Spinal Cord transection i Larvernas Zebrafish

Summary

Efter spinal transection, vuxen zebrafisk har funktionell återhämtning efter sex veckor efter skadan. För att dra nytta av larv insyn och snabbare återhämtning, presenterar vi en metod för att transecting larver ryggmärgen. Efter transektion, observerar vi sensorisk återhämtning börjar vid 2 dagar efter skadan, och C-böj rörelsen genom 3 dagar efter skadan.

Abstract

Däggdjur misslyckas i sensoriska och motoriska återhämtningen efter ryggmärgsskada på grund av brist på axonal återväxt under nivån för skadan samt en oförmåga att blåsa liv i spinal neurogenes. Men vissa anamniotes inklusive zebrafisk Danio rerio uppvisar både sensoriska och funktionell återhämtning även efter fullständig transektion av ryggmärgen. Den vuxna zebrafisk är ett etablerat modellorganism för att studera regenerering efter skada på ryggmärgen, med sensoriska och motoriska återhämtningen efter sex veckor efter skada. För att dra nytta av in vivo-analyser av den regenerativa processen finns i den genomskinliga larver zebrafisk samt genetiska verktyg inte är tillgängliga i den vuxna använder vi larver zebrafisk att studera regeneration efter ryggmärgen transection. Här visar vi en metod för att på ett reproducerbart och kontrollerbart transecting larv ryggmärgen. Efter transektion, visar våra data sensorisk återhämtning början på 2 dagar efter skada (dpi), intelligensh C-böj rörelse detekteras med 3 dpi och återupptagande av frisimmande med 5 dpi. Sålunda föreslår vi larver zebrafisk som en följeslagare verktyget till vuxna zebrafisk för studium av återhämtning efter ryggmärgsskada.

Introduction

Större trauma till den mänskliga ryggmärgen resulterar ofta i permanent förlamning och känselbortfall under nivån för skadan, eftersom det är omöjligt att återföds ständigt axoner eller upprepa neurogenes ^1,2. Till skillnad från däggdjur, dock anamniotes inklusive salamandrar och zebrafisk (Danio rerio) visar robust återhämtning även efter fullständig ryggmärgen transection ^3,4.

Den vuxna zebrafisk är en väl etablerad modell för att studera återhämtningsprocessen efter ryggmärgsskada ^5-7. Efter fullständig ryggmärgen transection, är återupprättandet av sensorisk och lok funktion observerats i den vuxna zebrafisk med 6 veckor efter skadan ^8. För att undersöka den regenerativa processen in vivo, vände vi oss till den genomskinliga larver zebrafisk ^9.

Här presenterar vi en metod för tvärsnitt av ryggmärgen av en 5 dagar efter befruktningen (DPF) larver zebrafisk USIng en fasad mikroinjektion pipett som en skalpell, modifierad från Bhatt et al. ¹⁰ Denna metod stöder hög kapacitet, låg dödlighet, och reproducerbarhet. Med lite övning kan 300 larver / tim vara transected, och över 6 månaders transections, inklusive över 3600 djur, 98,75% ± 0,72% överlevde fram till 7 dagar efter skada (dpi). Våra data visar snabb återhämtning av sensorisk och förflyttning samt: vid 1 dpi, all rörelse av den skadade fisken drivs av endast bröstfenan förflyttning. Men larver börja svara på volfram nål beröring caudal till transection med 2 dpi, återupprättar C-böj rörelser med 3 dpi, och visa underprissättning bad med 5 dpi ^11. Med hjälp av antikroppar färgning mot acetylerad tubulin, har vi bekräftat att axoner är frånvarande från skada plats på 1 dpi, men har passerat skada plats med 5 dpi. Vi tror att detta protokoll kommer att ge en värdefull teknik för studier av axonal återväxt och neurogenes i ryggmärgen efter skada.

Protocol

Zebrafisk höjdes och uppvuxna i enlighet med standardförfaranden; experiment godkändes av University of Utah Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Beredning av kirurgi Plates

1. Gör kirurgiplåtarna med 60 mm petriskålar och Sylgard 184 silikonelastomer Kit, enligt tillverkarens instruktioner. Fyll rätter inte mer än halvfullt och låt polymerisera. Affär täckt i rumstemperatur.

2. Beredning av Mikro

1. Tillverka mikropipetter genom att värma och dra tunnväggiga borosilikatglas kapillärrör i en mikropipett avdragare med samma inställningar för att göra mikroinjektion nålar.
2. Enligt en dissektion mikroskop, bryt av spetsen på mikropipett till cirka 200 mikrometer i diameter med pincett.
3. Bevel bruten kant med en microgrinder initialt till 35 ° C, följt av en andra avfasning på 25 °. Se till spets är skarp och SMOOTH. Butiks färdiga avfasade mikropipett i en petriskål på en liten mängd lera.

3. Beredning av Zebrafish Larver

1. 7 dagar före operation, inrätta parning tankar med manliga och kvinnliga zebrafisk.
2. Samla embryon följande morgon, 3 timmar efter lampor tänds för att säkerställa maximal avkastning. Vid användning av en transgen reporter linje såsom Tg (elevl3: EGFP) ^knu3, sortera befruktade embryon 100/100 mm platta i 25 ml E3 vid 28,5 ° C. Vid användning av vildtyp, sortera befruktade embryon 25/100 mm platta i 25 ml av E3 vid 28,5 ° C.
3. Om du använder en reporter linje, screena embryon för fluorescerande uttryck vid 48 HPF. Tillåt identifierade embryon att mogna vid en densitet av 25/100 mm platta i 25 ml av E3 vid 28,5 ° C.
4. När larverna är 5 DPF, förbereda operationen plattan genom att täcka Sylgard med E2 + 10 mg / L gentamycinsulfat (GS) + Tricaine.
   1. Förbered återhämtning maträtt genom att tillsätta 25 ml E2 + GS till en 100 mm petri distim.
   2. Förbered skalpell genom att tejpa ihop tre kompresser. Detta kommer att bilda ett triangulärt verktyg med tre skåror.
   3. Montera en förberedd mikropipett på kompresser genom att tejpa den till ett av spåren.
5. Om återanvända mikropipetter, spola tills klar med E2 + GS med hjälp av en 1 ml spruta och en 27 G nål före montering på bomullstoppar.

4. Kirurgi

1. Bedöva 1 tallrik larver i taget (25 fisk) med Tricaine. Fisk är tillräckligt bedövad när de inte längre uppvisar anslagskänslighet. Det är viktigt att fisken är helt bedövad före operationen, annars kommer de att rycka när skalpellen rör vid dem. Kirurgi utförs under en dissektion mikroskop.
2. Överför larver till operation platta.
   1. Under maximal förstoring, rotera en larv i taget så att den ligger på sidan med ryggen närmast handen med skalpell.
   2. Position pincett så att de vilar på Sylgard,vinklad över bredden på larven.
   3. Stagning glas skalpell mot en av armarna av pincett, skuren i den dorsala laterala sidan av larven i nivå med anal por, vara noga med att inte skära bortom den ventrala kanten av notochord. Vrid skalpell för att avskilja ryggmärgen.
   4. Upprepa med resterande larver.
      Observera: om en larv blöder, kommer det inte att återhämta sig från det kirurgiska ingreppet. Ta omedelbart larven från operationen plattan och avliva den via Tricaine överdos.
3. När kirurgi på partiet av larver är klar, överföring skadade djur till återvinningsplattan. Detta är för att stödja clearing av anestesi.
   1. Varning: när du samlar skadade larver för överföring, se till att de samlas huvud eller svans först: inte betona skada plats genom att böja larverna.
      OBS: Alla apparater som används för kirurgi kan återanvändas, inklusive mikropipetter.

5. Återvinning

1. Transfer skadade larver från återställnings plattan till 100 mm plattor fyllda med 25 ml E2 + GS vid en densitet av 25/plate. Låt återhämta sig i en 28,5 ° C inkubator.
2. Kontrollera plattor dagligen, ta bort sjuka och döda djur. Ändra inte medierna förrän Coleps (sötvatten protozoer) är synliga i media. Vid byte av media, inte överför fisken till en ny platta; stället, ta bort så mycket media som möjligt och översvämma samma plattan med nya medier. Upprepa vid behov för att minska Coleps befolkning.
3. Feed dagligen med en liten mängd pulveriserad steka mat.
   Obs: Live-mat (t.ex. paramecia eller hjuldjur) kan inte matas till skadade larver förrän efter att de har återhämtat förflyttning. I annat fall kommer den levande föda kolonisera skada plats och dödar larverna.

Representative Results

För att minska svårighetsgraden av vävnadsskada som omger skada plats, är kritisk korrekt avfasning av mikropipetten. Figur 1A visar en korrekt fasad spets. Med hjälp av ett tips som är för bred (Figur 1B) tenderar att leda till högre dödsfall på grund av den ökade risken för nicking rygg aorta, medan ett tips som är för smal (Figur 1C) tenderar att titta bort från huden i stället för att skära vävnad.

För att praktisera denna teknik, är det fördelaktigt att använda en reporter linje såsom Tg (elevl3: EGFP) ^knu3 att visualisera ryggmärgen Figur 2A visar en helt transected ryggmärg från en levande Tg (elevl3: EGFP). Zebrafisk vid en dpi, . medan Figur 2B visar samma levande fisk vid 3dpi Figurerna 2C och 2D visar större förstoring skada plats vid 3 dpi i fast Tg (dbx1a: EGFP) fisk som har sammplete (figur 2C) eller ofullständig (Figur 2D) ryggmärgen transection. Notera den angränsande regionen i neuron märkning längs den ventrala kanten av ryggmärgen (gul pil).

Figur 1. Jämförelse av skalpell kanter. A visar en korrekt fasad mikropipett spets lämpar sig för kirurgi. Denna storlek är lätt rengöras för återanvändning. B visar en avfasad mikropipett spets för bred för kirurgi på en 5 dpf larv. C är ett exempel av en spets som är för smal. Denna storlek är mycket svårt att rengöra för återanvändning, och tenderar att främja en sågning verkan av transektion istället för kapning D:. Tecknad av lesioning verktygsenheten. Tre 6 "pinnar är kapslade i en pyramidal form och tejpade ihop. Skalpellen vilar i ett av spåren som bildas av de tre bomullstoppar, och tejpas på plats.

.. Figur 2 Verifiera komplett transection Fluorescerande konfokalmikroskopi användes för att bilden levande Tg (elavl3: EGFP) fisk in vivo vid 1 dpi (A) och 3dpi (B). För att bekräfta komplett transection var dessa bildstaplar sedan bearbetas i ImageJ (rsbweb.nih.gov) för att generera maximal intensitet Prognoser (MaxZ) som visas i A - B C - D visar MaxZ projektioner av Huc / D märkt Tg (dbx1a.: EGFP) fisk på 3 dpi med fullständig spinal transektion (C) eller ofullständiga transektion (D).Gula pilar identifiera skada plats, D = rygg, R = rostrala. Scale bar = 100 | im.

Discussion

När lära sig från början denna teknik, rekommenderar vi försöker inte mer än 50-100 transections i en enda session. Efter att behärska denna teknik, kan vi för tvärsnitt av upp till 300 embryon per timme; Men, denna nivå av genomströmning kräver några månaders vecko praxis. Vi rekommenderar även att öva med en reporter linje och verifiera fullständig transektion tills förekomsten av ofullständig ryggmärgstransektion reduceras till mindre än 1%.

Ryggmärgen transektion i den vuxna zebrafisk är en väl etablerad och robust teknik för att studera axonal återväxt och neurogenes efter skada. Genom att flytta denna analys i larv organismen, vi har möjlighet att se återhämtning in vivo. Dessutom är vi också kunna utnyttja genetiska verktyg som inte finns i den vuxna zebrafisk att undersöka rollerna av olika gener i den regenerativa processen, till exempel, Tcf7l1a ^12.

Ursprungligen developed att studera neurogenes efter ryggmärgstransektion, kan denna metod även användas för att undersöka återhämtning av sensorisk funktion: skadade djur uppvisar en respons för beröring kaudalt om skadestället efter två dpi och axonerna korsat skada plats genom 5 dpi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3