinting, המבוסס על דיו להדפסה תרמית, הוא אחת הטכנולוגיות המאפשרות לאטרקטיביות ביותר בתחום הנדסת רקמות והרפואה רגנרטיבית. עם תאי בקרה דיגיטלית, פיגומים, וגורמי גדילה ניתן להפקיד דווקא לשני ממדים (2D) הרצוי ומקומות תלת ממדי (3D) במהירות. לכן, טכנולוגיה זו היא גישה אידיאלית לפברק רקמות מחקה המבנים אנטומיים האם שלהם. כדי להנדס סחוס עם ארגון האם של האזורים, הרכב תאי מטריקס (ECM), ותכונות מכאניות, פיתחנו פלטפורמת bioprinting באמצעות מדפסת הזרקת דיו מסחרית עם photopolymerization בו זמנית מסוגל להנדסת רקמות סחוס 3D. כונדרוציטים אנושיים התלויים בפולי diacrylate (אתילן גליקול) (PEGDA) הודפסו לבניית neocartilage 3D באמצעות הרכבה שכבה אחר שכבה. התאים המודפסים היו קבועים בעמדות שהופקדו המקוריות שלהם, נתמך על ידי surrounding פיגום בphotopolymerization בו זמנית. התכונות מכאניות של הרקמה המודפסת היו דומות לסחוס המקורי. בהשוואה לייצור רקמות קונבנציונלית, אשר דורש חשיפה לקרינת UV ארוכה יותר, הכדאיות של התאים המודפסים עם photopolymerization בו זמנית הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי. neocartilage המודפס הפגין glycosaminoglycan מצוין (GAG) וייצור קולגן הסוג השני, שעלה בקנה אחד עם ביטוי גנים. לכן, פלטפורמה זו היא אידיאלית לחלוקה מדויקת תא והסדר להנדסת רקמות אנטומיים.
Introduction
Bioprinting מבוסס על הדפסת דיו תרמית הוא אחת הטכנולוגיות המאפשרות המבטיחות ביותר בתחום הנדסת רקמות והרפואה רגנרטיבית. עם ראשי הדפסה בקרה דיגיטלית ותפוקה גבוהה גורמי תאים, פיגומים, וצמיחה ניתן להפקיד דווקא לשני ממדים (2D) הרצוי ועמדות תלת ממדי (3D) במהירות. יישומים מוצלחים רבים כבר הושגו באמצעות טכנולוגיה זו בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית 1-9. במאמר זה, פלטפורמת bioprinting הוקמה עם 500 מערכת photopolymerization סימולטני מדפסת שונה היולט פקארד (HP) Deskjet תרמית הזרקת דיו ו. הידרוג סינטטי נוסח מפולי (אתילן גליקול) (PEG) הראו את היכולת של שמירה על הכדאיות הכונדרוציטים ולקדם את ייצור ECM chondrogenic 10,11. בנוסף, PEG photocrosslinkable הוא מסיס מאוד במים עם צמיגות נמוכה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור פולימריים בו זמניתrization במהלך bioprinting 3D. במאמר זה, כונדרוציטים אנושיים התלויים בפולי diacrylate (אתילן) גליקול (PEGDA; MW 3,400) הודפסו בדיוק כדי לבנות שכבה אחר שכבת neocartilage עם 1,400 dpi ברזולוציה 3D. הפצה אחידה של תאים שהופקדו בפיגום 3D נצפתה, אשר נוצרה רקמת סחוס עם תכונות מכאניות מעולים וייצור ECM משופר. לעומת זאת, בייצור ידני התאים שהצטברו בחלק התחתון של ג'ל במקום עמדות תחילה הופקדו עקב פילמור פיגום איטי יותר, מה שהוביל להיווצרות סחוס הומוגניות לאחר 2,3 התרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bioprinting פלטפורמת ההקמה
שינוי המדפסת התבסס על מדפסת HP Deskjet 500 תרמית הזרקת דיו ו-HP 51626a מחסנית דיו שחורה.
- הסר את מכסה הפלסטיק העליון של המדפסת ובזהירות לנתק את לוח הבקרה מהכיסוי.
- לנתק את חיבורי כבלי 3 בין החלק העליון של המדפסת והבסיס. להסיר את החלק העליון של המדפסת מהבסיס.
- בחלק העליון של מדפסת, להסיר את הפלסטיק הקטן ואביזרי גומי (מערכת ניקוי ראש ההדפסה) בצד ימין מתחת למחסנית הדיו.
- הסר את בסיס מגש נייר עם קפיצים.
- הסר את הצלחת מתכתית המכסה את בר הזנת נייר הפלסטיק.
- חותכים את שורת הזנת נייר הפלסטיק במיקום גלגל האכלת אמצע באמצעות יד ראתה או כלי חיתוך אחרים.
- הסר את 2 גלגלי הזנת נייר נחשפו לאחר השלב הקודם. פלסטיק הגלגל הוא מאוד קשה ואלקטרונימסור יהיה מועיל.
- נקה את האבק והפסולת באמצעות מגבוני אוויר ואתנול משומרים.
- צרף את החלק העליון של המדפסת לבסיס.
- UV לעקר את המדפסת הותאם לפחות 2 שעות בזרימה למינרית לפני השימוש.
- חותכים את הכובע של מחסנית דיו 51626a HP באמצעות יד ראתה או כלי חיתוך אחרים.
- רוקן את הדיו ולהסיר את המסנן שמכסה את המאגר גם התחתון של הסחוס.
- יש לשטוף את המחסנית ביסודיות באמצעות מים זורמים מברז.
- Ultrasonicate את המחסנית במי דה מיונן (DI) ל10 דקות כדי להסיר את הדיו שיורית.
- בדוק את המחסנית כדי לוודא שכל הדיו הוסר. יש לשטוף או לרסס את המחסנית ביסודיות עם אתנול 70% לעיקור, ואחריו מים די מעוקרים.
- הגדר את מנורת אולטרה סגול ארוך גל על פלטפורמת ההדפסה כדי לספק קיבולת photopolymerization בו זמנית.
- מודד את עוצמת קרינה בפלטפורמת ההדפסה באמצעות אור UVמטר. התאם את המרחק בין מנורת UV ופלטפורמת המדפסת כך העצמה בנושא ההדפסה היא בין 4-8 mW / 2 סנטימטר (כ 25 סנטימטר ממנורה לפלטפורמת המדפסת).
2. Bioink הכנה
- התרחבות הכונדרוציטים חד שכבתי
- צלחת 5 מיליון כונדרוציטים אנושיים לכל בקבוק תרבית רקמת T175 להרחבת תא בDulbeccos השתנה נשרים בינוניים (DMEM) בתוספת 10% נסיוב העגל ו1x פניצילין, סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG). תרבות תאים ב-C ° 37 עם אוויר humidified המכיל 5% CO 2. לשנות את התרבות בינונית כל 3 ימים עד שהבקבוק הוא נקודת המפגש 85%. להשתמש בתאים מאותו הקטע.
- ממיסים PEGDA ב PBS לריכוז סופי של 10% w / נ הוספת photoinitiator I-2959 לריכוז סופי של 0.05% w / נ סנן לעקר את הפתרון.
- להשעות כונדרוציטים אנושיים בתרבית בפתרון PEGDA מוכנה ב5 x 10 6 תאים / מיליליטר.
3. הדפסת רקמת סחוס
- הפעל את המדפסת ואת המחשב הנייד.
- ליצור דפוס הדפסה של עיגול מלא עם 4 מ"מ קוטר באמצעות Microsoft Word או Adobe Photoshop.
- להתאים את המיקום של הדפוס ולוודא שהוא יודפס בדיוק לתוך תבנית הפלסטיק.
- לחשב את מספר ההדפסות הנדרשות כדי להגיע לעובי הרצוי של פיגום. ל4 מ"מ גובה, 220 הדפסים נדרשים כדי ליצור את הפיגום הרצוי.
- טען את bioink למחסנית הדיו. כסה את המחסנית עם נייר אלומיניום כדי להגן מהחשיפה לקרינת UV הישירה בעת הדפסה.
- שלח פקודת ההדפסה למדפסת. משוך את חיישן נייר כאשר המדפסת מתחילה להדפיס. תהליך ההדפסה כולו צריך לקחת פחות מ 4 דקות לפיגום עם 4 מ"מ בקוטר 4 מ"מ בגובה.
- העברה מודפסת neocartilage לצלחת 24 היטב ומוסיפה מדיום תרבות 1.5 מיליליטר היטב כל אחד.
s = "jove_title"> 4. הערכת כדאיויות תא ב3D פיגום
- דגירה neocartilage המודפסת בפתרון LIVE / DEAD הכדאיות / Cytotoxicity עובד בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות בחושך.
- חותכים את הידרוג'ל התא עמוס במחצית ולקחת תמונות ניאון של אזור החיתוך.
- רוזן חיים (ירוק) ותאים מתים (אדום) על ידי משקיף סנוור בחמש תמונות אקראית שנלקחו. חישוב כדאיות תא על ידי חלוקת מספר תאי חיים במספר הכולל של תאי חיים ומתים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדפסת הזרקת דיו התרמית שונה הייתה מסוגלת לתא ותצהיר פיגום בתפוקה גבוהה וכדאיויות תא מצוינות. שילוב עם photopolymerization בו זמנית וחומרים ביולוגיים רגישים, בטכנולוגיה זו היא מסוגלת לתקן את התאים וחומרים מודפסים אחרים למקומות בם הופקדו. על פי המאפיינים של מדפסת הזרקת דיו תרמית שונה, רזולוציית הדפסת 2D הייתה 300 dpi עם אחת טיפת דיו נפח 130 pl. ישנן 50 חרירי ירי בכל ראש הדפסה בתדירות ירי 3.6 קילוהרץ 12,13. לכן למבנה מייצג של 4 מ"מ קוטר וגובה 4 מ"מ, הנפח ועובי של כל שכבה מודפסת במהלך בניית שכבה אחר שכבה היו 0.23 μl ו18 מיקרומטר, בהתאמה. תהליך ההדפסה כולו לקח פחות מ 4 דקות לבניית רקמת הסחוס (איור 1).
איור 2 א מראה אפילו חלוקת תא של prinטד כונדרוציטים בפיגום 3D בשל photopolymerization סימולטני של הפיגום המקיף את התא בתצהיר. לעומת זאת, בלי photopolymerization בו זמנית (polymerized פיגום לאחר זריעת תאים), התאים שהופקדו שקעו לקרקעית או ממשק האזורים במקום בתחילה הופקדו במקומותיהם בשל כוח הכבידה (איור 2). הצטברות תאים זו נצפתה גם בדוחות קודמים של ייצור הידני של 14,15 רקמת סחוס. כונדרוציטים האנושיים המודפסים בהידרוג'ל 3D PEG התאוששו פנוטיפ chondrogenic והפגינו ייצור proteoglycan גדל בהדרגה במהלך התרבות (איור 3) 3.
איור 1. מודפס רקמת neocartilage. א) סכמטי של bioprinting סחוס עם photopolymerization בו זמנית ולהניחרקמת neocartilage הרכבה. ER-by-שכבת B) מודפסת עם 4 מ"מ בקוטר 4 מ"מ בגובה. בר סולם = 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. כונדרוציטים שכותרתו עם צבעי ניאון ירוקים וכתומים הוכיחו את כדאיות bioprinting סחוס האזורים. א) תאים מודפסים המשיכו להחזיק בעמדותיהם הופקדו בהידרוג'ל 3D. תהליך ההדפסה וphotopolymerization הושלם בדקות 4 עם כדאיות תא של 90% (n = 3). B) תאים שנצברו עד לתחתית או הממשק בשל כוח הכבידה מבלי photopolymerization בו זמנית. זה לקח 10 דקות של חשיפה לקרינת UV לג'ל לבנות עם אותו הגודל של עם כדאיות תא של63% (n = 3). ברים סולם = 100 מיקרומטר.
איור 3. מכתים Safranin-O של כונדרוציטים מודפסים במופעי הידרוג'ל PEG גדל ייצור proteoglycan במהלך התרבות. ברים סולם = 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת bioprinting זה 3D עם קיבולת photopolymerization בו זמנית מספקת רזולוציית הדפסה גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר בשיטה שדווחה בעבר הטובה ביותר של בהדפסה באתרו של מומי osteochondral באמצעות מזרק נמתחים הידרוג'ל אלגינט סלולארי 16. רזולוציית הדפסה גבוהה היא קריטית במיוחד עבור הנדסת רקמות סחוס כדי לשחזר את ארגון אזורי הסחוס אנטומיים. photopolymerization סימולטני בזמן ההרכבה שכבה אחר שכבה הוא חיוני כדי לשמור על תצהיר מדויק של תאים ופיגומים ביולוגי לבניית 3D. Microfabrication עם כל שכבה מודפסת גם הביא למעברי חלקים בין שכבות האזורים, למזער את הפוטנציאל להידרדרות בשל delamination. על ידי דווקא התאמת פרמטרי bioprinting והרכיבים של bioink, נוכל לפברק את מבני 3D המורכבים הנדרשים כדי לרפא מגוון רחב של נגעי סחוס.
עם סייןגירוי גורם גדילת rgistic, neocartilage bioprinted היה פנוטיפ chondrogenic הטוב ביותר ורוב התפשטות תאי 3. לכן, צפיפות זריעת תאים המשמשת במחקר זה, שהוא ריאלי עבור bioprinting, הוא גם אידיאלית להתחדשות סחוס כאשר טופלו בגורמי גדילה מתאימים. תיקון סחוס באמצעות כונדרוציטים עצמיים מוגבל מאוד ביישומים קליניים בשל המספר המוגבל של כונדרוציטים שנקטפו בביופסיה. השתלת כונדרוציטים שנקטפו ישירות עצמיים או תאי גזע mesenchymal (MSCs) יחד עם חומרים ביולוגיים לתיקון סחוס ללא הרחבת monolayer היא מאוד אטרקטיבית. לכן, זה הוא קריטי כדי להרחיב את המספרים הסלולריים המודפסים לצפיפות תאים האופטימלית הנדרשת להיווצרות סחוס מבלי להתפשר על האיכות של מטריקס הסחוס נתן המספרים הסלולריים מוגבלים. יתר על כן, הגבלת צפיפות תאים ראשונית יהיה לייעל באופן משמעותי ולהגדיל את הרזולוציה bioprinting. לפיכך, bioprinשיטת הטבעת המתוארת כאן היא תואמת באופן מלא עם המספרים הסלולריים נמוכים בהגדרה קלינית ויש לו הפוטנציאל לשמש להנדסת רקמות סחוס.
לסיכום, העבודה שלנו מוכיחה את ההיתכנות של בודה מבני סחוס אנטומיים על ידי אספקת כונדרוציטים וחומרי פיגום ביולוגי לעמדות ממוקדות מדויקות. הידרוג'ל PEG עם כונדרוציטים אנושיים bioprinted ברציפות, באמצעות אסיפת שכבה אחר שכבה. photopolymerization סימולטני נשמר תאים המודפסים בעמדות שהופקדו הראשוניות שלהם והקטין phototoxicity. תאים בneocartilage המודפס נשמרו הפנוטיפ chondrogenic עם ביטוי גנים עקבי ואנליזה ביוכימית 2. לכן, טכנולוגיה זו היא מראש מבטיחה להנדסת רקמות סחוס אנטומיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים אין אינטרס כלכלי במחקר זה.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את התמיכה מניו יורק אזור קפיטל אליאנס מענק המחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
