Summary
После перерезки спинного, взрослые данио имеют функциональное восстановление по шести недель после травмы. Для того чтобы воспользоваться личиночной прозрачности и ускорения восстановления, мы представляем метод для пересекающих личинок спинной мозг. После перерезки, мы наблюдаем сенсорную восстановление начиная с 2-х дней после травмы, и С-образный изгиб движение на 3 дня после травмы.
Abstract
Млекопитающие неудачу в сенсорной и моторной восстановления следующие повреждения спинного мозга из-за нехватки аксонов отрастания ниже уровня травмы, а также неспособности возобновить спинного нейрогенез. Однако некоторые anamniotes в том числе данио рерио Danio демонстрируют оба сенсорной и функциональное восстановление даже после полной перерезки спинного мозга. Взрослый данио является признанным модельный организм для изучения регенерации следующие повреждения спинного мозга, с сенсорной и моторной восстановления по 6 недель после травмы. Для того чтобы воспользоваться анализа в естественных условиях регенеративного процесса доступный в прозрачном личинок рыбок данио, а также генетические инструменты не доступны во взрослом, мы используем личиночной данио для изучения регенерации после перерезки спинного мозга. Здесь мы показываем, метод воспроизводства и проверяемым, пересекающих личинок спинной мозг. После перерезки, наши данные показывают, начало сенсорная восстановления на 2 дня после травмы (руб), остроумиеч С-изгиб движение обнаруживается на 3 руб и возобновления свободное плавание на 5 руб. Таким образом мы предлагаем личиночной данио в качестве компаньона инструмент в взрослых данио для изучения восстановления после травмы спинного мозга.
Introduction
Основные травмы спинного мозга человека часто приводит к постоянному параличу и потере чувствительности ниже уровня травмы, в связи с невозможностью вырастить аксоны или возобновить нейрогенез 1,2. В отличие от млекопитающих, однако, anamniotes включая саламандры и рыбок данио (Danio рерио) показать уверенное восстановление даже после полной перерезки спинного мозга 3,4.
Взрослый данио является устоявшейся моделью для изучения процесса восстановления следующем повреждением спинного мозга 5-7. После полной перерезки спинного мозга, восстановление сенсорной и локомотивного функции наблюдается в взрослых данио на 6 недель после травмы 8. Для того чтобы исследовать процесс регенерации в естественных условиях, мы обратились к прозрачной личиночной данио 9.
Здесь мы представляем метод разреза спинного мозга из 5 дней после оплодотворения (DPF) личиночной данио USIнг скошенную микроинъекции пипетки как скальпелем, модифицированный из Бхатт, и др.. 10 Этот метод поддерживает высокую пропускную способность, низкий смертности, и воспроизводимость. С практикой, 300 личинок / ч может быть перерезана, и свыше 6 месяцев transections, в том числе более 3600 животных, 98.75% ± 0,72% дожили до 7 дней после травмы (точек на дюйм). Наши данные показывают, быстрое восстановление сенсорной и передвижения, а также: на 1 руб, все движения потерпевшей рыбы движет только грудного плавника передвижения. Тем не менее, личинки начинают реагировать на вольфрамовой иглы сенсорный каудальнее перерезки на 2 руб, восстановить С-изгиба движение на 3 руб, а также отображать хищный плавание на 5 руб 11. Использование окрашивание антител против ацетилированного тубулина, мы подтвердили, что аксоны отсутствуют в месте повреждения на 1 руб, но пересекли место повреждения на 5 руб. Мы считаем, что это протокол предоставит ценную технику для изучения аксонов отрастания и нейрогенеза в спинном мозге после травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данио рерио были подняты и разводили в соответствии со стандартными процедурами; эксперименты были одобрены Университета Юты институционального комитета уходу и использованию животных.
1. Подготовка хирургии Плиты
- Сделать хирургии пластины с использованием 60 мм чашки Петри и Sylgard 184 силиконового эластомера комплект, в соответствии с инструкциями изготовителя. Заполните блюда не более, чем наполовину полон и позволяют полимеризации. Магазин покрыты при комнатной температуре.
2. Подготовка микропипеток
- Изготовление микропипетки путем нагревания и потянув тонкостенный боросиликатного капиллярной трубки в микропипетки съемник с теми же параметрами для принятия микроинъекции иглы.
- Под микроскопом рассечение, выхватить кончик микропипетки примерно 200 мкм в диаметре щипцами.
- Конические сломанный край с микромельница первоначально 35 °, с последующей второй фацета на 25 °. Убедитесь, наконечник острый и SMOдр.. Магазин закончил скошенную микропипетки в чашку Петри на небольшим количеством глины.
3. Подготовка данио рерио личинок
- 7 дней до операции, настроить спаривания танки мужского и женского рыбок данио.
- Сбор эмбрионов на следующее утро, 3 часа после того, как свет включается, чтобы обеспечить максимальный выход. При использовании трансгенных репортер линию, например, Tg (elevl3: EGFP) knu3, вроде оплодотворенных эмбрионов: 100/100 мм пластины в 25 мл E3 на 28,5 ° С. При использовании дикого типа, своего рода оплодотворенных эмбрионах 25/100 мм пластины в 25 мл E3 на 28,5 ° С.
- При использовании репортер линии, экран эмбрионов для флуоресцентного выражения в 48 часов после оплодотворения. Разрешить выявленные эмбрионы, чтобы созреть при плотности 25/100 мм пластины в 25 мл E3 на 28,5 ° С.
- Когда личинки 5 DPF, подготовить хирургии пластину, покрывая Sylgard с E2 + 10 мг / л гентамицинсульфата (GS) + Tricaine.
- Подготовка восстановления блюдо, добавив 25 мл E2 + GS до 100 мм рас Петричас
- Подготовка скальпель, записывая на пленку вместе три тампоны. Это образуют треугольную инструмент с тремя канавками.
- Смонтировать подготовленный микропипетки на тампоны, записывая на пленку его в одной из канавок.
- При повторном использовании микропипетки, промойте до небольшая E2 + GS с использованием 1 мл шприц и 27 г иглы перед установкой на мазках.
4. Хирургии
- Обезболить 1 тарелку личинок в то время (25 рыб) с Tricaine. Рыба в достаточной анестезии, когда они более не проявляют чувствительности к силе нажатия. Важно, чтобы рыба полностью под наркозом перед операцией, иначе они будут дергать, когда скальпель касается их. Операция проводится под микроскопом рассечение.
- Трансфер личинок хирургии пластины.
- Под максимальным увеличением, повернуть одно личинку в то время, так что он лежит на боку с ее обратно ближе к руке, держащей скальпель.
- Позиция щипцы так, чтобы они отдыхают на Sylgard,под углом по ширине личинки.
- Крепление стеклянную скальпель против одного из плеч пинцетом, нарезать спинной боковой поверхности личинки на уровне анального поры, будучи уверенным, чтобы не порезать за брюшного края хорды. Твист скальпель, чтобы разорвать спинной мозг.
- Повторите с оставшейся личинок.
Обратите внимание: если личинка кровоточит, она не будет оправиться от операции. Немедленно снять личинку от хирургии пластины и усыпить его с помощью Tricaine передозировки.
- После того, как операция на партию личинок завершена, передача ранения животных в послеоперационную пластины. Это необходимо для поддержки расчистку анестезии.
- Внимание: при сборе травмированного личинок для передачи, убедитесь, что они собираются головы или хвоста первый: не стресс место повреждения, сгибая личинок.
Примечание: Все устройства, используемые для операции могут быть повторно использованы, в том числе микропипетки.
- Внимание: при сборе травмированного личинок для передачи, убедитесь, что они собираются головы или хвоста первый: не стресс место повреждения, сгибая личинок.
5. Восстановление
- Трansfer ранения личинок из регенерационной пластины до 100 мм пластин, наполненных 25 мл E2 + GS при плотности 25/plate. Разрешить восстановить в 28.5 ° C инкубатора.
- Проверьте пластины ежедневно, удаляя больные и мертвых животных. Не изменяйте СМИ пока Coleps (пресноводные простейшие) не могут видеть в средствах массовой информации. При изменении СМИ, не переносят рыбу к новому пластины; вместо этого, удалить как можно больше средств массовой информации, как это возможно и затопить ту же самую тарелку с новыми медиа. При необходимости повторите сократить население Coleps.
- Поток ежедневно с небольшим количеством порошкообразного пищевого мальков.
Примечание: Живая пища (например, парамеции или коловратки) не может быть подан на травмированной личинок, пока они выздоровели передвижения. В противном случае, живая пища будет колонизировать место повреждения и убить личинок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы уменьшить тяжесть повреждения тканей окружающих место повреждения, собственно фаски из микропипетки имеет решающее значение. Рис. 1А показывает правильно скошенный наконечник. Использование совет, который является слишком широким (рис. 1В) приводит к тому, высших погибших в связи с увеличением вероятности никующих дорсальную аорту, в то время как совет, который является слишком узким (рис. 1С) стремится заглянуть с кожи, а не резки ткани.
Для практики этого метода, целесообразно использовать репортер линию, таких как Tg (elevl3: EGFP) knu3 визуализировать спинной мозг Фиг.2А показывает полностью перерезана спинной мозг живого Tg (elevl3: EGFP). Данио на 1 дюйм, ., а на рис 2B показывает ту же живую рыбу в 3dpi рисунках 2С и 2D показывают более высокие увеличениях места повреждения на 3 руб в основной Tg (dbx1a: EGFP) рыбы, имеющих сотрудничестваmplete (рис. 2С) или неполной (рис. 2D) перерезки спинного мозга. Обратите внимание на непрерывную область нейронов маркировки вдоль брюшного края спинного мозга (желтая стрелка).
Рисунок 1. Сравнение скальпель краями. Показывает правильно скошенный наконечник микропипетки подходящий для операции. Этот размер легко очищены для повторного использования. В показывает скошенную кончик микропипетки слишком широк для операции на 5 DPF личинки. С приведен пример наконечником, который является слишком узким. Этот размер очень трудно очистить для повторного использования, и, как правило, способствуют распиловки действие перерезки вместо резки D:. Мультфильм сборки lesioning инструмента. Три 6 "мазки вложены в руramidal форму и склеиваются. Скальпель лежит в одной из канавок, образованных трем тампоны, и выявляется на месте.
.. Рисунок 2 Проверка полное рассечение Люминесцентная конфокальной микроскопии был использован для изображения живой Tg (elavl3: EGFP) рыбы в естественных условиях на 1 руб (А) и 3dpi (B). Чтобы подтвердить полную рассечение, эти изображения стеки затем обрабатывались в ImageJ (rsbweb.nih.gov) для создания максимальной интенсивности проекции (Maxz), как показано на A - B C - D шоу Maxz проекции HUC / D помечены Tg (dbx1a.: EGFP) рыбы на 3 руб с полной перерезки спинного (C) или неполной перерезки (D).Желтые стрелки определить травмы сайт, D = спинной, R = ростральная. Шкала бар = 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При первоначальном изучении этой техники, мы рекомендуем пытаться не более 50-100 transections в течение одной сессии. После освоения этой техники, мы в состоянии секут до 300 эмбрионов в час; Однако этот уровень пропускной требуется несколько месяцев еженедельной практике. Мы также рекомендуем практиковать с репортерной линии и проверки полное рассечение, пока частота неполной спинного мозга рассечения не уменьшится до менее чем 1%.
Перерезки спинного мозга в взрослых данио является устоявшейся и надежная техника для изучения аксонов отрастания и нейрогенез после травмы. Перемещая этот анализ в личиночной организма, мы можем рассмотреть восстановление в естественных условиях. Кроме того, мы также можем использовать генетические инструменты, недоступные в взрослых данио изучить роли различных генов в регенеративного процесса, например, Tcf7l1a 12.
Первоначально гeveloped учиться нейрогенез следующие перерезки спинного мозга, эта методика может также использоваться для изучения восстановление сенсорной функции: ранены животные показать ответа прикоснуться каудальнее места повреждения на 2 руб, а аксоны пересекли место повреждения на 5 руб.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы в долгу перед Университета Юты данио объекта для животноводства. RID поддержали NIH R56NS053897, и LKB был predoctoral стажер поддержке инициативы HHMI Мед-В-Град.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
