Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51415
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

Summary

Virüs enfeksiyonlarına karşı doğal savunma örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından tetiklenir. İki sitoplazmik PRR'ler Rig-I ve viral imza RNA'lar, değişim konformasyon, oligomerleşip ve antiviral sinyalini etkinleştirmek için PKR bağlamak. Yöntem, uygun yapısal anahtarlama ve bu sitoplazmik PRRS en oligomerizasyonu izlemek için izin tarif edilmiştir.

Abstract

Virüs enfeksiyonu konak savunması doğuştan gelen bağışıklık sisteminin örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından hızlı bir algılama bağlıdır. Sitoplazmada, PRR Rig-I ve belirli viral RNA ligandlarına PKR bağlanır. Bu, ilk olarak yapısal ve anahtarlama oligomerizasyonu aracılık etmekte ve daha sonra bir anti-viral tepki interferon aktivasyonunu sağlar. Antiviral bir ev sahibi gen ekspresyonunu ölçmek için yöntemler iyi kurulmuş olsa da, doğrudan Rig-I ve PKR'nin aktivasyon durumları izlemek için yöntemler, sadece kısmen ve daha az iyi bilinmektedir.

Burada, kurulu bir interferon indükleyici, Rift Valley ateşli virüsü mutant klonu 13 (CI 13) ile enfeksiyon üzerine Rig-I ve PKR stimülasyon izlemek için iki yöntem tarif eder. Sınırlı tripsin sindirim PRRS şekilsel değişiklikleri gösteren, proteaz duyarlılık değişiklikleri analiz etmeyi sağlar. Rig-I ve PKR, anlamlara sahiptir: hızlı bir şekilde bozunması ile sahte enfeksiyonlu hücreler sonuçlarından lizatlarının tripsin sindirims Cı 13 enfeksiyonu bir peptidaza dayanıklı Rig-I fragmanının ortaya çıkmasına yol açar. Ayrıca PKR Thr 446 onun ayar damgası fosforilasyonu ile çakışmaktadır tripsin sindirim, bir virüs kaynaklı kısmi bir direnç gösterir. Rig-I ve PKR oligomerleri yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile doğrulandı oluşumu. Bu proteinlerin örnekleri sahte enfekte monomer olarak kalmıştır oysa enfeksiyon üzerine, Rig-I ve PKR oligomerik kompleksleri güçlü bir birikimi bulunmaktadır.

Sınırlı proteaz sindirimi ve yerel PAGE, Rig-I ve PKR aktivasyon iki farklı adımları bir hassas ve doğrudan bir ölçüm sağlar, western blot analizi bağlanmış iki. Bu teknikler nispeten kolay ve gerçekleştirmek için hızlı ve pahalı ekipman gerektirmez.

Introduction

Antiviral konak savunmasında çok önemli bir etkinlik sözde görüntü tanıma reseptörleri (PRR) 1,2 patojeni hızlı tespit edilmesidir. RNA virüs enfeksiyonu tespiti, iki hücre içi sitoplazmik RNA sarmallara Rig-I (retinoik asit olarak uyarılabilir bir gen I) 'in ve MDA5 (melanoma farklılaşma ilişkili protein 5) 3-5 bağlıdır. Rig-I, iki N-ucu kaspaz alım alanları (kart), merkezi bir Dech kutu tipi RNA helikaz etki alanı ve bir C-terminal alanının (CTD) 4,6 oluşmaktadır. CTD ve sarmal etki non-self (viral) RNA'lar tanınması için gerekli ise, kARtlARI bir antiviral sahibi durumundaki kurulmasına yol açan aşağı sinyalizasyon aracılık.

Rig-I, belirli bir RNA ligandın yokluğunda yani sessiz durum içinde ise, ikinci bir kart merkezi sarmal alanı ile etkileşime girer ve bir otomatik engelleyici konformasyonunda 7-11 Rig-I tutar. Rig-Ben kısa bağlanır çiftbir 5'-trifosfat (5'PPP) ve uzun dsRNA, polyU ve / UC açısından zengin RNA, birçok DNA virüsünün 12-16 genomlarında üzerinde mevcut olan klasik imza yapıları taşıyan iplik (ds) RNA. Rig-I aktivasyonu iki temel özellikleri kapalı konformasyon 6,17 ve homo-oligomerizasyonun 6,18,19 bir anahtar vardır. Yapısal anahtarı, RNA bağlayıcı geliştirir aşağı sinyalizasyon için kartlar ortaya, ve aktif bir ATPaz sitesi 8,9,11,20 yeniden oluşturulmasını. Oligomerik Rig-I komplekslerinin oluşumu antiviral sinyal iletimi 11 için bir platform oluşturmak için aşağı doğru sinyal adaptör moleküllerinin gelişmiş işe yol açar. Rig-I-regüle sinyal zinciri sonunda transkripsiyon faktörünü aktive IRF-3 için yukarı-regülasyonu tam bir antiviral karşılık 21,22 için interferon (IFN-alpha/beta) genleri ve interferon uyarılan genlerin dolayısıyla gen ifadesi (ISGs) arasında . En iyi karakterize edilmiş ISGs bir RNA ile aktive olan Protein kinaz (PKR) 23. PKR ökaryotik translasyon başlatma faktörü alfa 2 (eIF2α) kinazları ailesine ait olan ve bir N-terminal çift-şeritli RNA bağlama alanı ve bir C-terminal kinaz oluşmaktadır. Kinaz etki PKR dimerizasyon aktivasyonu için önemli bir arayüz oluşturur ve proteinin katalitik işlevleri yerine getirir. Viral dsRNA PKR bağlanması, bunun yapısal değişiklik diğer artıklar arasında yer Thr 446 dimerizasyonu ve oto-fosforilasyonunu izin yol açar. PKR sonra bu şekilde viral mRNA 23-27 çevirisini bloke eIF2α fosforilasyonunu aracılık eder.

Rig-I ve PKR her ikisi de, önemli bir yapısal yeniden düzenlemeleri geçmesi oligomerik kompleksler oluşturmak ve post-translasyonel fosforilasyon / defosforilasyon ve ubikitinasyon 10,11,19,23,24,26-29 ile tadil edilmiş metilalümoksandır. Viral RNA yapıları Rig-I ve PKR'yi aktive edilir (ve hangi aşamada viral antagonist b olabilecek daha iyi anlaşılması içine) müdahale, bu tam etkinleştirme durumunu belirlemek için önemlidir. Her iki PRRS için bir önceki aktivasyon trypsin'e dirençli protein fragmanlarının 6,17,30 ve daha yüksek dereceden oligomerlerin 6,18,19 ortaya çıkmasına yol açar tanımlanmıştır. Ancak, antiviral konak yanıtının 1,2,24 bu anahtar faktörlere edebiyatının zenginliği göz önüne alındığında, doğrudan yöntemler uygulama nispeten nadir görünüyor. Geniş kullanım uyarıcı umuduyla olarak, sağlam Rig-I ve PKR'nin aktivasyon durumları analiz etmek için uygun ve hassas protokolleri sağlar. IFN yetkin insan hücre hattı A549 Rig-I ve PKR, zayıflatılmış Rift Valley ateşli virüsü mutant klonu 13 (Cı-13) 31,32 yerleşik bir aktivatör ile enfekte edilir. Basit bir parçalama işleminden sonra, enfekte olmuş hücrelerin ekstreleri konformasyonel geçiş değerlendirmek için sınırlı tripsin sindirim / western blot analizi ile test edildi ve mavi olan yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) / Western blot analizi çalışan tarafındanoligomerlerin oluşumunu ölçmektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Enfeksiyon için A549 Hücrelerinin 1. Tohum

  1. 37 ° C'de A549 hücrelerinin bir T75 şişesi yetiştirmek ve% 5 hücre kültür ortamı içinde 2, CO (DMEM,% 10 FCS, 526.6 mg / L L-glutamin, 50,000 U / L penisilin ve 50 mg / l streptomisin ile takviye edilmiştir).
  2. Hücreleri toplamak için başlamadan önce, 37 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosu içinde, hücre kültür ortamı, PBS ve% 0.05 tripsin-EDTA ısıtmak
  3. Ortamı çıkarın ve 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın. Yeniden PBS çıkarın.
  4. Tripsin-EDTA 3 ml eklenir ve şişeye eşit olarak dağıtır. 37 ° C bir inkübatörde şişeyi aktarın ve% 5 CO2.
  5. Tüm hücreler müstakil zaman, hücre kültür ortamı 7 ml eklemek hücreleri tekrar süspansiyon ve bir 15 ml Falcon tüpü içine hücre süspansiyonu aktarın.
  6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüje hücreleri, süpernatant kaldırmak ve 10 ml taze kültür ortamı hücre pelet tekrar süspansiyon.
  7. Bir sayım bölmesi ile hücre sayımı.
  8. İki T25 şişelerinde her hücre kültür ortamı içinde 5 ml 2.5 x 10 6 hücreleri ekleyin. 37 ° C'de 16 saat boyunca inkübe edin ve% 5 CO2. Bir şişe, yalancı kontrol ve Cı 13 bulaşmasına biri için karşılık vermektedir.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Clone 13 2. Enfeksiyon (13 Cl)

  1. Not: Cl 13 Almanya'da BSL2 koşullar altında işlenebilir zayıflatılmış bir virüs mutantıdır. Ilgili ulusal kılavuzlara bakın. Diğer tipik IFN indükleyicilerinin Sendai virüsü (suşu Cantell) veya Newcastle hastalığı virüsü olacaktır.
  2. % 5 FCS ihtiva eden ön sıcak PBS, serum içermeyen ortam, ve hücre kültür ortamı.
  3. 5 'lik çoklu enfeksiyon (MOI) ile 2.5 x 10 6 A549 hücrelerini enfekte etmek için, serum barındırmayan ortam içinde 13 Cl, 1.25 x 10 7 PFU / ml hazırlayın. Hesaba katmak için gerekli olandan daha az (yaklaşık% 10) daha büyük bir miktarda hazırlanması pipet hataları.
  4. 1.3 altında tarif edildiği gibi hücrelerin PBS ile yıkayın.
  5. 1 Cl 13 ml seyreltme ya da eklemeserumsuz ortamın hücrelerine (enfekte edilmemiş kontrol, mock) ve 37 ° C'de 1 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. Sırasıyla Cı 13 seyreltme ve serumsuz ortam içinde eşit dağılımını sağlamak için her 15 dakika dikkatlice şişeyi hareket ettirin.
  6. Enfeksiyon 1 saat sonra, inokulum kaldırmak% 5 FCS ile önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı 5 ml eklemek ve 37 ° C'de 5 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir.

Hücre lisatları 3. Hazırlanması

  1. 4 ° C'de PBS /% 0.5 Triton X-100 hazırlanması Serin proteaz inhibitörleri katmayın.
  2. Soğuk PBS ile yıkayın ve taze 10 ml PBS ilave edin.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'de hücre bir Falcon tüpüne süspansiyon ve santrifüj transfer hücreleri kazıyın.
  4. Süpernatantı ve 30 ul PBS /% 0.5 Triton X-100 hücre pelletini. Yeni bir 1.5 ml tüp içine aktarın ve lisat, 4 ° C'de en az 10 dakika boyunca inkübe
  5. 10.00 Lisatı santrifüj0, 4 ° C'de 10 dakika boyunca x g ve yeni bir tüp içine berraklaştınlmış hücre lizatı (süpernatant) aktarın.
  6. Başka bir yerde tarif edildiği gibi 33 Bradford tahliliyle protein konsantrasyonunu belirleyin.
  7. -20 ° C'de saklayın veya tripsin sindirim (4.1) veya doğal PAGE (5.1) geçin.

Örüntü tanıma reseptörleri Konformasyonel Değişiklikler 4. Belirlenmesi

  1. Hücre lisatları içinde TPCK-tripsin tedavisi
    1. 2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar çalışma PBS içinde L-1-tosilamido-2-feniletil klorometil keton ile muamele edilmiş (TPCK) tripsin seyreltin.
    2. İki yeni tüplere PBS ile 9 ul'lik bir nihai hacim içinde (mock veya Cı 13) her bir protein lizat 25 ug bir son protein konsantrasyonu olarak ayarlayın. Bu nedenle, bu iki kat sahte ve iki defa Cı 13 enfeksiyonu, 25 ug lizat her dört tüpler olmalıdır. Bir giriş kontrol (tedavi edilmemiş) ve TPCK-tripsin ile muamele etmek için, bir set olarak ayarlayın.
    3. PBS 1 ul (işlenmemiş)1 ya da 2 ug / ml TPCK-Tripsin (son konsantrasyon: 0.2 ug / ml) içinde ul, hücre lizatlarına ve pipetleme reaksiyonları karıştırın. Bu sindirim etkinliğini tehlikeye çünkü, donma ve TPCK-tripsin bölüntülerin çözülme ETMEYİN.
    4. 25 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin lizatları. 5x (250 mM Tris-HCl pH 6.8,% 10 SDS,% 50 gliserol,% 25 β-merkaptoetanol,% 0.5 bromfenol mavisi) bir numunesi, denatüre edici tampon ilave edilerek ve 95 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatılarak reaksiyonu durdurun Bu tripsin kuluçka süresini uzatmak değil önemlidir. No peptidaza dayanıklı fragmanları tespit edilebilir durumda, tripsin sindirim süresinin kısalması gerekir.
    5. Kaynatıldıktan sonra numuneler -20 ° C'de muhafaza edilebilir
  2. SDS poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve Western Blot
    1. Sodyum dodesil sülfat,% 12 çözme jeli üzerinde% 5 istif ihtiva eden (SDS)-poliakrilamid jel üzerinde örnekleri yerleştirin. Kadar, jel başına 25 mA'da proteinleri Ayrıbromfenol mavi biterse.
    2. , Metanol ile 30 saniye boyunca bir poliviniliden florür (PVDF) membran aktive ve transfer tampon maddesi (48 mM Tris, 39 mM glisin, 1.3 mM SDS,% 20 metanol) koydu.
    3. Bir yan-kuru blot sistemi ile blotting hazırlayın ve 1 saat için 10 V de proteinlerin transferine izin verir. , Membran çıkarıp suyla kısaca durulayın ve kurumaya bırakın.
    4. Kısa bir süre metanol içine aktararak zarını yeniden etkinleştirin. TBS ile 5 dakika süreyle yıkanır. Oda sıcaklığında ya da 4 ° CO / N. 1 saat için, TBS içinde% 10 yağsız süt ile bloke 5 dakika TBS ile her biri için zar 3 kez yıkayın.
    5. Tablo 1 'de tavsiye edildiği gibi antikor seyreltme hazırlayın ve oda sıcaklığında ya da 4 ° CO / N 1 saat boyunca membran inkübe
    6. 10 dakika TBS-T ile her biri için zar 3 kez yıkayın. TBS içinde% 1 yağsız süt içinde bir 1:20,000 seyreltide yaban turpu peroksidazı ile birleştirilmiş uygun ikincil antikor ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
    7. 10 dakika TBS-T ile her biri için zar 3 kez yıkanır, ve oTBS ile ne ek süre.
    8. Sinyal tespiti için ticari Kimyasal ışığın kiti ve dijital jel görüntüleme sistemi kullanın.
  3. Coomassie Parlak Mavi G-250 Boyama
    1. 4.2.1 'de tarif edildiği gibi SDS-PAGE gerçekleştirin. Bromfenol mavi biterse kadar yük bir SDS poliakrilamid jel üzerinde örnekleri ve jel başına 25 mA jel çalıştırın.
    2. Oda sıcaklığında Coomassie Parlak Mavi G-250 lekeleme gerçekleştirin. Sürekli sallayarak altındaki tüm inkubasyon yapmak.
    3. % 40 metanol ve 30 dakika boyunca,% 10 asetik asit içeren sabitleme çözeltisine jel aktarın.
    4. Destaining solüsyonu (% 25 etanol ve% 8 asetik asit) ile tampon değişimi ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
    5. % 40 metanol ve 1 saat% 10 asetik asit içinde% 0.2 Coomassie Brillant Blue G-250 ile jel leke.
    6. Destaining solüsyonu ile jel destain ve 10 dakika, 30 dakika ve 60 dakika sonra tampon değişimi.
    7. 4 ° C'de% 25 etanol,% 8, asetik asit ve% 4 gliserol içinde jel saklayın 4.2.8 altında açıklandığı gibi görüntüleme ve analizi yapın.

Örüntü tanıma reseptörleri Oligomerik Devletleri'nin 5. Analizi

  1. Yerel PAGE
    1. PBS ile 10 ul'lik bir nihai hacim içinde, hücre lizatı, 50 ug hazırlanması ve bir nihai konsantrasyona kadar 5 x yerel numune tamponu (250 mM Tris-HCl pH 6.8,% 1 sodyum deoksikolat,% 50 gliserol,% 0.5 bromfenol mavisi) ekleyin 1x.
    2. Istifleme olarak% 5 ve çözücü jel gibi% 8 ile yerli poliakrilamid jel üzerinde HEMEN örnekleri yükleyin. Herhangi bir gecikme yerli kompleksleri 34 kaybına neden olur.
    3. Anot ve 50 mM Tris, pH 8.3, 384 mM Glycin, katot tampon madde olarak,% 1 sodyum deoksikolat gibi 50 mM Tris-NaOH, pH 9.0, 384 mM glisin ile 4 ° C'de jel başına 20 mA'da jel çalıştırın. 1.5-2 saat sonra elektroforez bittiğinde (bromfenol mavi bant yaklaşık 45 dk önce jel bıraktı).
  2. Western Blotting
    1. Bir polyv etkinleştirin, metanol ile 30 saniye için florür (PVDF) membran inylidene ve Towbin tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS,% 20 metanol) koydu.
    2. Üreticinin talimatlarına göre, ıslak leke haznesi monte ve Towin tamponu ile doldurun.
    3. 4 ° C 'de 1.5 saat boyunca 250 mA olan blotting işleminin gerçekleştirilmesi
    4. Blot ne zaman 4.2.3 dan açıklandığı gibi devam bitti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rig-I ya da PKR ile bir viral agonistinin tanınması konformasyonel anahtarlama 6,17,30 ve oligomerizasyon 6,18,27 tetikler. Biz ise, sınırlı bir proteaz sindirimi ve yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile bu iki etkinleştirme işaretleri analiz edilmiştir.

Insan A549 hücreleri, IFN antagonist NSS 35,36 bir mutasyon ile karakterize Rift Valley ateşli virüsü klon 13 (CI 13) ile enfekte edilmiştir. Nedeniyle fonksiyonel NSS olmaması için, Clone 13 şiddetle hücrelerde 12,31,32,37 sağlam bir antiviral devletinin kurulmasına yol açan, Rig-I ve PKR'yi uyarmaktadır.

Rig-I hızlı bir bozunma ile sahte enfekte edilmiş hücre lizatları sonuç tripsin sindirim, Cı-13 enfeksiyonu, 30 kDa'lık bir dirençli Rig-I fragmanı, Şekil 1A sebep olur ise. Ayrıca, PKR ile fosfatazlar ile çakışmaktadır enfekte örneklerinde, içinde tiripsin sindirimine direnç gösterir kısmiorylation Şekil 1A. Tripsin hazmı etkinlik ve spesifikliği izlemek için, j eller, Coomassie Parlak Mavi G-250 ile boyandı. Tedavi edilmeyen numuneler yüklü proteinlerin Şekil 1B eşit miktarda göstermektedir. Tiripsin sindirimine, sahte ve Cı 13 hücre lizatları tabi tutulması küresel protein miktarlarının bir karşılaştırılabilir azalmasına yol açar. Bu, tripsin ve tedavi mock Cı 13 ile enfekte olmuş örnekler için aynı verimliliğe sahip olduğunu göstermektedir.

, Oligomerik kompleksleri oluşumu doğal PAGE ile analiz edilmiştir. Enfekte edilmemiş hücrelerde, Rig-I ve PKR'nin sadece monomerleri Şekil 2 tespit edilmiştir. Gibi ek bir kontrol bir monomer olarak mevcut, ancak, örneğin, Rig-I 38 ile aktivasyon üzerine dimerize bilinen transkripsiyon faktörü IRF-3 dahildir. Cl 13 enfeksiyonu, yayma ve PKR ve belirli bir protein bandı gibi IRF-3 dimerler / oligomer şeklinde teçhizat-I, oligomerik kompleksleri güçlü birikmesine neden olur.

class = "jove_content"> Bu sonuçlar, kısıtlı sindirim ve tripsin yerel PAGE konformasyonel değişiklikler ve enfeksiyonu üzerine Rig-I ve PKR'nin oligomer oluşumunu izlemek için yararlı araçlar olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Rig-I ve PKR konformasyonel anahtarı. A549 hücreleri, sahte enfekte olan ya da 5 saat sonra, hücreler PBS içinde lize edilmiştir. 5'te MOl'de Cl 13 ile enfekte edildi,% 0.5 Triton X-100 ilave edilmiş ve hücre lizatları temizlenir Tedavi edilmediği veya tripsin ile muamele edilmiş ya da. Numuneler Batı (A) ya da Coomassie boyama (B) blot ve ardından SDS-PAGE tabi tutulmuştur. Lekeler Rig-I, PKR, fosforile PKR (Thr 446) karşı, sırasıyla RVFV nükleoprotein (RVFV N) ve enfeksiyon ve yükleme kontrolü olarak beta-aktin, karşı boyandı._blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2,. Rig-I, PKR'nin oligomerizasyonu ve IRF-3. Mock ve Cı 13 ile enfekte hücre lizatlarının hücre lizatları, Western blot analizi ile, ardından yerel PAGE tabi tutulmuştur. Boyama Rig-I, PKR, IRF-3 ve yükleme kontrolü olarak beta-aktine karşı antikorlar ile gerçekleştirildi. PKR Oligomerlerin büyük olasılıkla dimerlerini 27 temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Virüslerin varlığı ve sistem IFN antiviral Çeşidi aktivasyonunu algılama başarılı bir doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin 22 için çok önemlidir. Virüs algılama ve böylece hızlı bir tepki ve antiviral savunma mekanizmalarının aktivitesini sağlayan, Rig-I ve PKR gibi patojen tanıyan reseptörler (PRR) aracılık eder. Burada, doğrudan Rig-I ve PKR aktivasyon durumunu değerlendirmek için iki yöntem açıklanmaktadır.

Rig-I ve PKR'nin yapısal değişiklikleri sırasıyla birinci M. Jr Gale ve T. 6,17 Fujita ve JL Cole 30 grupları tarafından tarif edilmiştir izlemek için bir araç olarak sınırlı proteaz sindirimi. Bu konformasyonel değişikliklere neden tripsin tedaviye duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için hassas bir yöntemi temsil eder. Virüs ile enfekte hücre lizatlarının tripsin tedavisi dirençli Rig-I fragmanlarını tripsin yol ise tripsin sindirim uygulanması biz sahte enfekte örneklerinde Rig-I ve PKR'nin hızlı bozulma tespit edildi. Similarly, bir tripsin dirençli PKR fragmanı 13 Cl enfeksiyonu üzerine tespit edildi. Bu Thr 446, PKR aktivasyon yaygın olarak kullanılan bir marker PKR fosforilasyon ile eşlik edilmiştir. Coomassie boyaması ile mock ve Cı 13 hücre lizatlarının tripsin sindirim karşılaştırılması küresel protein seviyelerinin benzer bir azalma gösterir. Bu dayanıklı parçalarının oluşumu Rig-I ve PKR gibi proteinler için spesifik olduğunu gösterir.

Rig-I, PKR ve IRF-3 oligomerik kompleksleri oluşumu doğal PAGE ile izlenmiştir. Bu proteinler, sahte enfeksiyonlu numuneler monomer olarak kalmıştır ise yerel PAGE Cı 13 ile enfekte olmuş hücre lizatları tabi tutulması, biz Rig-I, PKR ve IRF-3 oligomerleri tespit edildi. Rig-I aşağı akış yolaklarını aktive etmek için oligomer oluşturulması gerekmektedir. Bu Rig-I Oligomerizasyon antiviral cevap mekanizmaları 11 için bir sinyal platform oluşturmak için kofaktörlerin işe destek olacağı öngörülmüştür. PKR dimerizasyonunun işlevi tamamen anlaşılamamıştır. Büyük olasılıkla, PKDimer R alt birimi birbirinden 25, fosforlar. I IFN tür sistemi sıkı bir transkripsiyonel seviyede düzenlenir ve IRF-3 ve IFN ISGs 38 indüksiyonunda merkezi bir transkripsiyon faktörünü temsil eder. Aktivasyon Central diğerlerinden ayıran fosforilasyon, dimerizasyonu ve IFN mRNA sentezi 21,39 başlatmak için ko-aktivatörler p300 ve CREB bağlayıcı protein (CBP) transkripsiyonal acemi çekirdeği, translokasyon bulunmaktadır. IRF-3 dimerizasyonunun Analiz I yanıtı 38 IFN tipte aktivasyonunu izlemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Bu nedenle, Rig-I ve PKR oligomerizasyon oligomerizasyon deneyleri için prensip bir kanıtı olarak IRF-3 oligomerik kompleksleri saptanmasını kullanılır. Gerçekten de, biz Cl 13. enfekte örnekleri IRF-3 dimerizasyonu tespit etmek mümkün denatüre edici olmayan koşullar altında, protein lizatlan ayrılması edildi izin verilmesi.

Kuşkusuz, her laboratuvar sınırlı proteaz Dige protokollerini optimize etmek gerekirstion ve yerel PAGE. Herhangi dayanıklı proteinler ya da çok dirençli fragmanları hiçbir algılama ile karşı karşıya ise, bir sırasıyla, sindirim süresini kısaltmak veya uzatmak olabilir. Hazırlıkları biraz farklı gibi farklılıklar da, özel TPCK-tripsin stoku nedeniyle olabilir. Bu nedenle, çeşitli TPCK-tripsin konsantrasyonları optimizasyonu için test edilmelidir. Hücre lisatları A549 dışındaki hücre hatları hazırlanabilir, ancak protokolün uyarlamalar gerekli olabilir. Bu, bu özel hücre tipi içinde, ilgi konusu proteinin ekspresyonu seviyesine göre tripsin sindirim ve yerel PAGE için toplam protein miktarını ayarlamak için tavsiye edilir. Ayrıca, sınırlı algılama veya doğal PAGE oligomerik komplekslerinin zayıf ayrımı çeşitli nedenleri olabilir ve takip gibi ele alınabilir:, ekipman kalan denatüre maddeleri çıkarmak için temizlenmiş olduğundan emin olun 4 ° C'de PAGE sırasında tüm örnekleri ve jel tutmak ve numune hazırlama ve Boyu arasındaki süreyi uzatmak yokjel üzerine Ding. Sınırlı proteaz sindirim ve yerli SAYFA başka önemli, yakından ilgili PRR, MDA5 40-42 aktivasyonunu izlemek için istihdam edilmiştir. MDA5 aktivasyon izleme Rig-I ve PKR göre farklı deneysel koşullar gereklidir, ve bu nedenle burada dahil değildi.

Özet olarak, Rig-I ve PKR aktivasyonunu ölçmek için yararlı olan iki ve hassas yöntemler için noktadan-noktaya protokoller tarafından sunulmaktadır. Sınırlı proteaz sindirimi ve yerel PAGE, Western blot analizi, bu şekilsel değişikliklere ve oligomerizasyon izin izlenmesi, sırasıyla her iki akuple. Bu yöntemler kullanılarak, daha önce Rig-I, doğrudan hücre 32 içine girmesinden sonra çeşitli virüslerin nükleokapsidlerin ile aktive edilebilir olduğunu göstermiştir.

Enfekte olmuş hücrelerde Rig-I ve PKR aktivasyonu hakkında RNA türünün kesin doğası ve kökeni hala tamamen çözülmüş değildir. Dahası, birçok virüs ile müdahalestratejilerinin 12,43-46 geniş bir yelpazede tarafından PRRS işlevleri. Sunulan teknikleri, Rig-I ve PKR aktivasyon kolay ve doğrudan ölçüm izin vererek yöntemlerin spektrumunu büyütmek gerçekleştirmek için hızlı ve pahalı ekipman gerektirmez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz anti-Rift Vadisi Humması Virüs serumları sağlamak için CISA-INIA Alejandro Brun teşekkür ederim. Bizim laboratuarlarımızda çalışma Forschungsförderung taş tarafından desteklenmektedir. 2. Abs §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Gelişen viral hastalıklar için Leibniz Enstitüsü (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 ve DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
Penicillin-streptomycin PAA 15070-063
Fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS
Rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

Enfeksiyon Hastalıkları Sayı 89 doğuştan gelen bağışıklık tepkisi virüs enfeksiyonu patojen tanıma reseptörü Rig-I PKR IRF-3 sınırlı bir proteaz sindirimi konformasyonel anahtar yerel PAGE oligomerizasyon
Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Weber, F. Monitoring… More

Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter