Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Overvåking Aktivering av Antiviral Pattern Recognition Reseptorer RIG-I og PKR Av Limited Protease Fordøyelse og Native PAGE

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51415
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

Summary

Medfødte forsvar av virusinfeksjoner er utløst av mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs). De to cytoplasmatiske PRRs RIG-I og PKR bind til virussignatur RNA, endre konformasjon, oligomerize, og aktivere antiviral signale. Metoder er beskrevet som tillater å overvåke den conformational bytte og oligomerization av disse cytoplasmatiske PRRs.

Abstract

Vertens forsvar av virus infeksjon er avhengig av en rask påvisning av mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) i det medfødte immunsystemet. I cytoplasma, den PRRs RIG-I og PKR binder til spesifikke virale RNA-ligander. Det medierer først konformasjonsendring svitsjing og oligomerisering, og deretter gjør det mulig å aktivere en antiviral interferon-respons. Mens metoder for å måle antiviral verts genuttrykk er godt etablert, metoder for å direkte overvåke aktiverings statene RIG-I og PKR er bare delvis, og mindre godt etablert.

Her beskriver vi to metoder for å overvåke RIG-I og PKR stimulering ved infeksjon med en etablert interferon-indus, Rift Valley fever virus mutant klone 13 (Cl 13). Limited trypsin fordøyelse gjør det mulig å analysere endringer i protease-følsomhet, noe som indikerer konformasjonsendringer av PRRs. Trypsin fordøyelsen av lysates fra mock infiserte celler resulterer i en rask nedbrytning av RIG-I og PKR, whereas Cl 13-smitte fører til fremveksten av en protease-resistente RIG-I fragment. Også PKR viser en virus-indusert delvis motstand mot trypsin fordøyelsen, noe som sammenfaller med sitt kjennetegn fosforylering på Thr 446. Dannelsen av RIG-I og PKR oligomerer ble validert av innfødte polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). Ved infeksjon, er det en sterk opphopning av RIG-I og PKR oligomere komplekser, mens disse proteinene forble som monomerer i mock-infiserte prøver.

Limited protease fordøyelse og native PAGE, som begge er koplet til western blot analyse, gir en følsom og direkte måling av to forskjellige trinn av RIG-I og PKR aktivering. Disse teknikkene er relativt enkel og rask å utføre og krever ikke kostbart utstyr.

Introduction

En viktig hendelse i antiviral vertsforsvar er rask påvisning av organismen ved de såkalte mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) 1,2. Intracellulær påvisning av RNA-virus-infeksjon er avhengig av to cytoplasmiske RNA heli, RIG-I (retinsyre induserbar gene I) og MDA5 (melanoma differensiering assosiert protein 5) 3-5. RIG-Jeg er sammensatt av to N-terminal caspase rekrutterings domener (kort), en sentral Dech-boksen type RNA heli domene, og en C-terminal domene (CTD) 4,6. Mens CTD og heli domenet er nødvendig for anerkjennelse av ikke-selv (viral) RNA, kortene megle nedstrøms signal fører til etablering av et antiviralt vert status.

Hvis RIG-Jeg er i den stille staten, dvs. i fravær av en spesifikk RNA ligand, samhandler det andre kortet med den sentrale heli domenet og holder RIG-I i en auto-hemmende konformasjon 7-11. RIG-Jeg binder seg til korte dobbelttråd (ds) RNA som bærer en 5'-trifosfat (5'PPP), lang dsRNA, og PolyU / UC-rik RNA, klassiske signatur strukturer som er til stede i genomet hos mange RNA virus 12-16. To viktige kjennetegn ved RIG-I aktivering er en bryter til en lukket konformasjon 6,17 og homo-oligomerization 6,18,19. Den conformational bryter forbedrer RNA bindende, eksponerer kortene for nedstrøms signalering, og rekonstruerer en aktiv ATPase nettstedet 8,9,11,20. Dannelsen av oligomere RIG-I-kompleksene fører til forbedret rekruttering av nedstrøms signaladaptermolekylene for å danne en plattform for antiviral signaltransduksjon 11.. Rig-I-regulert signalkjeden til slutt aktiverer transkripsjonsfaktor IRF-3 for oppregulering av interferon (IFN-alpha/beta) gener og dermed genuttrykk av interferon-stimulerte gener (ISGs) for en full antiviral respons 21,22 . En av de beste karakterisert ISGs er den RNA-aktiverte protein-n kinase (PKR) 23. PKR tilhører familien av eukaryotisk translasjons-initierings-faktor alfa (2 eIF2α) kinaser, og er sammensatt av en N-terminal dobbelt-trådet RNA-bindende domene og et C-terminal kinase domene. Denne kinase domene utgjør dimerisering grensesnittet avgjørende for PKR aktivering og gjennomfører den katalytiske funksjon av proteinet. Binding av PKR til viral dsrna fører til sin konformasjonsendringen tillater dimerisasjon og auto-fosforylering på Thr 446 blant andre rester. PKR formidler da fosforylering av eIF2α, og dermed blokkerer oversettelse av viral mRNA 23-27.

Både RIG-I og PKR gjennomgå store strukturelle rearrangements, danner oligomeriske komplekser og er post-translationally endret av fosforylering / dephosphorylation og ubiquitinering 10,11,19,23,24,26-29. For en bedre forståelse av hvilke virale RNA strukturer aktiverer RIG-I og PKR (og på hvilket stadium viral antagonister kunne be interfererende), er det viktig å nøyaktig bestemme aktiveringstilstand. For begge PRRs ble det tidligere beskrevet at aktivering fører til fremveksten av trypsin-resistent protein fragmenter 6,17,30 og høyere orden oligomerer 6,18,19. Men, gitt vell av litteratur om disse viktige faktorene for den antivirale vertsrespons 1,2,24, synes relativt sjelden bruk av direkte metoder. I håp om å stimulere til større bruksområder, gir vi praktiske og sensitive protokoller til robust analysere aktiverings statene RIG-I og PKR. IFN kompetent human cellelinje A549 er infisert med en etablert aktivator av RIG-I og PKR, den svekket Rift Valley fever virus mutant klone 13 (Cl 13) 31,32. Etter en enkel lyserende prosedyre, blir ekstrakter av infiserte celler testet ved begrenset trypsin fordøyelse / western blot-analyse for å vurdere konformasjonsendring svitsjing, og ved å blå opprinnelige polyakrylamid-gel-elektroforese (PAGE) / Western blot analyser å måle dannelsen av oligomerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Seeding av A549 celler for infeksjon

  1. Dyrke en T75 kolbe A549-celler ved 37 ° C og 5% CO2 i cellekulturmedium (DMEM supplert med 10% FCS, 526,6 mg / l L-glutamin, 50.000 U / l penicillin og 50 mg / l streptomycin).
  2. Før å høste cellene, varme opp cellekulturmedium, PBS og 0,05% trypsin-EDTA i et vannbad oppvarmet til 37 ° C.
  3. Fjern mediet, og cellene vaskes med 10 ml PBS. Fjern PBS igjen.
  4. Tilsett 3 ml av trypsin-EDTA og fordele likt i kolben. Overfør kolben i en inkubator med 37 ° C og 5% CO2.
  5. Når alle cellene er frittliggende, tilsett 7 ml cellekulturmedium, resuspender cellene, og overføre cellesuspensjonen i et 15 ml Falcon-røret.
  6. Sentrifuger cellene ved 800 x g i 5 min ved RT, fjern supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml frisk cellekulturmedium.
  7. Tell cellene med en tellekammer.
  8. Til 2,5 x 10 6 celler i 5 ml cellekulturmedium i to T25 kolber hver. Inkuber i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2. En kolbe tjener til den mock-kontroll og en for Cl 13 infeksjon.

2. Infeksjon med Rift Valley Fever Virus Clone 13 (Cl 13)

  1. MERK: Cl 13 er et attenuert virus mutant som i Tyskland kan håndteres under BSL-2 forhold. Vennligst referer til relevante nasjonale retningslinjer. Andre typiske IFN-indusere ville være Sendai virus (stamme Cantell) eller Newcastle disease virus.
  2. Pre-varm PBS, serumfritt medium, og cellekulturmedium inneholdende 5% FCS.
  3. Forbered 1,25 x 10 7 PFU / ml av Cl 13 i serumfritt medium for å infisere 2,5 x 10 6 A549-celler med en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 5. Tilbered en noe (omtrent 10%) større mengde enn nødvendig for å utgjøre pipette feil.
  4. Vask cellene med PBS som beskrevet under 1.3.
  5. Tilsett 1 ml av Cl 13 fortynning ellerav serumfritt medium (ikke-infisert kontroll, mock) til cellene og inkuberes i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2. Beveg kolben forsiktig hvert 15. minutt for å sikre jevn fordeling av Cl 13 fortynning og serumfritt medium, henholdsvis.
  6. Etter 1 time for infeksjon, fjerner inokula, tilsett 5 ml forvarmet cellekulturmedium med 5% FCS, og inkuberes i 5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.

Tre. Utarbeidelse av cellelysater

  1. Forbered PBS / 0,5% Triton X-100 ved 4 ° C. Ikke legg serinproteaseinhibitorer.
  2. Vask cellene med kald PBS og tilsett 10 ml av frisk PBS.
  3. Skrap celler av, overføre cellesuspensjonen i en falkonrør og sentrifuger ved 800 xg i 5 minutter ved RT.
  4. Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 30 mL PBS / 0,5% Triton X-100. Overfør lysatet til en frisk 1,5 ml rør og inkuberes i minst 10 min ved 4 ° C.
  5. Sentrifuger lysatet kl 10.000 xg i 10 min ved 4 ° C, og overfører det klarede cellelysat (supernatant) inn i et nytt rør.
  6. Bestem proteinkonsentrasjonen ved Bradford-analysen som beskrevet andre steder 33..
  7. Oppbevares ved -20 ° C eller gå videre til trypsin fordøyelse (4,1) eller innfødte SIDE (5,1).

4. Fastsettelse av konformasjonsendring Endringer av mønstergjenkjenning reseptorer

  1. TPCK-trypsin Behandling av cellelysater
    1. Fortynn L-1-tosylamido-2-fenyletyl-klormetylketon behandlet (TPCK) trypsin i PBS til en endelig arbeidskonsentrasjon på 2 pg / pl.
    2. Juster i to nye rør en endelig proteinkonsentrasjon på 25 ug av hvert lysat protein (mock eller Cl, 13) i et sluttvolum på 9 ml med PBS. Derfor bør det være fire rør med 25 mikrogram lysatet hver, to ganger håne og to ganger Cl 13 infeksjon. Ett satt som inngangskontroll (ubehandlet) og ett sett for behandling med TPCK-trypsin.
    3. Legg en mL PBS (ubehandlet)eller 1 pl av 2 pg / mL TPCK-trypsin (sluttkonsentrasjon: 0,2 ug / ul) i cellelysatene og bland reaksjonene ved pipettering. IKKE fryse og tine TPCK-trypsin alikvoter, fordi det vil kompromittere effektiviteten av fordøyelsen.
    4. Inkuber lysatene ved 37 ° C i 25 min. Stopp reaksjonen ved å tilsette 5 x denaturerende prøvebuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 25% β-mercaptoethanol, 0,5% bromfenolblått), og ved koking i 5 min ved 95 ° C. Det er viktig å ikke forlenge trypsin inkubasjonstid. I tilfelle ingen protease-resistente fragmenter kan påvises, må tiden for trypsin fordøyelse forkortes.
    5. Etter koking, kan prøvene lagres ved -20 ° C.
  2. SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og Western Blotting
    1. Laste prøvene på en natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamid gel inneholdende en 5% stabling over en 12% løsning av gel. Separer proteiner på 25 mA per gel førden bromfenolblått renner ut.
    2. Aktiver en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran for 30 sek med metanol og sette det inn i transfer buffer (48 mM Tris, 39 mm glycin, 1,3 mM SDS, 20% metanol).
    3. Klargjør blotting med et semidry blotting-systemet og tillate overføring av proteinene ved 10 V i 1 time. Ta membranen ut, vask den raskt med vann, og la det tørke.
    4. Reaktivere membranen ved kort tid å overføre til metanol. Vask for 5 min med TBS. Blokker med 10% skummet melk i TBS i 1 time ved RT og ved 4 ° CO / N. Vask membranen 3x i 5 min hver med TBS.
    5. Tilbered antistoff fortynning som anbefalt i tabell 1 og inkuber membranen i 1 time ved RT og ved 4 ° CO / N.
    6. Vask membranen 3x i 10 minutter hver med TBS-T. Legg den aktuelle sekundære antistoff kombinert med pepperrot peroksidase på en 1:20,000 fortynning i 1% skummet melk i TBS. Inkuber 45 min ved RT.
    7. Vask membranen 3x i 10 minutter hver med TBS-T, og one ekstra tid med TBS.
    8. For signal deteksjon bruke en kommersiell kjemiluminescens kit og en digital gel bildebehandlingssystem.
  3. Coomassie Brilliant Blue G-250 Farging
    1. Utfør SDS-PAGE som beskrevet i 4.2.1. Last inn prøver på en SDS polyacrylamidgel og kjøre gel på 25 mA per gel før bromfenolblått renner ut.
    2. Utfør Coomassie Brilliant Blue G-250 farging ved RT. Har alle inkubasjoner under konstant risting.
    3. Overfør gelen til en fikseringsløsning som inneholder 40% metanol og 10% eddiksyre i 30 min.
    4. Utveksle bufferen til avfarging oppløsning (25% etanol og 8% eddiksyre) og inkuberes i 5 min.
    5. Flekk gelen med 0,2% Coomassie Brillant Blå G-250 i 40% methanol og 10% eddiksyre i 1 time.
    6. Destain gelen med avfarging løsning og utveksle bufferen etter 10 min, 30 min og 60 min.
    7. Oppbevar gelen i 25% etanol, 8% eddiksyre og 4% glycerol ved 4 ° C. Utfør bildebehandling og analyse som beskrevet under 4.2.8.

5. Analyse av Oligomeric stater Pattern Recognition reseptorer

  1. Native PAGE
    1. Forbered 50 ug av cellelysat i et endelig volum på 10 ul med PBS og tilsett 5 x opprinnelige prøvebuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% natrium-deoksycholat, 50% glycerol, 0,5% bromfenolblått) til en endelig konsentrasjon på 1x.
    2. Laste prøvene umiddelbart på en innfødt polyacrylamidgel med 5% som stabling og 8% som oppløsende gel. Enhver forsinkelse vil resultere i et tap av innfødte komplekser 34.
    3. Kjør gelen ved 20 mA pr gel ved 4 ° C med 50 mM tris-NaOH, pH 9,0, 384 mM glycin som som anode, og 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glycin, 1% natriumdeoksycholat som katode buffer. Etter 1,5-2 timer (bromfenolblått bandet har forlatt gel ca 45 min tidligere) elektroforese er ferdig.
  2. Western Blotting
    1. Aktiver en polyvinylidene (PVDF) membran for 30 sek med metanol og sette det inn Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mm glycin, 0,1% SDS, 20% metanol).
    2. Sett sammen en våt klatt kammeret i henhold til produsentens instruksjoner og fyll tanken med towin buffer.
    3. Utfør blotting med 250 mA i 1,5 timer ved 4 ° C.
    4. Når blotting er ferdig fortsetter som beskrevet fra 4.2.3 på.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anerkjennelse av en viral agonist ved RIG-I eller PKR utløser conformational veksling 6,17,30 og oligomerization 6,18,27. Vi analysert disse to oppstarts markører ved begrenset protease fordøyelsen og innfødte polyakrylamidgelelektroforese (PAGE), henholdsvis.

Menneske A549-celler ble infisert med Rift Valley-feber-virus klon 13 (Cl 13), som er karakterisert ved en mutasjon av IFN-antagonist NSS 35,36. På grunn av fravær av funksjonell NSS, Clone 13 sterkt induserer RIG-I og PKR, som fører til etablering av et robust antiviral tilstand i cellene 12,31,32,37.

Trypsin fordøyelse av mock-infiserte cellelysater resulterer i en hurtig nedbrytning av RIG-I, mens Cl 13-infeksjon fører til genereringen av en 30 kDa motstandsdyktig RIG-I-fragment figur 1A. Også PKR viser delvis resistens overfor trypsin fordøyelse i infiserte prøver, som faller sammen med dens fosfatorylation Figur 1A. For å overvåke effektivitet og spesifisitet av trypsin fordøyelsen, ble gels farget med Coomassie Brilliant Blue G-250. Ubehandlede prøvene viser like mengder lastet proteiner Figur 1B. Utsette håne og Cl 13 cellelysater til trypsin fordøyelse fører til en tilsvarende reduksjon av globale protein mengder. Dette viser at trypsin behandling har samme virkningsgrad for narr og Cl 13-infiserte prøvene.

Dannelsen av oligomere komplekser ble analysert ved naturlig PAGE. I ikke-infiserte celler, ble bare monomerer med RIG-I og PKR detektert Figur 2.. Som ytterligere kontroll vi inkludert transkripsjonsfaktor IRF-3, som er tilstede som en monomer, men er kjent for å dimerize ved aktivering via f.eks RIG-I 38. Cl 13-smitte fører til en sterk opphopning av RIG-I oligomeriske komplekser i form av en sverte og av PKR og IRF-3 dimer / oligomerer som en definert protein band.

class = "jove_content"> Disse resultatene viser at begrenset trypsin fordøyelsen og innfødte SIDE er nyttige verktøy for å overvåke konformasjonsendringer og oligomer dannelsen av RIG-I og PKR på infeksjon.

Figur 1
Figur 1. Konformasjonsendring bryteren RIG-I og PKR. A549-celler ble infisert mock eller infisert med Cl 13 ved en MOI på 5. Etter 5 timer ble cellene lysert i PBS supplert med 0,5% Triton X-100 og erte cellelysater var enten ubehandlet eller behandlet med trypsin. Prøvene ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting (A) eller Coomassie farging (B). Blotter ble farget mot RIG-I, PKR, fosforylert PKR (Thr 446) og mot RVFV nucleoprotein (RVFV N) og beta-aktin som infeksjon og lasting kontroll, henholdsvis._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. Oligomerization av RIG-I, PKR, og IRF-3. Cellelysater av mock og Cl 13-infiserte cellelysater ble utsatt for innfødte SIDE fulgt av Western blot analyse. Farging ble utført med antistoffer mot RIG-I, PKR, IRF-3, og beta-aktin som lasting kontroll. PKR oligomerene mest sannsynlig representerer dimer 27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sensing tilstedeværelse av virus og aktivering av antiviral type I IFN-systemet er avgjørende for vellykkede medfødte immunresponser 22. Viruspåvisning er dermed mediert av patogen anerkjennelse reseptorer (PRRs) som RIG-I og PKR, slik at en rask respons og aktivering av antivirale forsvarsmekanismer. Her beskriver vi to metoder for å direkte vurdere aktiveringsstatus RIG-I og PKR.

Begrenset protease fordøyelsen som et verktøy for å overvåke konformasjonsendringer av RIG-I og PKR ble først beskrevet av grupper av M. Gale Jr og T. Fujita 6,17, og JL Cole 30, hhv. Det representerer en følsom metode for å evaluere følsomhets endringer til trypsin behandling forårsaket av konformasjonsendringer. Bruk av trypsin fordøyelsen, vi har oppdaget rask nedbrytning av RIG-I og PKR i håne infiserte prøvene, mens trypsin behandling av virusinfiserte cellelysater førte til trypsinresistent RIG-I fragmenter. Similarly ble en trypsinresistent PKR fragment detektert ved Cl 13 infeksjon. Dette ble fulgt av PKR fosforylering på Thr 446, en mye brukt markør av PKR aktivering. Sammenligning trypsin fordøyelsen av mock og Cl 13 cellelysater etter Coomassie farging demonstrerer en sammenlignbar nedgang på globale protein nivåer. Dette tyder på at dannelsen av resistente fragmenter er spesifikk for proteiner som RIG-I og PKR.

Dannelsen av oligomere komplekser av RIG-I, PKR og IRF-3 ble overvåket ved naturlig PAGE. Utsette Cl 13-infiserte cellelysater til morsmåls SIDE, vi har oppdaget RIG-I, PKR og IRF-3 oligomerer, mens disse proteinene forble som monomerer i mock infiserte prøvene. RIG-Jeg må danne oligomerer å aktivere nedstrøms trasé. Det ble antatt at RIG-I oligomerization støtter rekruttering av kofaktorer for å danne et signal plattform for antiviral respons mekanismer 11. Funksjonen til PKR dimerisering er ikke helt forstått. Mest sannsynlig, PKR subenheter i dimer phosphorylate hverandre 25. Den type I IFN-system er strengt regulert på transkripsjonsnivået, og IRF-3 representerer en sentral transkripsjonsfaktor for induksjon av IFN og ISGs 38.. Sentrale kjennetegn på aktivering er fosforylering, dimerisasjon, og translokasjon til kjernen, hvor den rekrutterer transkripsjons co-aktivatorer p300 og CREB-bindende protein (CBP) å initiere IFN mRNA syntese 21,39. Analyse av IRF-3-dimerisering er en mye brukt verktøy for å overvåke aktivering av type I IFN respons 38.. Derfor har vi brukt påvisning av IRF-3 oligomeriske komplekser som et bevis på prinsippet for oligomerization analyser av RIG-I og PKR oligomerization. Faktisk, slik at separasjon av protein lysates under ikke-denaturerende forhold, var vi i stand til å oppdage IRF-3 dimerisasjon i Cl 13 infiserte prøvene.

Utvilsomt vil hver lab trenger for å optimalisere protokoller av begrenset protease digebrennings og innfødte SIDE. Hvis konfrontert med ikke detekteres noen resistente proteiner eller for mange resistente fragmenter, kan man forkorte eller forlenge tiden for fordøyelsen, respektivt. Forskjellene kan også skyldes den spesifikke TPCK-trypsin lager, som preparater litt forskjellig. Derfor bør ulike TPCK-trypsin konsentrasjoner testes for optimalisering. Cellelysater kan fremstilles fra andre cellelinjer enn A549, men tilpasninger av protokollen kan være nødvendig. Det anbefales å justere mengden av totale proteiner for trypsin fordøyelse og native PAGE i henhold til uttrykket nivået av proteinet av interesse i denne bestemte celletype. Videre kan begrenset deteksjon eller svak separasjon av oligomeriske komplekser av innfødte SIDE ha flere grunner, og kan tas opp som følger: sørge for at utstyret er rengjort for å fjerne gjenværende denatureringsmiddel, holde alle prøver og gelen under PAGE ved 4 ° C , og ikke forlenge tiden mellom prøveopparbeidelse og loading på gel. Begrenset protease fordøyelsen og innfødte SIDE har også blitt brukt til å overvåke aktivering av en annen viktig, nært beslektet PRR, MDA5 40-42. Overvåking av MDA5 aktivering kreves ulike eksperimentelle forhold sammenlignet med RIG-I og PKR, og ble derfor ikke tatt med her.

I sammendrag, er punkt-til-punkt-protokoll for to nyttige og følsomme metoder for å måle aktivering av RIG-I og PKR presenteres. Limited protease fordøyelse og native PAGE, begge koplet til Western blot-analyse, tillater overvåking av konformasjonsendringer og oligomerisering, respektivt. Ved hjelp av disse metodene, hadde vi tidligere vist at RIG-Jeg kan aktiveres ved nucleocapsids av ulike virus rett etter sin inntreden i cellene 32.

Den nøyaktige naturen og opprinnelsen av RNA-arter som er aktuelle for RIG-I og PKR aktivering i infiserte celler er fremdeles ikke helt oppklart. Videre mange virus forstyrrefunksjoner av PRRs ved en rekke strategier 12,43-46. De presenterte teknikkene større spektrum av metoder ved å tillate en enkel og direkte måling av RIG-I og PKR aktivering, er rask å utføre, og ikke krever kostbart utstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Alejandro Brun fra CISA-Inia for å gi anti-Rift Valley fever Virus sera. Arbeid i våre laboratorier er støttet av Forschungsförderung perle. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Leibniz Graduate School for Emerging virussykdommer (Eidis), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, og den DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
Penicillin-streptomycin PAA 15070-063
Fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS
Rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

Smittsomme sykdommer medfødte immunforsvaret virusinfeksjon patogen anerkjennelse reseptor RIG-I PKR IRF-3 begrenset protease fordøyelsen conformational bryteren native PAGE oligomerization
Overvåking Aktivering av Antiviral Pattern Recognition Reseptorer RIG-I og PKR Av Limited Protease Fordøyelse og Native PAGE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Weber, F. Monitoring… More

Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter