Summary
ウイルス感染に対する自然の防御はパターン認識受容体（PRR）によってトリガされます。ウイルスシグネチャのRNA、変更高次構造、オリゴマー化する2細胞質のPRR、RIG-IおよびPKRに結合し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化する。方法は、都合のコンホメーションスイッチングと、これらの細胞質のPRRのオリゴマー化をモニタリングすることを可能にする記述されている。
Abstract
ウイルス感染に対する宿主防御は、自然免疫系のパターン認識受容体（PRR）による迅速な検出に依存している。細胞質内に、PRRは、RIG-IおよびPKRは、特定のウイルスRNAリガンドに結合する。これは、最初のコンホメーションのスイッチングおよびオリゴマー化を媒介し、その後、抗ウイルスインターフェロン応答の活性化を可能にします。抗ウイルス宿主遺伝子発現を測定するための方法は十分に確立されているが、直接、RIG-IおよびPKRの活性化状態をモニターする方法は、部分的にのみであり、以下で十分に確立。
ここでは、確立されたインターフェロン誘導剤、リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）の感染の際に、RIG-IおよびPKR刺激を監視するために二つの方法を説明します。限られたトリプシン消化は、PRRはの立体構造変化を示す、プロテアーゼ感受性の変化を分析することができます。 RIG-IとPKR、whereaの急速な劣化を模擬感染細胞の結果から溶解物のトリプシン消化S Clで13感染はプロテアーゼ耐性RIG-I断片の出現につながる。また、PKRは、Thr 446で、その特徴的なリン酸化と一致し、トリプシン消化にウイルス誘導部分の抵抗を示している。RIG-IとPKRオリゴマーの形成は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により検証された。これらのタンパク質は疑似感染サンプル中の単量体として残るのに対し、感染の際に、RIG-IとPKRのオリゴマー複合体の強力な蓄積がある。
限られたプロテアーゼ消化し、ネイティブPAGE、ウェスタンブロット分析に連結された両方が、RIG-IとPKR活性化の2多様な段階の感度で直接測定を可能にします。これらの技術は、実行するのが比較的容易かつ迅速であり、高価な装置を必要としない。
Introduction
抗ウイルス宿主防御において重要な出来事は、いわゆるパターン認識受容体（PRR） の1,2による病原体の迅速な検出である。 RNAウイルス感染の細胞内検出は、2細胞質RNAヘリカーゼ、RIG-I（レチノイン酸誘導性遺伝子I）およびMDA5（メラノーマ分化関連タンパク質5）3-5に依存している。 RIG-Iは、2つのN-末端カスパーゼ動員ドメイン（カードなど）、中枢DECHボックス型RNAヘリカーゼドメイン、およびC末端ドメイン（CTD）4,6とから構成されている。 CTDおよびヘリカーゼドメインが非自己（ウイルス）RNAの認識に必要であるのに対し、カードが抗ウイルスホストのステータスの確立につながる下流のシグナル伝達を仲介する。
RIG-Iが無音状態である場合、 すなわち、特定のRNAリガンドの非存在下で、第二のCARDは、中央ヘリカーゼドメインと相互作用し、自己阻害コンフォメーション7-11にRIG-Iを保つ。 RIG-Iは、短い二本に結合する5'-三リン酸（5'PPP）、長いdsRNA、およびポリU / UC豊富なRNA、多くのRNAウイルス12から16のゲノム上に存在する古典的な署名の構造を持つ鎖（DS）のRNA。 RIG-I活性化の二つの主要な特徴は、閉じたコンフォメー6,17およびホモオリゴマー6,18,19に切り替えている。コンフォメーションスイッチは、RNAが結合を増強下流のシグナル伝達のためのカードを公開し、活発なATPアーゼサイト8,9,11,20を再構成する。オリゴマーRIG-I複合体の形成は、抗ウイルスシグナル伝達のためのプラットフォーム11を形成するために、下流のシグナル伝達アダプター分子の増強された動員をもたらす。 RIG-I-調節されたシグナル伝達鎖は、最終的にアップレギュレーションインターフェロン（IFN-alpha/beta）遺伝子、完全な抗ウイルス応答21,22インターフェロン刺激遺伝子（ISGの）の、従って遺伝子発現のための転写因子IRF-3を活性化する。最も特徴ISGの一つは、RNA活性化proteiですNキナーゼ（PKR）23。 PKRは、真核生物翻訳開始因子2アルファ（eIF2αリン）キナーゼのファミリーに属し、N末端の二本鎖RNA結合ドメインおよびC-末端キナーゼドメインから構成される。キナーゼドメインは、PKR活性化のための二量体化界面が重要で構成しており、タンパク質の触媒機能を実行する。ウイルスのdsRNAのPKRの結合は、他の残基の間のThr 446で二量体化および自己リン酸化を可能にする、そのコンフォメーション変化をもたらす。 PKRは、それによってウイルスmRNA 23〜27の翻訳をブロックする、eIF2αリンのリン酸化を仲介する。
RIG-IおよびPKRの両方は、主要な構造再配列を受けるオリゴマー複合体を形成し、翻訳後リン酸化/脱リン酸化およびユビキチン化10,11,19,23,24,26-29によって修飾される。ウイルスのRNA構造がRIG-IおよびPKRを活性化している（どのような段階でウイルスのアンタゴニストをbの可能性がより良い理解のためにe）に干渉し、それは正確に活性化状態を決定することが重要である。両方のPRRのために、予め活性化は、トリプシン耐性タンパク質断片6,17,30及び高次オリゴマー6,18,19の出現をもたらすことが記載されている。しかし、抗ウイルス宿主応答1,2,24のこれらの重要な要因に関する文献が豊富に与えられ、直接法の適用は比較的まれと思われる。より広範な使用状況を刺激するのを期待し、我々は強固に、RIG-Iと、PKRの活性化状態を分析するために便利で敏感なプロトコルを提供する。 IFN有能なヒト細胞株A549は、RIG-IおよびPKR弱毒リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）31,32の確立された活性化因子に感染している。単純な溶解手順の後、感染細胞の抽出物は、コンホメーションのスイッチングを評価するために、制限されたトリプシン消化/ウェスタンブロット分析によって試験され、青色ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）/ウェスタンブロットによるanalysオリゴマーの形成を測定することである。
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Protocol
感染のA549細胞の1。シーディング
- 細胞培養培地中でCO 2、37℃でA549細胞をT75フラスコを育成し、5％（DMEM、10％FCS、526.6ミリグラム/ lのL-グルタミン、50.000 U / lのペニシリン、および50mg / Lのストレプトマイシンを補充した）。
- 細胞を回収し始める前に、37℃に加熱した水浴中で細胞培養培地、PBSおよび0.05％トリプシン-EDTAを温める
- 培地を除去し、10mlのPBSで細胞を洗浄。再びPBSを削除します。
- トリプシン-EDTAの3ミリリットルを加え、フラスコ内に均等に分配する。 37℃のインキュベーターにフラスコを移し、5％のCO 2。
- すべてのセルが切断されるときに、細胞培養培地7mlの投稿、細胞を再懸濁し、15mlのファルコンチューブに細胞懸濁液を移す。
- RTで5分間、800×gで細胞を遠心し、上清を除去し、10mlの新鮮な細胞培養培地中でペレットを再懸濁する。
- カウンティングチャンバーで細胞を数える。
- 2 T25フラスコ中の各細胞培養培地5mlに2.5×10 6個の細胞を加える。 37℃で16時間インキュベートし、5％CO 2。一つのフラスコを模擬対照とCl 13感染症の1のために提供しています。
リフトバレー熱ウイルスクローン13（CL 13）と2。感染
- 注：Clで13は、ドイツでのBSL-2の条件下で処理することができる弱毒化ウイルスの変異体である。該当する国のガイドラインを参照してください。他の典型的なインターフェロン誘導物質は、センダイウイルス（菌株Cantell）またはニューカッスル病ウイルスだろう。
- 5％FCSを含有するプレ暖かいPBS、無血清培地および細胞培養培地。
- 5の感染多重度（MOI）で2.5×10 6個のA549細胞を感染させるために無血清培地中でClで13の1.25×10 7 PFU / mlに調製する。を考慮するために必要とされるよりもわずかに（約10％）より多くの量を準備ピペットのエラー。
- 1.3で説明したように、PBSで細胞を洗浄。
- Clで13希釈液1ミリリットルを追加したり、無血清培地（未感染の対照、モック）細胞に、37℃で1時間、5％CO 2でインキュベートする。それぞれ、Clで13希釈および無血清培地の平等な分配を確保するために、15分毎に丁寧にフラスコを移動します。
- 感染の1時間後、接種物を除去し、5％FCSで予め温めておいた細胞培養培地5mlを追加し、37℃で5時間、5％CO 2でインキュベート。
細胞溶解物の3。準備
- 4℃でPBS / 0.5％トリトンX-100を調製セリンプロテアーゼ阻害剤を追加しないでください。
- 冷PBSで細胞を洗浄し、新しいPBSの10ミリリットルを追加。
- 細胞を掻き、ファルコンチューブに細胞懸濁液を移し、RTで5分間800×gで遠心する。
- 上清を除去し、30μlのPBS / 0.5％トリトンX-100で細胞ペレットを再懸濁します。新しい1.5 mlチューブにライセートを移し、4℃で少なくとも10分間インキュベート
- 10.00で溶解液を遠心分離0〜4℃で10分間xgで新しいチューブに清澄化した細胞溶解物（上清）を転送する。
- 他の場所で説明したように33 Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定します。
- -20℃で保存するか、トリプシン消化（4.1）またはネイティブPAGE（5.1）に進みます。
パターン認識受容体の構造変化4。決定
- 細胞溶解物のTPCK-トリプシントリートメント
- 2μgの/μLの最終作業濃度にPBS中に、L-1-トシルアミド-2 - フェニルエチルクロロメチルケトンで処理した（TPCK）トリプシンを希釈する。
- 2本の新しいチューブにPBSで9μlの最終体積（モックまたはCl 13）各タンパク質溶解物の25μgの最終タンパク質濃度を調整します。したがって、25μgの溶解物それぞれ、2回モックと2回Clで13に感染した4本のチューブである必要があります。一つは、入力コントロール（未処理）およびTPCK-トリプシンを用いた治療のための1セットとして設定してください。
- （未処理）のPBS 1μl加えまたは12μgの/μLTPCK-トリプシン（最終濃度0.2μgの/μL）のμL細胞溶解物にピペッティングにより反応を混ぜる。それは、消化の効率が損なわれるため、TPCK-トリプシン分量を凍結融解しないでください。
- 25分間37℃で溶解物をインキュベートする。 5×変性サンプル緩衝液（250mMのトリス-HCl、pH6.8、10％SDS、50％グリセロール、25％のβ-メルカプトエタノール、0.5％ブロモフェノールブルー）と95℃で5分間煮沸を添加することにより反応を停止それは、トリプシンインキュベーション時間を延長しないことが重要です。何プロテアーゼ耐性断片が検出されない場合には、トリプシン消化の時間を短縮する必要があります。
- 煮沸後、サンプルを-20℃で保存することができる
- SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）およびウェスタンブロッティング
- 12％分離ゲル上の5％スタッキングを含有するドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル上でサンプルをロードする。まで、ゲルあたり25ミリアンペアでタンパク質を分離ブロムフェノールブルーがなくなる。
- メタノールを用いてポリフッ化ビニリデン（PVDF）で30秒間膜を活性化し、転送バッファに入れ（48 mMトリス、39 mMのは、1.3mMのSDS、20％メタノールをグリシン）。
- セミドライブロッティングシステムとブロッティングを準備し、1時間10 Vでのタンパク質の移動を可能にします。メンブレンを取り出して水で簡単にそれをすすぎ、それが乾燥させます。
- まもなくメタノール中に移すことによって、膜を再活性化。 TBSで5分間洗浄します。 RTでまたは4℃のCO / Nで1時間、TBSが10％スキムミルクでブロック5分、TBSでそれぞれの膜3回洗浄します。
- 表1で推奨されるように、抗体希釈液を調製し、室温でまたは4℃のCO / Nで1時間膜をインキュベート
- TBS-Tで10分間ずつの膜3回洗浄します。 TBS中の1％スキムミルク中の1:20,000の希釈で西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した適切な二次抗体を加える。室温で45分間インキュベートする。
- 10分、TBS-Tでそれぞれの膜3回洗浄し、OTBSでNE追加の時間。
- 信号検出のため、市販の化学発光キットとデジタルゲル画像システムを使用しています。
- クマシーブリリアントブルーG-250染色
- 4.2.1で説明したように、SDS-PAGEを実行します。ブロモフェノールブルーがなくなるまで負荷SDSポリアクリルアミドゲル上のサンプルとは、ゲルごと25ミリアンペアでゲルを実行します。
- RTでクマシーブリリアントブルーG-250染色を行う。一定の振盪しながら全てのインキュベーションを行います。
- 30分間、40％メタノールおよび10％酢酸を含有する定着液にゲルを移し。
- 脱色液（25％エタノール、8％酢酸）にバッファーを交換し、5分間インキュベートする。
- 1時間、40％メタノールおよび10％酢酸中の0.2％クマシーブリリアントブルーG-250のゲルを染色。
- 脱色液でゲルを脱色し、10分、30分、および60分後にバッファーを交換する。
- 4℃で25％エタノール、8％酢酸、および4％グリセロール中でゲルを記憶する 4.2.8で説明したように画像化し、分析を行う。
パターン認識受容体のオリゴマー状態の5。分析
- 未変性PAGE
- PBSで最終容量10μl中で、細胞溶解物の50μgのを準備し、最終濃度を5×ネイティブ試料緩衝液（250mMのトリス-HCl、pH6.8、青色1％デオキシコール酸ナトリウム、50％グリセロール、0.5％ブロモフェノール）を追加1X。
- スタッキングとして5％、ゲルの解決など、8％ネイティブポリアクリルアミドゲルすぐにサンプルをロードします。任意の遅延は、ネイティブの複合体34が失われます。
- 50mMのTris-NaOHでpHを9.0と4℃でゲルあたり20 mAでゲルを実行し、384 mMのアノード及び50mMのTris、pH8.3、384 mMのグリシン、陰極バッファーとして1％デオキシコール酸ナトリウムなどのようなグリシン。 1.5〜2時間後の電気泳動が終了した（ブロモフェノールブルーバンドは、約45分以前の、ゲルを残している）。
- ウエスタンブロット法
- polyvをアクティブメタノールで30秒間inylidene化ビニリデン（PVDF）膜とトービン緩衝液（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、20％メタノール）に入れて下さい。
- メーカーの指示に従って、ウェットブロットチャンバーを組み立て、Towin緩衝液でタンクを埋める。
- 4℃で1.5時間、250ミリアンペアでブロッティングを行う
- ブロッティングした場合は、上の4.2.3から説明したように進んで終了する。
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Representative Results
RIG-IまたはPKRによるウイルス薬の認識は、コンホメーションのスイッチング6,17,30およびオリゴマー6,18,27をトリガします。我々は、それぞれ、限られたプロテアーゼ消化およびネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって、これら二つの活性化マーカーをアッセイした。
ヒトA549細胞は、IFNアンタゴニストのNS 35,36の突然変異により特徴付けられるリフトバレー熱ウイルスクローン13（13 Clで）に感染させた。により、機能のNSS存在しないために、クローン13が強く、細胞12,31,32,37における堅牢な抗ウイルス状態の確立につながる、RIG-IおよびPKRを誘導する。
RIG-Iの急速な分解における疑似感染細胞溶解物の結果のトリプシン消化とCl 13感染が30kDaの耐性、RIG-Iフラグメント図1Aの発生につながるのに対し。また、PKRは、ホスホンと一致する、感染した試料中のトリプシン消化に部分的な抵抗性を示すorylationの図1A。トリプシン消化の効率および特異性をモニターするために、ゲルをクーマシーブリリアントブルーG-250で染色した。未処理サンプルがロードされたタンパク質、図1Bの同量を示しています。トリプシン消化にモックおよびCl 13細胞溶解物を供して、全体的なタンパク質の量の匹敵する減少をもたらす。これは、トリプシン処理モックおよびCl-13感染したサンプルについて同じ効率を有することを示している。
オリゴマー複合体の形成は、ネイティブPAGEによってアッセイした。非感染細胞では、RIG-IおよびPKRのモノマーのみ を、 図2を検出した。追加の対照として、我々は、単量体として存在するが、例えば 、RIG-I 38を介して、活性化の際に二量体化することが公知である転写因子IRF-3を含んでいた。 CL 13感染はスミアとPKRと定義されたタンパク質バンドとしてのIRF-3ダイマー/オリゴマーの形で、RIG-Iオリゴマー複合体の強い蓄積する。
図1 RIG-IおよびPKRのコンホメーションスイッチ A549細胞は、感染したモックあっ又は5のMOIでClで13で感染させた。5時間後、細胞をPBS中で溶解した0.5％トリトンX-100を補充し、細胞溶解物をクリアした治療せずに放置またはトリプシン処理のどちらか。サンプルを、ウェスタン（A）またはクーマシー染色（B）にブロッティングし、続いてSDS PAGEに供した。ブロットは、それぞれ、感染やローディングコントロールとして、RIG-I、PKR、リン酸化されたPKR（木446）に対してとRVFV核タンパク質（RVFV N）およびβ-アクチンに対する染色した。_blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2 RIG-I、PKRのオリゴマー、及びIRF-3。モックおよびCl-13感染細胞溶解物の細胞溶解物を、ウェスタンブロット分析、続いてネイティブPAGEに供した。染色は、RIG-I、PKR、IRF-3、ローディングコントロールとしてβ-アクチンに対する抗体を用いて行った。 PKRオリゴマーは、最も可能性の高い二量体27を表しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ウイルスや私は、システムをIFNの抗ウイルスタイプの活性化の存在を感知すると、成功した自然免疫応答22に重要である。ウイルス検出することにより迅速な応答および抗ウイルス防御機構の活性化を可能にする、RIG-IおよびPKRなどの病原体認識受容体（PRR）によって媒介される。ここでは、直接RIG-IおよびPKRの活性化状態を評価するために二つの方法を記載している。
RIG-Iと、PKRの立体構造変化を監視するためのツールとして、限られたプロテアーゼ消化は、まず、それぞれM·ゲイル·ジュニアと藤田6,17、およびJLコール30のグループによって記述されていた。これは、コンフォメーション変化によって引き起こされる、トリプシン処理し、感度の変化を評価するために高感度の方法を表しています。ウイルス感染細胞溶解物のトリプシン処理は耐RIG-I断片をトリプシンにつながったのに対し、トリプシン消化を適用し、我々は、疑似感染試料では、RIG-Iと、PKRの急速な低下を検出しました。 Similアルリー、トリプシン耐性のPKR断片はClで13感染の際に検出された。これは、スレオニン446、PKR活性化の広く使用されているマーカーでのPKRのリン酸化を伴っていた。クマシー染色によるモックとCl 13細胞溶解物のトリプシン消化を比較すると、全体的なタンパク質レベルの比較可能な減少を示しています。これは、抵抗性断片の形成がRIG-IおよびPKR様タンパク質に特異的であることを示している。
RIG-I、PKR及びIRF-3のオリゴマー複合体の形成は、ネイティブPAGEによってモニターした。これらのタンパク質は疑似感染サンプル中の単量体として残るのに対し、ネイティブPAGEにClで13に感染した細胞溶解物を施し、我々は、RIG-I、PKR及びIRF-3オリゴマーを検出しました。 RIG-Iは、下流経路を活性化するオリゴマーを形成する必要がある。これは、RIG-Iのオリゴマーは、抗ウイルス応答機構11のためのシグナリングプラットフォームを形成するために、補因子の動員をサポートすると仮定された。 PKRの二量体の機能は完全には理解されていない。ほとんどの場合、PK二量体中のRサブユニットは、互いに25をリン酸化する。 I型IFN系がしっかり転写レベルで調節され、IRF-3はIFN及び38のISGの誘導のための一つの中央の転写因子を表す。活性化の中心的な特徴は、リン酸化、二量化、そしてそれは、IFN mRNA合成21,39を開始するために、転写コアクチベーターのP300およびCREB結合タンパク質（CBP）を募集し、核への転座である。 IRF-3の二量体化の分析は、私が応答38型 IFNの活性化をモニターするために広く使用されるツールです。したがって、我々はRIG-IとPKRへのオリゴマーのオリゴマー化アッセイのための原理の証明として、IRF-3オリゴマー複合体の検出を使用していました。実際に、非変性条件下でのタンパク質溶解物の分離を可能にする、我々はCl中で13感染したサンプルをIRF-3二量体化を検出することができた。
確かに、各ラボでは、限られたプロテアーゼDIGEのプロトコルを最適化する必要があります。テオンおよび未変性PAGE。無しどれ耐性タンパク質の検出またはあまりにも多くの抵抗性の断片に直面した場合、人はそれぞれ、消化の時間を短縮または延長することがあります。準備が若干異なるなどの違い、また、特定のTPCK-トリプシンの株式が原因である場合もあります。そのため、様々なTPCK-トリプシン濃度は、最適化のためにテストする必要があります。細胞溶解物をA549以外の細胞株から調製することができるが、プロトコルの適応が必要になる場合があります。なお、この特定の細胞型中の目的のタンパク質の発現レベルに応じて、トリプシン消化し、ネイティブPAGEのために全タンパク質の量を調整することが推奨される。また、限られた検出またはネイティブPAGEによるオリゴマー複合体の弱い分離はいくつかの理由を持つことができ、続くように対処することができます。、機器は残りの変性剤を除去するために洗浄されていることを確認し、4℃でホームページ中のすべてのサンプルやゲルを保つ、及びサンプル調製およびロアとの間の時間を延長しないゲルに丁。限られたプロテアーゼ消化とネイティブページには、もう一つの重要な、密接に関連PRR、MDA5 40〜42の活性化を監視するために使用されてきた。 MDA5活性化のモニタリングは、RIG-IとPKRとは異なる実験条件を必要としたので、ここには含まれていませんでした。
要約すると、RIG-Iと、PKRの活性化を測定するために2有用かつ感度の高い方法のためのポイントごとのプロトコルを提示する。それぞれ限られたプロテアーゼ消化およびネイティブPAGE、ウェスタンブロット分析の両方に結合された、コンフォメーション変化及びオリゴマー化の許可監視。これらの方法を使用して、我々は、以前はRIG-Iを直接セル32内に入った後の種々のウイルスのヌクレオカプシドにより活性化され得ることを示した。
感染した細胞内で、RIG-IとPKR活性化のために、関連するRNA種の正確な性質および起源はまだ完全に解決されていない。さらに、多くのウイルスはと干渉戦略12,43-46の多種多様なのPRRの機能。提示された技術は、RIG-IとPKR活性化を簡単に直接測定を可能にすることにより、メソッドのスペクトルを拡大し、実行するために高速で、高価な機器を必要としません。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
私たちは、反リフトバレー熱ウイルスの血清を提供するためのCISA-INIAからアレハンドロ·ブランに感謝します。私たちの研究室での作業はForschungsförderung宝石でサポートされています。 2腹筋を§。 3 KooperationsvertragUniversitätsklinikumギーセンウントマールブルグ、新興ウイルス性疾患のためのライプニッツ研究科（EIDIS）、DFG Sonderforschungsbereich（SFB）1021、およびDFG Schwerpunktprogramm（SPP）1596。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| Antibodies | |||
| Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS |
| Rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA | WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS | |
| Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H.
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
