Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51415
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

Summary

يتم تشغيل الدفاعات الفطرية للعدوى الفيروس عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير). وهما خنازير حشوية RIG-I وPKR ربط إلى الرنا الفيروسي التوقيع، وتغير التشكل، oligomerize، وتفعيل الإشارات المضادة للفيروسات. يتم وصف الأساليب التي تسمح لرصد ملائم تبديل متعلق بتكوين وoligomerization هذه خنازير حشوية.

Abstract

دفاعات المضيف لعدوى فيروس تعتمد على الكشف السريع عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) من نظام المناعة الفطري. في السيتوبلازم، وخنازير RIG-I وPKR ربط إلى بروابط محددة RNA الفيروسي. هذا يتوسط أول تبديل متعلق بتكوين وoligomerization، ومن ثم تمكن من تفعيل استجابة للفيروسات المضادة للفيروسات. في حين وضعت أساليب لقياس التعبير الجيني للفيروسات المضيف بشكل جيد، وأساليب لمراقبة مباشرة للدول تفعيل RIG-I وPKR هي إلا جزئيا وأقل راسخة.

هنا، نحن تصف طريقتين لرصد RIG-I وPKR التحفيز على العدوى مع محفز مضاد للفيروسات المعمول بها، فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13). محدودة التربسين الهضم يسمح لتحليل التغيرات في حساسية الأنزيم البروتيني، مشيرا إلى التغييرات متعلق بتكوين جزئي للخنازير. التربسين هضم لست] من خلايا وهمية نتائج المصابة في التحلل السريع من RIG-I وPKR، whereaق الكلورين العدوى 13 يؤدي إلى ظهور مقاومة للالبروتيني RIG-I الجزء. أيضا PKR يظهر المقاومة التي يسببها فيروس جزئية لعملية الهضم التربسين، والذي يتزامن مع الفسفرة السمة المميزة لها في الثريونين 446. تشكيل RIG-I وجرى التحقق من الأوليغومرات PKR من قبل الأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). على العدوى، وهناك تراكم قوية من RIG-I والمجمعات من oligomeric PKR، في حين ظلت هذه البروتينات كما مونومرات في عينات المصابة وهمية.

محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم، إلى جانب كل من لتحليل لطخة غربية، تسمح لقياس حساسية ومباشرة من خطوتين متنوعة من RIG-I وتفعيل PKR. هذه التقنيات هي سهلة نسبيا وسريعة لأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن.

Introduction

A حدثا هاما في الدفاع المضيف المضادة للفيروسات هو الكشف السريع عن مسببات المرض عن طريق ما يسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 1،2. الكشف عن الخلايا من عدوى فيروس الحمض النووي الريبي يعتمد على اثنين من helicases الحمض النووي الريبي حشوية، RIG-I (حمض الريتينويك الجينات محرض I) وMDA5 (ميلانوما التمايز بروتين يرتبط 5) 3-5. ويتكون RIG-I اثنين من المجالات N-محطة التوظيف كاسباس (بطاقات)، وهو نوع المركزية دتش مربع RNA helicase المجال، ومجال-C محطة (CTD) 4،6. في حين يطلب من CTD والمجال helicase للاعتراف غير المتمتعة بالحكم الذاتي (الفيروسية) الرنا، وبطاقات توسط إشارات المصب مما يؤدي إلى إنشاء حالة المضيف المضادة للفيروسات.

إذا RIG-I في حالة صامتة، أي في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي يجند محددة، يتفاعل البطاقة الثانية مع المجال helicase المركزية ويحتفظ RIG-I في السيارات المثبطة التشكل 7-11. RIG-I بربط قصيرة المزدوجحبلا (س) RNA تحمل 5'-ثلاثي الفوسفات (5'PPP)، طويلة الرنا المزدوج الجديلة، والجيش الملكي النيبالي polyU / UC-الغنية، والهياكل التوقيع الكلاسيكية التي هي موجودة على الجينوم من العديد من الفيروسات RNA 12-16. اثنين من الخصائص الرئيسية لتفعيل RIG-I هي التحول إلى التشكل مغلقة 6،17 وهومو oligomerization 6،18،19. مفتاح بتكوين يعزز الحمض النووي الريبي ملزمة، يعرض بطاقات للإشارات المصب، وreconstitutes موقع أتباز نشطة 8،9،11،20. تشكيل المجمعات RIG-I من oligomeric يؤدي إلى تعزيز توظيف المصب جزيئات محول الإشارات لتشكيل منبر للفيروسات نقل الإشارة 11. سلسلة إشارات RIG-I-تنظيم ينشط في نهاية المطاف عامل النسخ IRF-3 لمدة تصل التنظيم من الانترفيرون (IFN-alpha/beta) الجينات وبالتالي التعبير الجيني للفيروسات حفزت الجينات (ISGS) للاستجابة للفيروسات الكامل 21،22 . واحدة من أفضل ISGS تتميز البروتينات هو تنشيط الحمض النووي الريبين كيناز (PKR) 23. PKR ينتمي إلى عائلة حقيقية النواة ترجمة الشروع عامل ألفا 2 (eIF2α) تحركات ويتكون من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة المجال-N محطة وكيناز C نطاق المحطة. يشكل المجال كيناز واجهة dimerization حاسمة لتفعيل PKR وينفذ وظائف الحفاز للبروتين. ملزمة من PKR لالرنا المزدوج الجديلة الفيروسية يؤدي إلى تغيير موقفها والسماح بتكوين dimerization وصناعة السيارات في الفسفرة في الثريونين 446 بين المخلفات الأخرى. PKR ثم يتوسط الفسفرة من eIF2α، وبالتالي عرقلة ترجمة الفيروسية mRNAs و23-27.

كلا RIG-I وPKR الخضوع لإعادة ترتيب هيكلية رئيسية، شكل مجمعات من oligomeric وتكون بعد translationally تعديلها من قبل الفسفرة / نزع الفسفات وubiquitination 10،11،19،23،24،26-29. من أجل فهم أفضل منها هياكل الحمض النووي الريبي الفيروسي يتم تفعيل RIG-I وPKR (وفي أي مرحلة مضادات فيروسية يمكن أن به التدخل)، من المهم أن تحدد بدقة حالة التنشيط. لكل من خنازير تم وصفها سابقا أن التنشيط يؤدي إلى ظهور مقاومة للشظايا البروتين التربسين 6،17،30 والعليا الأوليغومرات 6،18،19. ومع ذلك، وبالنظر إلى ثروة من الأدب على هذه العوامل الرئيسية للاستجابة للفيروسات المضيف 1،2،24، وتطبيق أساليب مباشرة يبدو نادرة نسبيا. أملا في تحفيز استخدام أوسع، ونحن نقدم بروتوكولات مريحة وحساسة لتحليل بقوة الدول تفعيل RIG-I وPKR. إصابة الإنترفيرون المختصة خط الخلية البشرية A549 مع المنشط أنشئت من RIG-I وPKR، والموهن فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13) 31،32. بعد إجراء lysing بسيطة، يتم اختبار مقتطفات من الخلايا المصابة بواسطة محدودة التربسين الهضم / تحليل لطخة غربية لتقييم التحول متعلق بتكوين جزئي، والأزرق الأصلي هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) / analys طخة غربيةهو قياس تشكيل الأوليغومرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. البذر من خلايا A549 للعدوى

  1. زراعة قارورة T75 الخلايا A549 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM تستكمل مع FCS 10٪، 526.6 ملغم / لتر L-الجلوتامين، 50.000 U / البنسلين لتر، و 50 ملغ / لتر الستربتوميسين).
  2. قبل البدء في حصاد الخلايا، خلية الاحماء مستنبت، برنامج تلفزيوني و0.05٪ التربسين EDTA-في بالحمام المائي تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
  3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل PBS. إزالة برنامج تلفزيوني مرة أخرى.
  4. إضافة 3 مل من التربسين EDTA-وتوزيعها على قدم المساواة في القارورة. نقل القارورة في حاضنة مع 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. عندما يتم فصل كل الخلايا، إضافة 7 مل من مستنبت الخلية، resuspend الخلايا، ونقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل الصقر.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT، وإزالة طاف و resuspend بيليه في 10 مل الطازجة مستنبت الخلية.
  7. عد الخلايا مع غرفة الفرز.
  8. إضافة 2.5 × 10 6 خلايا في 5 مل من مستنبت الخلية في اثنين من قوارير T25 لكل منهما. احتضان لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. يخدم احد قارورة لمراقبة وهمية واحدة للعدوى الكلورين 13.

2. العدوى مع فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ 13 (الكلورين 13)

  1. ملاحظة: CL 13 هو متحولة الفيروس الموهن في ألمانيا والتي يمكن التعامل معها في ظل الظروف BSL-2. يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية الوطنية ذات الصلة. سوف محرضات أخرى الإنترفيرون نموذجي يكون فيروس سينداي (سلالة Cantell) أو فيروس مرض نيوكاسل.
  2. قبل دافئ PBS، خالية من مصل المتوسطة، ومستنبت الخلية تحتوي على 5٪ FCS.
  3. إعداد 1.25 × 10 7 PFU / مل من الكلور 13 في المصل خالية المتوسطة لتصيب 2.5 × 10 6 خلايا A549 مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 5. إعداد المبلغ قليلا (حوالي 10٪) أكبر من الحاجة لحساب أخطاء ماصة.
  4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح تحت 1.3.
  5. إضافة 1 مل من التخفيف الكلورين أو 13من المصل خالية المتوسطة (مراقبة غير مصاب، وهمية) إلى الخلايا، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. نقل قارورة بعناية كل 15 دقيقة لضمان التوزيع العادل للكلور 13 التخفيف وخالية من مصل المتوسطة، على التوالي.
  6. بعد 1 ساعة من العدوى، وإزالة قائح، إضافة 5 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة الخلية مع 5٪ FCS، واحتضان لمدة 5 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. إعداد الخلية لست]

  1. إعداد برنامج تلفزيوني / 0.5٪ تريتون X-100 على 4 درجات مئوية. لا تقم بإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني سيرين.
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني جديد.
  3. تتخلص الخلايا قبالة، ونقل تعليق الخلية في أنبوب الصقر، وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  4. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 30 ميكرولتر PBS / 0.5٪ تريتون X-100. نقل المحللة إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة واحتضان لمدة لا تقل عن 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 10.000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل المحللة خلية أوضح (طاف) في أنبوب جديد.
  6. تحديد تركيز البروتين مقايسة برادفورد كما هو موضح في مكان آخر 33.
  7. تخزينها في -20 درجة مئوية أو الشروع في عملية الهضم التربسين (4.1) أو PAGE الأصلي (5.1).

4. تحديد بتكوين جزئي التغييرات من التعرف على الأنماط مستقبلات

  1. علاج TPCK-التربسين من الخلية لست]
    1. تمييع L-1-tosylamido-2-الفنيل كيتون كلوروميثيل المعالجة (TPCK) التربسين في برنامج تلفزيوني إلى تركيز العمل النهائية من 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
    2. ضبط في اثنين من أنابيب جديدة لتركيز البروتين النهائي من 25 ميكروغرام لكل المحللة البروتين (وهمية أو كلور 13) في الحجم النهائي من 9 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني. وبالتالي، ينبغي أن يكون أربعة أنابيب مع 25 ميكروغرام لكل المحللة، مرتين وهمية والكلورين مرتين العدوى 13. مجموعة واحدة كما مراقبة المدخلات (غير المعالجة) ومجموعة واحدة لتلقي العلاج مع TPCK-التربسين.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (غير المعالجة)أو 1 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / ميكرولتر TPCK-التربسين (تركيز النهائي: 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى الخلية لست وتخلط ردود الفعل من قبل pipetting. لا تجمد وذوبان الجليد مأخوذة-TPCK التربسين، لأنها سوف تؤثر سلبا على كفاءة الهضم.
    4. احتضان لست] عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. وقف رد الفعل بإضافة 5X تغيير طبيعة عينة العازلة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10٪ SDS، الجلسرين 50٪، 25٪ β-المركابتويثانول، و 0.5٪ برومفينول الأزرق) والمغلي لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. من المهم أن لا تمديد الوقت التربسين الحضانة. في حالة أي مقاومة للشظايا البروتيني قابلة للكشف، يجب تقصير وقت التربسين الهضم.
    5. بعد الغليان، ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
  2. SDS بولي أكريلاميد جل الكهربائي (PAGE) والغربية التنشيف
    1. تحميل العينات على كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) هلام بولي أكريلاميد تحتوي على التراص 5٪ على مدى هلام حل 12٪. فصل البروتينات في 25 مللي أمبير في هلام حتىالأزرق برومفينول تنفد.
    2. تنشيط الغشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF) لمدة 30 ثانية مع الميثانول ووضعها في نقل العازلة (48 ملي تريس، 39 ملي glycin، 1.3 ملي SDS، 20٪ الميثانول).
    3. إعداد النشاف مع نظام النشاف شبه الجافة والسماح بنقل البروتينات في 10 V لمدة 1 ساعة. اتخاذ غشاء بها، شطفه بالماء لفترة وجيزة، واتركها لتجف.
    4. تنشيط الغشاء عن طريق نقل قريبا في الميثانول. يغسل لمدة 5 دقائق مع TBS. منع 10٪ مع الحليب الخالي من الدسم في TBS لمدة 1 ساعة على RT أو عند 4 درجة CO / N. غسل 3X الغشاء لمدة 5 دقائق مع كل TBS.
    5. إعداد الأجسام المضادة التخفيف على النحو الموصى به في الجدول 1 واحتضان الغشاء لمدة 1 ساعة على RT أو عند 4 درجة CO / N.
    6. غسل 3X الغشاء لمدة 10 دقيقة مع كل TBS-T. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة إلى جانب الفجل البيروكسيداز في التخفيف 1:20،000 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS. احتضان 45 دقيقة في RT.
    7. غسل 3X الغشاء لمدة 10 دقيقة مع كل TBS-T، وسوقتا إضافيا مع شمال شرق TBS.
    8. للكشف عن إشارة استخدام عدة chemiluminescense التجارية ونظام التصوير الرقمي هلام.
  3. Coomassie بريليانت الأزرق G-250 تلطيخ
    1. أداء SDS-PAGE كما هو موضح في 4.2.1. تحميل عينات على هلام بولي أكريلاميد SDS وتشغيل هلام في هلام 25 مللي أمبير في حين يدير برومفينول الأزرق خارج.
    2. أداء Coomassie بريليانت الأزرق G-250 تلطيخ في RT. تفعل كل حضانات تحت الهز المستمر.
    3. نقل الجل على حل التثبيت تحتوي على 40٪ الميثانول وحامض الخليك 10٪ لمدة 30 دقيقة.
    4. تبادل المخزن المؤقت إلى حل destaining (25٪ من الإيثانول وحمض الخليك 8٪)، واحتضان لمدة 5 دقائق.
    5. وصمة عار الجل مع 0.2٪ Coomassie برلنت الأزرق G-250 في 40٪ الميثانول وحامض الخليك 10٪ لمدة 1 ساعة.
    6. يزيل اللون هلام مع الحل destaining وتبادل المخزن المؤقت بعد 10 دقيقة، 30 دقيقة، و 60 دقيقة.
    7. تخزين هلام في 25٪ من الإيثانول، حمض الخليك 8٪، و 4٪ الجلسرين في 4 درجات مئوية. أداء التصوير والتحليل كما هو موضح تحت 4.2.8.

5. تحليل من oligomeric دول التعرف على الأنماط مستقبلات

  1. الصفحة الأم
    1. إعداد 50 ميكروغرام من المحللة الخلية في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني وإضافة 5 × عازلة الأم العينة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 1٪ deoxycholate الصوديوم، و 50٪ الجلسرين، و 0.5٪ برومفينول الأزرق) إلى تركيز النهائي من 1X.
    2. تحميل عينات فورا على هلام بولي أكريلاميد الأصلي مع 5٪ كما التراص و 8٪ كما حل هلام. فإن أي تأخير يؤدي إلى فقدان المجمعات الأصلي 34.
    3. تشغيل هلام في هلام 20 مللي أمبير في الساعة 4 درجة مئوية مع 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9.0 هيدروكسيد الصوديوم، 384 ملي glycin مثل الأنود و 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.3، 384 ملي glycin، 1٪ deoxycholate الصوديوم كمادة عازلة الكاثود. بعد 1.5-2 ساعة (قد ترك برومفينول الفرقة الزرقاء جل ما يقرب من 45 دقيقة في وقت سابق) انتهاء الكهربائي.
  2. التنشيف الغربية
    1. تنشيط polyvinylidene الفلوريد (PVDF) الغشاء لمدة 30 ثانية مع الميثانول ووضعها في Towbin العازلة (25 ملي تريس، 192 ملي glycin، 0.1٪ SDS، 20٪ الميثانول).
    2. تجميع غرفة طخة الرطب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وملء خزان مع العازلة توين.
    3. أداء النشاف مع 250 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    4. عندما يتم الانتهاء من النشاف المضي قدما كما هو موضح من 4.2.3 جرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاعتراف ناهض الفيروسية من خلال سلفة-I أو مشغلات PKR تحويل متعلق بتكوين 6،17،30 6،18،27 وoligomerization. نحن يعاير هذه العلامات من قبل اثنين من تفعيل محدودة الهضم البروتيني والأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE)، على التوالي.

أصيب الخلايا A549 الإنسان مع استنساخ فيروس حمى الوادي المتصدع 13 (الكلورين 13)، الذي يتميز حدوث تحور في مستقبلات الإنترفيرون NSS 35،36. نظرا لعدم وجود وظيفية NSS، استنساخ 13 يدفع بقوة RIG-I وPKR، مما يؤدي إلى قيام دولة قوية مضادة للفيروسات في الخلايا 12،31،32،37.

التربسين هضم وهمية المصابة الخلية لست النتائج في تدهور السريع للRIG-I، في حين أن العدوى الكلورين 13 يؤدي إلى توليد 30 كيلو دالتون مقاومة RIG-I جزء الشكل 1A. أيضا PKR يظهر مقاومة جزئية لالتربسين الهضم في عينات المصابة، والذي يتزامن مع phosph لها orylation الشكل 1A. لمراقبة الكفاءة وخصوصية التربسين الهضم، وكانت ملطخة المواد الهلامية مع Coomassie بريليانت الأزرق G-250. تظهر العينات غير المعالجة كميات متساوية من البروتينات تحميل الشكل 1B. إخضاع 13 لست] خلية وهمية والكلورين إلى التربسين الهضم يؤدي إلى انخفاض مقارنة كميات البروتين العالمية. هذا يدل على أن العلاج التربسين له نفس الكفاءة لعينات 13 المصابة وهمية والكلورين.

كان يعاير تشكيل المجمعات من oligomeric في الصفحة الأصلية. في الخلايا غير المصابة، تم الكشف فقط مونومرات من RIG-I وPKR الشكل 2. كما تحكم إضافية أدرجنا عامل النسخ IRF-3، التي هي موجودة كما مونومر ولكن المعروف أن dimerize على تفعيل عبر مثل RIG-I 38. عدوى CL 13 يؤدي إلى تراكم قوية من المجمعات من oligomeric تلاعب أنا في شكل تشويه وPKR وIRF-3 dimers / الأوليغومرات باعتبارها الفرقة البروتين محددة.

الطبقة = "jove_content"> هذه النتائج تثبت أن محدودية الهضم التربسين وPAGE الأم هي أدوات مفيدة لرصد التغيرات متعلق بتكوين وتشكيل قليل وحدات من RIG-I وPKR على العدوى.

الشكل 1
الشكل 1. التبديل بتكوين جزئي من RIG-I وPKR. كانت خلايا A549 وهمية تستكمل المصاب أو المصابة مع الكلور 13 في وزارة الداخلية من 5. بعد 5 ساعة، و lysed الخلايا في برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ تريتون X-100 وتطهيرها لست] خلية كانت إما تركت دون علاج أو تعامل مع التربسين. وتعرض عينات لSDS PAGE تليها الغربية النشاف (A) أو تلطيخ Coomassie (B). كانت ملطخة البقع ضد RIG-I، PKR، PKR فسفرته (الثريونين 446) والبروتين النووي ضد RVFV (RVFV N) وبيتا الأكتين كما من العدوى ومكافحتها التحميل، على التوالي._blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
وتعرض الشكل 2. Oligomerization من RIG-I، PKR، وIRF-3. لست] خلية من الخلية لست] 13 المصابة وهمية والكلورين إلى الصفحة الأصلية تليها تحليل لطخة غربية. تم تنفيذ تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد RIG-I، PKR، IRF-3، وبيتا الأكتين عن السيطرة التحميل. على الأرجح تمثل الأوليغومرات PKR dimers 27. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الاستشعار عن وجود فيروسات وتفعيل نوع المضادة للفيروسات أنا الإنترفيرون النظام هي حاسمة لنجاح الاستجابات المناعية الفطرية 22. وبالتالي بوساطة الكشف عن الفيروس عن طريق المستقبلات الاعتراف الممرض (خنازير) مثل RIG-I وPKR، مما يتيح استجابة سريعة وتفعيل آليات الدفاع المضادة للفيروسات. هنا، نحن تصف طريقتين لتقييم الوضع مباشرة تفعيل RIG-I وPKR.

محدودة الهضم البروتيني كأداة لرصد التغيرات متعلق بتكوين جزئي من RIG-I وPKR وقد وصفت أول مرة من قبل مجموعات من M. غيل الابن وT. فوجيتا 6،17، وJL كول 30، على التوالي. أنه يمثل طريقة حساسة لتقييم التعديلات حساسية للعلاج التربسين التي تسببها التغيرات متعلق بتكوين. تطبيق التربسين الهضم، اكتشفنا التدهور السريع للRIG-I وPKR في عينات المصابة وهمية، في حين أن العلاج التربسين من الخلية لست المصابة بالفيروسات أدت إلى التربسين مقاومة شظايا RIG-I. Similآرلي، تم الكشف عن التربسين مقاومة PKR جزء على العدوى الكلورين 13. وقد رافق ذلك من خلال PKR الفسفرة في الثريونين 446، علامة تستخدم على نطاق واسع من التنشيط PKR. مقارنة التربسين هضم 13 الخلية لست وهمية والكلورين عن طريق تلطيخ Coomassie يوضح انخفاضا مقارنة مستويات البروتين العالمية. هذا يشير إلى أن تشكيل شظايا مقاومة محددة للبروتينات مثل RIG-I وPKR.

تم رصد تشكيل المجمعات من oligomeric من RIG-I، وPKR IRF-3 في الصفحة الأصلية. إخضاع الكلورين لست] الخلية المصابة إلى 13 PAGE الأم، اكتشفنا RIG-I، وPKR IRF-3 الأوليغومرات، في حين ظلت هذه البروتينات كما مونومرات في عينات المصابة وهمية. RIG-I يحتاج لتشكيل الأوليغومرات لتفعيل مسارات المصب. كان الافتراض بأن RIG-I oligomerization يدعم توظيف العوامل المساعدة لتشكيل منصة إشارات لآليات الاستجابة المضادة للفيروسات 11. لا يفهم وظيفة PKR dimerization تماما. على الأرجح، فإن PKمفارز R في ديمر الفوسفات كل 25 الأخرى. النوع الأول الإنترفيرون وينظم النظام بإحكام على المستوى النسخي، وIRF-3 يمثل أحد العوامل المركزية النسخ للتحريض الإنترفيرون وISGS 38. بصمات المركزية التنشيط هي الفسفرة، dimerization، وإزفاء إلى النواة، حيث تجند شارك في تفعيل P300 وملزم CREB البروتين (CBP) النسخي لبدء الإنترفيرون مرنا التوليف 21،39. تحليل IRF-3 dimerization هو أداة تستخدم على نطاق واسع لرصد تفعيل النوع الأول الإنترفيرون استجابة 38. لذلك، استخدمنا الكشف عن IRF-3 مجمعات من oligomeric كدليل على المبدأ لفحوصات oligomerization من RIG-I وPKR oligomerization. في الواقع، مما يسمح بفصل لست] البروتين في ظل ظروف غير تغيير طبيعة، تمكنا من الكشف عن IRF-3 dimerization في الكلورين 13 عينات المصابة.

مما لا شك فيه، سوف تحتاج إلى كل مختبر تحسين بروتوكولات محدودة DIGE البروتينيstion وPAGE الأصلية. إذا واجهت مع عدم وجود أي الكشف عن البروتينات مقاومة أو أجزاء كثيرة جدا مقاومة، يمكن للمرء أن تقصير أو إطالة وقت الهضم، على التوالي. يمكن أن يكون أيضا بسبب الاختلافات في الأوراق المالية TPCK التربسين محددة، والاستعدادات تختلف قليلا. لذلك، ينبغي اختبار مختلف تركيزات TPCK-التربسين لتعظيم الاستفادة. لست] خلية يمكن إعداد من خطوط الخلايا الأخرى من A549، ولكن قد تكون هناك حاجة التعديلات على البروتوكول. فمن المستحسن لضبط كمية البروتينات الكلية لعملية الهضم التربسين وPAGE الأم وفقا لمستوى التعبير عن بروتين من الفائدة في هذا النوع خلية معينة. علاوة على ذلك، يمكن الكشف محدودة أو الانفصال ضعف المجمعات من oligomeric في الصفحة الأم لديها العديد من الأسباب ويمكن معالجتها على النحو التالي: تأكد من أن يتم تنظيف المعدات لإزالة ما تبقى كلاء تغيير طبيعة، والحفاظ على جميع العينات والجل خلال PAGE في 4 درجات مئوية ، وليس لتمديد الوقت بين إعداد العينات ومبناهاقرع على هلام. كما تم توظيف محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم لمراقبة تفعيل هامة أخرى، PRR ترتبط ارتباطا وثيقا، MDA5 40-42. رصد تفعيل MDA5 المطلوبة ظروف تجريبية مختلفة مقارنة RIG-I وPKR، وبالتالي لم تدرج هنا.

باختصار، يتم عرض نقطة بنقطة بروتوكولات لطريقتين مفيدة وحساسة لقياس تفعيل RIG-I وPKR. محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم، إلى جانب كل من لتحليل لطخة غربية، ورصد التغيرات تصريح متعلق بتكوين وoligomerization، على التوالي. باستخدام هذه الأساليب، ونحن قد أظهرت في وقت سابق ان RIG-I يمكن تفعيلها من خلال nucleocapsids من مختلف فيروسات مباشرة بعد دخولهم إلى الخلايا 32.

الطبيعة الدقيقة وأصل الأنواع الحمض النووي الريبي ذات الصلة لRIG-I وPKR التنشيط في الخلايا المصابة لا تزال لم تحل تماما. علاوة على ذلك، العديد من الفيروسات تتداخل معوظائف خنازير من قبل مجموعة واسعة من استراتيجيات 12،43-46. التقنيات المعروضة تكبير الطيف من الأساليب من خلال السماح لقياس سهلة ومباشرة لRIG-I وتفعيل PKR، يسارعون إلى القيام بها، ولا تتطلب معدات باهظة الثمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر اليخاندرو برون من CISA-INIA لتوفير المضادة للفيروس حمى الوادي المتصدع الأمصال. ويدعم العمل في المختبرات لدينا من قبل Forschungsförderung الأحجار الكريمة. § 2 عبس. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum غيسن اوند ماربورغ، وكلية الدراسات العليا لايبنتز للالناشئة الأمراض الفيروسية (EIDIS)، وDFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021، وDFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
Penicillin-streptomycin PAA 15070-063
Fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS
Rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

أمراض المعدية، العدد 89، والاستجابة الفطرية المناعي، عدوى فيروس، مستقبلات الاعتراف الممرض، RIG-I، PKR، IRF-3، والهضم محدودة البروتيني، والتبديل متعلق بتكوين جزئي، PAGE الأم، oligomerization
تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Weber, F. Monitoring… More

Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter