Summary
Los métodos descritos en este artículo muestran cómo convertir una impresora de inyección de tinta comercial en un bioprinter con la polimerización UV simultánea. La impresora es capaz de construir la estructura del tejido 3D con células y biomateriales. El estudio ha demostrado aquí construyó un neocartílago 3D.
Abstract
Bioprinting, que se basa en la impresión de inyección de tinta térmica, es una de las más atractivas tecnologías facilitadoras en el campo de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Con las células de control digital, andamios, y factores de crecimiento pueden ser depositados precisamente a la de dos dimensiones (2D) deseado y ubicaciones (3D) tridimensionales rápidamente. Por lo tanto, esta tecnología es un enfoque ideal para la fabricación de tejidos que imitan sus estructuras anatómicas nativas. Con el fin de diseñar el cartílago con la organización nativa zonal, composición de la matriz extracelular (ECM), y las propiedades mecánicas, hemos desarrollado una plataforma bioprinting usando una impresora de inyección de tinta comercial con fotopolimerización simultánea capaz para la ingeniería de tejido cartilaginoso 3D. Condrocitos humanos en suspensión en poli (etilenglicol) diacrilato (PEGDA) se imprimieron para la construcción neocartílago 3D mediante el conjunto de capa por capa. Las células fueron fijadas impresos en sus posiciones originales depositados, apoyado por el entorUnding andamio en la fotopolimerización simultánea. Las propiedades mecánicas del tejido impreso fueron similares al cartílago nativo. En comparación con la fabricación de tejidos convencional, que requiere la exposición a UV más larga, la viabilidad de las células impresos con fotopolimerización simultánea fue significativamente mayor. Neocartílago Impreso demostró una excelente glicosaminoglicano (GAG) y la producción de colágeno de tipo II, que era consistente con la expresión de genes. Por lo tanto, esta plataforma es ideal para la distribución de células exacta y la disposición para la ingeniería de tejidos anatómica.
Introduction
Bioprinting basa en la impresión de inyección de tinta térmica es una de las tecnologías que permiten más prometedores en el campo de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Con cabezales de impresión de control digital y de alto rendimiento factores de células, andamios, y crecimiento pueden ser depositados precisamente a la de dos dimensiones (2D) deseado y posiciones (3D) tridimensionales rápidamente. Muchas aplicaciones exitosas se han cumplido con esta tecnología en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa 1-9. En este trabajo, una plataforma bioprinting se estableció con una impresora Deskjet modificado Hewlett-Packard (HP) 500 térmica de inyección de tinta y un sistema de fotopolimerización simultánea. Hidrogeles sintéticos formulados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) han mostrado la capacidad de mantener la viabilidad de los condrocitos y promover la producción de ECM condrogénica 10,11. Además, fotorreticulable PEG es altamente soluble en agua con baja viscosidad, lo que lo hace ideal para polyme simultánearización durante bioprinting 3D. En este trabajo, los condrocitos humanos en suspensión en el poli (etileno) diacrilato (PEGDA; MW 3400) se imprimieron precisamente para construir capa-por-capa neocartílago con 1400 dpi de resolución en 3D. Se observó la distribución homogénea de células depositadas en un andamio 3D, que generó tejido de cartílago con excelentes propiedades mecánicas y la mejora de la producción de ECM. Por el contrario, en la fabricación manual de las células acumuladas en la parte inferior del gel en lugar de sus posiciones depositados inicialmente debido a la polimerización de andamio más lenta, lo que condujo a la formación de cartílago no homogénea después de la cultura 2,3.
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Protocol
1. Bioprinting Plataforma Establecimiento
La modificación de la impresora se basa en una impresora de inyección de tinta térmica HP Deskjet 500 y HP 51626A cartucho de tinta de color negro.
- Retire la tapa de plástico encima de la impresora y cuidadosamente extraiga el panel de control de la cubierta.
- Desconecte las conexiones de los cables entre 3 la parte superior de la impresora y la base. Quite la parte superior de la impresora desde la base.
- En la parte superior de la impresora, retire la pequeña de plástico y accesorios de goma (sistema de limpieza del cabezal de impresión) en el lado derecho debajo del cartucho de tinta.
- Quite la base de la bandeja de papel con resortes.
- Retire la placa metálica que cubre la barra de alimentación de papel de plástico.
- Cortar la barra de alimentación de papel de plástico en la posición de la rueda de alimentación medio usando una sierra de mano u otra herramienta de corte.
- Retire las 2 ruedas de alimentación de papel expuestos después de la etapa anterior. El plástico de la rueda es muy duro y un sistema electrónicosierra será útil.
- Limpie el polvo y los escombros de utilizar paños de aire y etanol en conserva.
- Coloque la parte superior de la impresora a la base.
- UV esterilizar la impresora modificado durante al menos 2 horas en una campana de flujo laminar antes de usar.
- Cortar la tapa de un cartucho de tinta HP 51626A utilizando una sierra de mano u otra herramienta de corte.
- Vaciar la tinta y retire el filtro que cubre el depósito del fondo del pozo del cartílago.
- Enjuague el cartucho a fondo con agua corriente del grifo.
- Ultrasonicate el cartucho en desionizada (DI) durante 10 min para eliminar la tinta residual.
- Examine el cartucho para asegurarse de que toda la tinta se ha eliminado. Enjuague o rociar el cartucho a fondo con etanol al 70% para la esterilización, seguido de agua DI esterilizada.
- Configurar una lámpara de luz ultravioleta de onda larga sobre la plataforma de impresión para proporcionar una capacidad de fotopolimerización simultánea.
- Medir la intensidad de los rayos UV en la plataforma de impresión usando una luz UVmetro. Ajustar la distancia entre la lámpara UV y la plataforma de la impresora de modo que la intensidad de impresión en el sujeto está entre 4-8 mW / cm 2 (aproximadamente 25 cm desde la lámpara a la plataforma de la impresora).
2. Preparación Bioink
- Expansión de condrocitos monocapa
- Placa de 5 millones de condrocitos humanos en cada matraz de cultivo de tejido T175 para la expansión de células en Dulbecco Modificado Eagles Medium (DMEM) complementado con 10% de suero de ternera y 1x de penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG). Células de cultivo a 37 ° C con aire humidificado contiene 5% de CO 2. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días hasta que el matraz es 85% de confluencia. Utilice células de la misma pasaje.
- Disolver PEGDA en PBS a una concentración final de 10% w / v Añadir fotoiniciador I-2959 a una concentración final de 0,05% w / v Filtrar esterilizar la solución.
- Suspender los condrocitos humanos cultivados en la solución PEGDA preparado a 5 x 10 6 células /ml.
3. El cartílago de tejido de impresión
- Encienda la impresora y el ordenador portátil.
- Crear un patrón de impresión de un círculo sólido con 4 mm de diámetro utilizando Microsoft Word o Adobe Photoshop.
- Ajuste la posición del patrón y asegúrese de que se imprimirá exactamente en el molde de plástico.
- Calcular el número de copias necesarias para alcanzar el espesor deseado del andamio. Para 4 mm de altura, se requieren 220 impresiones para crear el andamio deseado.
- Cargue el bioink en el cartucho de tinta. Cubra el cartucho con papel de aluminio para protegerlo de la exposición directa del sol durante la impresión.
- Enviar comando de impresión a la impresora. Tire del sensor de papel cuando la impresora comienza a imprimir. El proceso de impresión de conjunto debería tomar menos de 4 minutos para un andamio con 4 mm de diámetro y 4 mm de altura.
- Transferencia impreso neocartílago a una placa de 24 pocillos y añadir 1,5 ml de medio de cultivo a cada pocillo.
- Incubar la neocartílago impreso en solución VIVO / DEAD viabilidad / citotoxicidad de trabajo a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad.
- Cortar el hidrogel de células cargadas por la mitad y tomar imágenes fluorescentes de la zona de corte.
- Cuente en vivo las células muertas (rojo) (verde) y por un observador ciego a los cinco imágenes tomadas al azar. Calcular la viabilidad celular mediante la división del número de células vivas por el número total de células vivas y muertas.
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Representative Results
La impresora de inyección de tinta térmica modificado era capaz de celular y la deposición de andamio con un alto rendimiento y una excelente viabilidad celular. La combinación con la fotopolimerización simultánea y biomateriales fotosensibles, esta tecnología es capaz de fijar las células y otras sustancias impresos a los lugares depositados inicialmente. De acuerdo con las propiedades de la impresora de inyección de tinta térmica modificada, la resolución de impresión de 300 dpi 2D con un solo volumen de gotas de tinta de 130 pl. Hay 50 boquillas de descarga en cada cabezal de impresión con frecuencia de disparo de 3,6 kHz 12,13. Por lo tanto para una construcción representativa de 4 mm de diámetro y 4 mm de altura, el volumen y el espesor de cada capa impresa durante la construcción capa por capa eran 0,23 l y 18 micras, respectivamente. El proceso de impresión de toda tardó menos de 4 min para construir el tejido de cartílago (Figura 1).
Figura 2A muestra una distribución de células, incluso de principiosted condrocitos en andamio 3D por fotopolimerización simultánea del andamio que rodea durante la deposición celular. Por el contrario, sin fotopolimerización simultánea (polimerizado andamio después de la siembra de células), las células depositadas se hundieron al fondo o interfaz de zona en lugar de sus ubicaciones depositados inicialmente debido a la gravedad (Figura 2B). Esta acumulación de células también se observó en los informes anteriores de la fabricación manual de los cartílagos 14,15 tejidos. Los condrocitos humanos impresos en 3D PEG hidrogel recuperaron fenotipo condrogénico y demostraron aumentado gradualmente la producción de proteoglicanos durante el cultivo (Figura 3) 3.
Figura 1. Impreso tejido neocartílago. A) Esquema de bioprinting cartílago con fotopolimerización simultánea y sentartejido neocartílago ER-por-capa de ensamblaje. B) Un impreso con 4 mm de diámetro y 4 mm de altura. Barra de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Condrocitos marcados con colorantes fluorescentes verdes y naranjas demostró que el cartílago zonal bioprinting viabilidad. A) células impresos mantuvieron sus posiciones depositados inicialmente en el hidrogel 3D. El proceso de impresión y la fotopolimerización completó en 4 minutos con la viabilidad celular de 90% (n = 3). B) Las células acumuladas en la parte inferior o de la interfaz debido a la gravedad y sin fotopolimerización simultánea. Se tomó 10 min de exposición a UV para gelificar el constructo con el mismo tamaño de A con una viabilidad celular de63% (n = 3). Las barras de escala = 100 m.
Figura 3. Tinción de safranina-O de los condrocitos impreso en espectáculos de hidrogel de PEG aumentó la producción de proteoglicanos durante el cultivo. Las barras de escala = 100 micras.
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Discussion
Este sistema bioprinting 3D con capacidad de fotopolimerización simultánea proporciona una significativamente mayor resolución de impresión que el mejor método descrito de esta en la impresión in situ de los defectos osteocondrales utilizando jeringa extruido un hidrogel de alginato celular 16. Una mayor resolución de impresión es particularmente crítico para la ingeniería de tejidos de cartílago para restaurar la organización zonal cartílago anatómica. Fotopolimerización simultánea durante el ensamblaje capa por capa es crucial para mantener la deposición precisa de las células y biomateriales para la construcción 3D. Microfabricación con cada capa impresa también dio lugar a una suave transición entre las capas de zona, minimizando el potencial de degradación debido a la delaminación. Mediante el ajuste de los parámetros de precisión y componentes de la bioink bioprinting, seremos capaces de fabricar las complejas estructuras 3D requerida para curar una amplia variedad de lesiones del cartílago.
Con synela estimulación del factor de crecimiento rgistic, el neocartílago bioprinted tenía la mejor fenotipo condrogénico y más proliferación celular 3. Por lo tanto, la densidad de la siembra de células utilizado en este estudio, que es factible para bioprinting, también es ideal para la regeneración del cartílago cuando se tratan con factores de crecimiento apropiados. La reparación del cartílago utilizando condrocitos autólogos se limita en gran medida en aplicaciones clínicas debido al número limitado de condrocitos cosechadas en la biopsia. La implantación de los condrocitos autólogos directamente cosechados o células madre mesenquimales (MSC), junto con biomateriales para la reparación del cartílago sin expansión monocapa es sumamente atractivo. Por lo tanto, es crítico para expandir el número de células impresos a la densidad celular óptima requerida para la formación de cartílago sin comprometer la calidad de la matriz del cartílago dado el número de células limitados. Además, la limitación de la densidad celular inicial optimizar en gran medida y maximizar la resolución bioprinting. Por lo tanto, la bioprinting método descrito aquí es totalmente compatible con los números bajos de células en ámbito clínico y tiene el potencial de ser utilizado para la ingeniería de tejido cartilaginoso.
En conclusión, nuestro trabajo demuestra la viabilidad de la fabricación de las estructuras anatómicas del cartílago mediante la entrega de los condrocitos y materiales de andamios biomaterial a posiciones específicas precisas. Un hidrogel de PEG con condrocitos humanos se bioprinted continuamente a través del conjunto de capa por capa. Fotopolimerización simultánea mantiene las células impresas en sus posiciones iniciales depositadas y redujo la fototoxicidad. Las células en el neocartílago impreso mantienen el fenotipo condrogénico con la expresión de genes consistente y análisis bioquímico 2. Por lo tanto, esta tecnología es un avance prometedor para anatómica ingeniería de tejido de cartílago.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún interés financiero en este estudio.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo de la Nueva York Capital Region Research Alliance Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
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