Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Summary

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Abstract

Protéines de canaux ioniques sont des dispositifs universels de communication rapide à travers les membranes biologiques. La signature temporelle du flux ionique qu'ils génèrent dépend des propriétés intrinsèques de chaque protéine de canal ainsi que le mécanisme par lequel il est généré et contrôlé et représente un domaine important de la recherche actuelle. D'informations sur la dynamique de fonctionnement des protéines de canal ionique peut être obtenue par l'observation de longues étendues de courant produites par une seule molécule. Décrit ici est un protocole permettant d'obtenir un canal de patch-clamp enregistrements actuels attachés cellulaires pour un canal ionique ligand fermée, le récepteur de NMDA, exprimé de manière hétérologue dans des cellules HEK293 ou nativement dans les neurones corticaux. Également des instructions sur la façon d'adapter la méthode à d'autres canaux ioniques d'intérêt en présentant l'exemple du canal PIEZO1 mécano-sensible. Cette méthode peut fournir des données concernant les propriétés de conductance de la chaîne et la séquence temporelle de l'OPEconformations n-fermées qui constituent le mécanisme d'activation de la chaîne, aidant ainsi à comprendre leurs fonctions en matière de santé et de la maladie.

Introduction

Communication rapide à travers les membranes biologiques repose presque exclusivement sur les oligomères pores formant les protéines membranaires, communément appelées canaux. Ces protéines sont très différentes dans les signaux d'activation, les mécanismes de déclenchement et les propriétés de conductance. protéines de la Manche dont les pores sont sélectifs pour les ions sont classés comme des canaux ioniques; leur activation produit des courants ioniques à travers la membrane, et leurs réponses peuvent être enregistrées avec une haute résolution en temps réel en utilisant des techniques électrophysiologiques. Les signaux d'activation couvrent un large éventail de produits chimiques et physiques, y compris des gradients de concentration, les forces mécaniques et électriques, et de la température; ainsi, une classification supplémentaire des canaux ioniques dans ligand fermée, mécano, tension fermée, ou types sensibles à la chaleur. Dans cet article, les protocoles sont décrits pour enregistrer l'activité d'un canal à partir d'un canal de ligand fermée, le récepteur de NMDA, et d'un canal mécanosensible, PIEZO1, en utilisant la technique de patch-clamp.0;

Patch-clamp électrophysiologie est le premier et le plus largement utilisé la méthode expérimentale suffisamment sensible pour permettre l'observation de molécules simples ^{1, 2.} En plus de cette sensibilité exquise, il a considérablement élargi les préparations biologiques qui se prêtent à l'enregistrement électrophysiologique et a également permis l'observation des canaux ioniques dans les membranes intactes. Tout d'abord, parce que les deux serrage de tension et l'enregistrement de courant sont réalisées avec la même électrode, il peut être utilisé pour enregistrer des signaux à travers les petites membranes des cellules ou des patchs. La technique a révélé que les canaux ioniques sont pas limités à membranes excitables des muscles de la grenouille, electroplaques d'anguilles, ou axones géants de calmar ^{3, 4,} mais plutôt qu'ils représentent appareils omniprésents de mécanismes de signalisation transmembranaires et sont intrinsèques à tous les types de membranes cellulaires des uni-ou organismes multicellulaires, et aussi à des membranes intracellulaires. Importerantly, la capacité d'enregistrer des courants transmembranaires en attachant simplement une pipette en verre à une cellule intacte l'occasion sans précédent pour enregistrer l'activité de canaux ioniques dans leurs membranes natives sans perturbation. Ainsi, l'attaché technique de patch-clamp cellule, qui est décrite dans ce protocole, permet le suivi de l'activité des canaux ioniques en continu pendant des dizaines de minutes ou plus dans leur environnement naturel.

Sous fluctuations thermiques normales, toutes les protéines, y compris les protéines de canaux ioniques, subissent des changements structuraux sur une échelle de temps grande, avec les réarrangements les plus rapides et les plus fréquemment représentés le plus probable par les mouvements de la chaîne latérale et beaucoup plus lentes modifications et moins fréquentes représentés par le repositionnement de l'ensemble de des domaines ou des sous-unités, ou dans certains cas par des modifications post-traductionnelles ou des interactions protéine-protéine ^{5, 6.} Observant de longues périodes d'activité générés par une molécule peut aider à comprendre la fonctiondynamique internationales des canaux ioniques dans les membranes intactes physiologiques et fournit des informations précieuses sur le mécanisme de fonctionnement de la molécule observée.

Contrairement à la compréhension croissante de la diversité des canaux ioniques dans des types de cellules et les stades de développement, les connaissances sur la composition moléculaire des canaux ioniques dans les membranes natives est encore limitée. Tous les canaux ioniques sont des protéines multimériques et la majorité des canaux ioniques natifs assembler à partir de plusieurs types de sous-unités produisant des protéines de grande diversité moléculaire, qui est souvent accompagnée par des propriétés de conductance et de déclenchement divers. Pour cette raison, les canaux ioniques de la composition moléculaire définie sont étudiés lors de l'expression dans des systèmes hétérologues. En particulier, les cellules HEK293, qui sont une lignée clonale de cellules embryonnaires de rein humaines immortalisées ^7, acquis une large acceptation en tant que le système préféré pour l'expression hétérologue des canaux ioniques recombinants. Parmi l'hommeavantages y qui a élevé les cellules HEK293 que le système de choix pour les canaux ioniques électrophysiologie sont la facilité et l'accessibilité de la culture et le maintien de cultures à long terme stables, leur capacité à mener à bien pliage post-traductionnelle, la transformation et le trafic de protéines de mammifères, et dans de nombreux cas , leur faible niveau voire l'absence d'expression endogène pour le canal d'intérêt ^{7, 8.} Exprimant canaux ioniques recombinantes et d'étudier leurs propriétés fonctionnelles dans les cellules HEK293 continue d'être une approche intéressante pour obtenir des informations sur les propriétés de structure-fonction des canaux ioniques ainsi que les propriétés spécifiques des isoformes de canaux ioniques et leurs rôles dans le tissu natif. Les protocoles décrits dans cet article peuvent être appliquées aussi bien aux canaux ioniques recombinants exprimés dans des cellules HEK293 et ​​de canaux ioniques natifs.

En résumé, la technique de patch-clamp, grâce à sa capacité sans précédent pour résoudre le signals d'une molécule demeure, à ce jour, la méthode la plus directe pour observer le comportement des molécules simples. Dans son mode cellule attachée, l'enregistrement de patch-clamp permet longues périodes d'observation qui, après l'avoir fait pour une molécule, peuvent fournir des renseignements de qualité exceptionnelle dans le fonctionnement des canaux ioniques. Ci-dessous est présenté un protocole permettant d'obtenir des enregistrements de courant à haute résolution à partir de patchs attachés de cellules contenant une protéine de canal ionique.

Protocol

1. Culture cellulaire et l'expression des protéines

1. Maintenir des cellules HEK293 (numéro ATCC CRL-1573) entre les passages 22 et 40, qui comprend des passages effectués par l'ATCC, en culture monocouche dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / mélange streptomycine à 5% de CO ₂ et 37 ° C. Entre expériences, les cellules de passage dans des flacons T25 à 5-20 dilutions dans un volume final de 10 ml. Remarque: En utilisant des cellules au cours de ces passages garantit la santé des cellules favorable qui permettra la formation de joint optimal et stabilité de patch.
2. Pour la transfection, les cellules HEK293 plaque dans des boîtes de 35 mm à une densité d'environ 10 ⁵ cellules / boîte, ce qui correspond à ~ 0,5-0,6 ml de suspension de cellules par boîte et cultiver des cellules dans 2 ml de milieu pendant 18-24 h.
3. Dans 1,5 ml d'un tube de centrifugation stérile, préparer le mélange de transfection pour les quatre boîtes de 35 mm par l'addition (dans cet ordre): (1) 1 pg de chaque ADNc (GluN1, GluN2A, et GFP); (2) 315 ul d'eau bidistillée (ddH ₂ O); (3) 350 ul de 42 mM de 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES), et (4) 35 ul de 2,5 M de _CaCl2 goutte à goutte, qui est utilisé pour former le précipité.
4. tube vortex pendant 5 secondes et ajouter 175 ul de suspension transfection dans chacune des quatre boîtes de 35 mm le jour avant plaqué, qui contient maintenant les cellules à 50-60% de confluence, et incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 heures.
5. Aspirer le milieu de transfection, les laver avec du PBS et le remplacer par 2 ml de milieu de croissance supplémenté avec 2 mM de _MgCl2 pour empêcher récepteur NMDA excitotoxicité médiée ^9. Remarque: Les cellules peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques 24-48 heures après transfection.

2. Préparation de l'électrode

1. Générer deux pipettes d'enregistrement symétriques par traction sur des tubes en verre de borosilicate avec une traction verticale. Sur la base de la taille et de la géométrie de la pointe qui en résulte, en outre pipettes de formeen utilisant une polisseuse. Remarque: La taille de la pointe peut être évaluée visuellement et électriquement. Visuellement, le diamètre extérieur devrait être de l'ordre de 1.4 à 5.6 um. Électriquement, une pointe de taille optimale, quand il est rempli avec une solution extracellulaire, devrait produire des résistances dans la gamme de 12-24 MQ (voir figure 2B).
2. Utilisez une solution de la pipette, qui pour des expériences attaché cellulaires représente le milieu extracellulaire qui produira l'activité du canal maximale et des amplitudes de courant élevées. Remarque: Pour les récepteurs de NMDA, ce qui correspond à une solution contenant des concentrations saturantes d'agonistes (glutamate et la glycine), 1 mM EDTA, qui chélate inhibiteurs bivalents cationiques et les bloqueurs, et a des concentrations physiologiques de sodium (150 mM) en tant que seul ion perméant ( en mM: 1 glutamate, glycine 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, et 10 HEPBS, tamponnée à pH 8,0 avec NaOH 1 N).

3. Cell-joint patch-clamp enregistrement

1. Ouvrir acquisition de données QUB logire (www.qub.buffalo.edu), et sélectionner la fenêtre d'acquisition en vertu de "layout". Ouvrez un nouveau fichier de données QUB (FKD) en cliquant sur «Nouvelles données» dans le menu déroulant intitulé "Fichier" et entrez les paramètres initiaux suivants: taux d'échantillonnage, 40 kHz; Une mise à l'échelle de D /, 3000; canal de sortie, 1; et la taille des données A / D, 2. Réglez la mise à l'échelle d'amplitude de 0,1 V / pA par un clic droit sur le fichier de données, la sélection des propriétés, et en cliquant sur l'onglet «Données». Remarque: Ces paramètres peuvent être affinés pour chaque configuration en utilisant un modèle de cellules en mode cellule attachée. Instruction complémentaires sur l'acquisition de données avec le logiciel Qub et propriétés QDF sont en ligne à www.qub.buffalo.edu.
2. Sélectionner une boîte de 35 mm contenant des canaux ioniques et des cellules exprimant remplacer le milieu de croissance avec 2 ml de PBS contenant du calcium et du magnésium; monter le plat sur la platine du microscope et de se concentrer sur le domaine cellulaire utilisant la microscopie à contraste de phase afin d'évaluer que les cellules sont en bonne santé et bien attachés à l'antenneen mode monocouche (figure 1A). Commutateur de détection de fluorescence pour vérifier que la transfection a été un succès (Figure 1B). Remarque: La gamme des intensités de fluorescence peut être utilisée comme une mesure brute de l'expression des protéines.
3. Pour l'enregistrement d'un seul canal, régler le gain de l'amplificateur de sortie à x10, la configuration de patch à β = 1, le filtre analogique à 10 kHz, le mode de voltage-clamp et de tension appliquée à 100 mV. Avec la commande de maintien de la tension dans la position OFF, sélectionnez le bouton «test d'étanchéité.
4. Basé sur la fluorescence et la santé des cellules, sélectionnez une cellule de patcher. Vérifiez sous contraste de phase que la cellule est bien fixé sur le plat, a une grande partie de la surface de la cellule exposée pour patcher, et semble en bonne santé. Remarque: Maintenir éclairage à contraste de phase pour éviter le blanchiment de la cellule lors de l'approche et de patch-clamp.
5. Remplir une pipette fraîchement poli avec juste assez de solution de sorte qu'il entre en contact avec la electrode et le secouer doucement pour éliminer les bulles d'air qui peuvent être piégés dans la pointe. Fixer la pipette d'enregistrement sur la headstage amplificateur en serrant la vis d'étanchéité du support de pipette et faire en sorte que le fil d'argent est plongé dans la solution de la pipette.
6. L'utilisation d'un petit (5 cc) de seringue en matière plastique, qui est reliée au porte-pipette par un tube, appliquer délicatement une pression positive pour empêcher les impuretés de pénétrer et de boucher l'embout lors de l'approche (Figure 2A).
7. Utilisation du micromanipulateur, diriger la pipette dans le bain et la positionner directement sur ​​la cellule sélectionnée pour patcher (figure 1C), la fermeture du circuit électrique. Prenez note de l'oscilloscope, qui devrait indiquer une forme d'onde rectangulaire correspondant à joint le signal test de l'amplificateur (figure 2B). Remarque: Lors de l'entrée dans le bain, la résistance à la pipette dans la plage optimale est 12-24 MQ. Pour un signal de test de 5 mV, le courant mesuré range correspond à ~ 20-40 pA.
8. Tout en contrôlant visuellement la position de la pipette à travers la résistance de microscope et électriquement pipette sur l'oscilloscope, continuer l'approche par petits incréments jusqu'à ce que la pipette empiète légèrement sur ​​la cellule, et le signal de test diminue légèrement pour indiquer une résistance accrue (figure 2B).
9. Pour former un joint d'étanchéité, ramasser la seringue et appliquer une légère pression négative à travers la tubulure latérale en tirant le piston de la seringue, ce qui tire la membrane cellulaire dans la pointe de la pipette d'enregistrement et initie la formation d'un joint de résistance à la GQ ^10. Prenez note de la forme d'onde du signal essai sur l'oscilloscope, dans lequel la formation de joint est indiqué par son aplatissement complet, avec seulement transitoires capacitifs visibles (figure 2B). Remarque: Si le signal ne s'aplatit pas complètement ou la ligne de base devient bruyant, ce qui indique un joint faible avec courant de fuite importante autour du joint. Cela permettra d'éviter resolving une courants des canaux. Si c'est le cas, retirer la pipette de la cellule et à l'écart de la salle de bain, le retirer de la scène de la tête et le jeter. Répétez le processus avec une pipette fraîchement poli jusqu'à l'obtention d'un joint dans la plage adéquate (≥ 1 GQ).
10. Sur l'amplificateur, passer la commande à bascule externe de «test d'étanchéité 'à' off '; passer la commande de maintien de tension positive (qui a été précédemment définie sur 'off'); et augmenter le gain de x100. Observer l'oscilloscope pour l'activité du canal, qui, s'il est présent, sera affiché comme déviations carrés à la hausse de la valeur de référence préalablement plat (figure 2C).
11. Si l'activité du canal est affiché sur l'oscilloscope, l'acquisition de données dans le fichier numérique précédemment ouvert dans QUB, en appuyant sur le bouton 'play' puis sur le bouton 'record'. Pour arrêter l'acquisition de données, appuyez sur le bouton d'arrêt dans QUB, et enregistrer le fichier à un FKD facilement retrievLieu pouvoir sur le disque dur de l'ordinateur en sélectionnant «Enregistrer les données sous ..." dans le menu déroulant intitulé "Fichier".

4. Données prétraitement et idéalisation

Remarque: Informations importantes peut être extrait à partir d'enregistrements de canal unique par des analyses statistiques qui attribue à chaque point de données pour une classe de conductance approprié (dans le cas le plus simple, fermée ou ouverte). Ce processus est appelé idéalisation de données et une brève description de l'idéalisation de données avec les moyens de k segmentaires (SKM) méthode ¹¹ Qub est décrite ci-dessous.

1. Ouvrez le fichier de données dans QUB, et voir les traces de courant dans l'interface 'Pre' sous "layout". Afficher le fichier enregistré non filtré (retirer le filtre numérique) en décochant la case «Fc».
2. Visuellement analyser le dossier de repérer les irrégularités et les artefacts (figure 4A). Brèves pointes de courant corrects qui occur dans la trace (figure 4A) en sélectionnant une région propre à côté de la même classe de conductance, soulignant cette région, un clic droit et en sélectionnant «tampon d'effacement définir. Zoom sur la pointe jusqu'à ce que des points d'échantillonnage individuelles sont visibles, sélectionnez la région à remplacer et effacer en soulignant que cette région, puis cliquez à droite sur «effacement».
3. Définir la ligne de base zéro de courant pour l'ensemble du dossier en sélectionnant une première partie de l'enregistrement où la base est stable, point culminant, faites un clic droit et sélectionnez "Définir la référence. Vérifiez que la ligne directrice qui apparaît précision représente le niveau de base (violet dans la figure 4B)
4. Identifier les points dans le dossier où la base de données brutes s'écarte visiblement de l'ensemble de base. Corriger en sélectionnant une petite section de la ligne de base dans la région de déviation, cliquez-droit et sélectionnez la commande 'ajouter un nœud de base ».
5. Identifier les régions du til enregistrement contenant excès de bruit ou d'artefacts qui ne peuvent être facilement corrigées (figure 4C). Mettez en surbrillance la région à être jetés, faites un clic droit et sélectionnez «supprimer». Remarque: Dans ce cas, l'information cinétique sera perdu: l'enregistrement traité sera plus courte et les points qui se produisent après le point de jonction sera semblent être continue avec la région pré-bruit.
6. Pour idéaliser enregistrements à l'aide de l'algorithme de SKM ^11, surligner une partie de la trace contenant à la fois ouvert et fermé les événements et entrer dans l'interface 'Mod' sous 'Mise en page. Dans le panneau «modèle», sélectionnez une partie propre de la trace qui est représentatif de la ligne de base dans tout le fichier, cliquez droit sur le carré noir (état fermé) et sélectionnez "saisir". Faites de même pour les ouvertures de canaux en mettant en évidence la conductance ouvert, cliquez droit sur le carré rouge dans le panneau "modèle" et sélectionnez "saisir".
7. Effectuer le idéalisationtion pour l'ensemble du dossier en sélectionnant le bouton «Fichier» sous «Data Source». Faites un clic droit sur l'onglet «idéaliser» sous la section «Modélisation» pour vérifier que les paramètres souhaités pour l'analyse sont corrects, puis cliquez sur «Exécuter». Le résultat de l'idéalisation, et aussi d'histogramme d'amplitude pour l'ensemble du dossier, est recouvert avec les données pour permettre une inspection visuelle de l'idéalisation (figure 5). Remarque: idéalisation inadéquate peut entraîner la génération de «faux événements, 'dans lequel QUB détecte les ouvertures et fermetures qui ne sont pas produits réellement canal. De la résolution d'enregistrement, qui est fixé par le filtre analogique de l'amplificateur et de la fréquence d'échantillonnage, la résolution avec laquelle SKM détecte les événements ouverture et de fermeture peut être contrôlée en réglant un temps mort pour les analyses. Temps morts optimales doivent être choisis par essais et erreurs et dépendent de la fréquence d'échantillonnage, cependant, une bonne règle de base estpour sélectionner un temps mort qui est de 2-3 échantillons ^12.
8. Pour vérifier que l'idéalisation représente avec précision les données brutes, rechercher manuellement la trace idéalisée. Lors de l'identification d'erreurs dans l'idéalisation, mettre en évidence la trace sur le faux événement, faites un clic droit et sélectionnez "S'inscrire IDL. ' Remarque: Pour des options supplémentaires et une explication détaillée des diverses commandes et fonctions QUB, consulter le manuel en ligne QUB (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Recombinant récepteurs NMDA

Récepteurs NMDA se lient et de répondre à l'action concomitante des deux co-agonistes: glutamate et la glycine. Ils assemblent comme hétérotétramères de deux sous-unités glycine GluN1 et sous-unités GluN2 liaison deux glutamate de liaison. Sous-unités GluN2 sont codés par quatre gènes (AD) et de ces formes les plus largement transcrites dans le cerveau sont GluN2A chez les adultes et chez les animaux jeunes GluN2B. En raison de la diversité des NMDA-types de récepteurs dans des préparations natifs, exprimant des récepteurs dans des cellules HEK 293 (figure 1A), permet un contrôle de la composition des sous-unités, ainsi que la possibilité d'enregistrer actuel de canaux en utilisant une pipette en verre finement polie (figure 1C).

Une fois la pipette touche la cellule, une nette diminution de l'amplitude de l'impulsion de forme d'onde d'essai se produit (figure 2B), ce qui indique la capacité de former un joint d'étanchéité. Un joint d'étanchéité adéquat contenant unecanal produit une activité de canal clair, affichée comme des déviations à la baisse à partir de la ligne de base, avec un bon rapport signal sur bruit lors de l'application d'une tension positive (figure 2C). L'activité du canal maximale de type sauvage récepteurs NMDA recombinante peut être atteint lorsque les deux agonistes sont présents dans des concentrations élevées, et lorsque les inhibiteurs et les bloqueurs de canaux sont absents. Cette solution est idéale, de sorte que quand un patch contient plus d'un canal, les ouvertures simultanées sont immédiatement apparents ¹³ (figure 3B). Pour les protéines ayant une activité très faible, la probabilité qu'un tronçon de la une des ouvertures de niveau provient d'un seul canal peut être calculée si la probabilité canal ouvert est connu ou peut être approximée ^14. De ce fait, les périodes d'observation plus longues peuvent être nécessaires.

Dans ces conditions, et d'application d'un potentiel de maintien de la pipette de 100 mV (conduisant à un potentiel de membrane d'environ -120 mV), siGluN1/GluN2A recombinant ngle et GluN1/GluN2B sont ouverts avec une forte probabilité (P _o, 0,3-0,5) à un niveau de conductance relativement élevé (> 50 pS) (figures 3A et 5B) ^15-17. Lors de l'enregistrement, les pointes de courant de bruit, les dérives de base, ou des périodes de bruit excessif peuvent se manifester (figures 4A-C), mais comme mentionné, ceux-ci peuvent être corrigées si brève et mineur. Il est important, cependant, que l'activité du canal est enregistré sans interruption pendant un laps de temps suffisant (≥ 10 min, 10 000 événements) afin de garantir que toute l'étendue de comportements de canal est capturé.

Les données obtenues à partir de ces enregistrements peuvent fournir des informations sur les cinétiques de canaux et propriétés de perméation. Ici, nous démontrons idéalisation effectuée par QUB en utilisant l'algorithme de SKM (figure 5A), mais l'idéalisation de données peut être réalisée à l'aide d'autres logiciels tels que pClamp ou SCAN ^12, une peut être effectuée en utilisant différents algorithmes ou des critères, tels que la méthode de la moitié de seuil, avec chacune de ces options contenant leurs propres avantages et inconvénients. Montage de ces données à des modèles cinétiques peuvent être effectuées afin d'obtenir d'autres renseignements sur les comportements du canal ionique. Montage du maximum de vraisemblance peut être effectué avec un logiciel comme QUB ou HJCFIT ^18, dans lequel les algorithmes mis en œuvre par chaque programme ont leurs propres avantages. Bien que l'idéalisation démontré sur la figure 5 ne nécessite que le modèle le plus simple possible d'un état ​​fermé et un état ​​ouvert à effectuer, ajustement d'un modèle cinétique complet pour un canal ionique requiert ajoutant successivement fermé et l'état ouvert jusqu'à un certain critère est atteint. Ce processus a montré que les récepteurs de type sauvage de GluN1/GluN2A ont cinq états fermés cinétique distinctes et de deux à quatre Etats ouvertes cinétique distinctes (figure 5C) ^19, dans laquelle ceux-ciCaractéristiques de déclenchement sont essentiels pour déterminer la forme du signal médiée par récepteur NMDA synaptiques ^{20, 21.} Ce type d'analyse peut être étendue à d'autres canaux ioniques de petite conductance, tels que les récepteurs AMPA, d'avoir un aperçu de leurs propres mécanismes de déclenchement distincts ^22,23,24. Une mise en garde est, cependant, puisque les récepteurs AMPA ont plusieurs niveaux de conductance, idéalisation succès en utilisant QUB peut demander aux États supplémentaires sont incorporées dans un modèle prédéfini.

Ces méthodes peuvent également être étendues à d'obtenir des informations sur la perméation de canal ionique et de la conductance en modifiant la composition et / ou la concentration d'ions imprégnant. Enregistrement de l'activité par l'intermédiaire des récepteurs de GluN1/GluN2A simples en utilisant les procédés décrits ici, mais en remplaçant NaCl 150 mM avec 75 mM de _CaCl2 dans la pipette d'enregistrement, on obtient des courants avec ~ 20% de la conductance (~ 10 pS). Cela démontre que tandis que le calcium pénètre récepteurs NMDA au salutle taux de GH dans des conditions physiologiques, il traverse effectivement le canal plus lentement que les ions sodium, ce qui indique qu'il peut y avoir un site de liaison de calcium à l'intérieur de la voie potentielle de perméation. En outre, malgré cette petite conductance, les enregistrements peuvent être idéalisés adéquatement en utilisant l'algorithme SKM dans QUB, dévoilant l'existence d'une conductance sous-niveau intermédiaire, qui est d'environ 50% l'amplitude du courant du niveau de conductance principal (figures 6A et B). Ces ouvertures subordonnés, cependant, ne peuvent être idéalisés dans QUB quand une classe de conductance supplémentaire est intégré dans le modèle cinétique initiale. D'autres analyses cinétiques ont révélé que, dans ces conditions, les récepteurs présentent encore cinq états fermés cinétique distinctes, mais ces États ont très différentes constantes et occupations temps par rapport au moment où le canal passe seulement ions sodium (Figure 6C). En outre, seuls deux états ouverts sont observées under ces conditions démontrent que, en plus d'influencer le canal conductance, les ions calcium sont capables de moduler la transmission sélective du récepteur.

Il n'existe aucun moyen sûr d'obtenir un seul correctifs de canal. Au lieu de cela, plusieurs manipulations expérimentales peuvent contribuer à augmenter les chances de succès. Tout d'abord, l'objectif pour le faible niveau d'expression de canal par l'évaluation de l'intensité de fluorescence des cellules transfectées (Figure 1B). Les approches réussies peuvent être les suivants: réduire le montant total de l'ADNc utilisé pour la transfection ou de diminuer la quantité d'ADNc pour une sous-unité nécessaire, comme c'est GluN1; pour diminuer le temps d'incubation avec l'ADN / phosphate de calcium précipité; et de sélectionner pour patcher seules les cellules faiblement fluorescentes du champ de vision. Ces approches doivent être poursuivis si les correctifs obtenus contiennent souvent de multiples canaux. En outre, en diminuant la taille de l'embout de pipette peut également contribuer à piéger un seul canal dans la CPAEh. En fin de compte cependant, on devient réussi à obtenir des correctifs à un seul canal en s'abstenant systématiquement d'enregistrer pendant de longues périodes de correctifs qui contiennent nettement plus d'un canal.

Recombinants PIEZO1 Chaînes

Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être facilement appliqués à n'importe quel canal ionique fermée de ligand, et en effet peuvent être adaptés pour enregistrer une activité de canal d'un canal ionique, si activé par des produits chimiques, de la tension, de la force, de la température, ou d'autres moyens. Un exemple de la façon dont ce protocole peut être adapté pour enregistrer une courants des canaux à partir d'autres canaux ions, spécifiquement PIEZO1 souris, un canal ionique mécanosensible, est présenté ci-dessous (Figure 7) ^{25, 26.}

Comme avec les canaux du récepteur de NMDA, PIEZO1 et GFP sont exprimés dans des cellules HEK293 par transfection au phosphate de calcium à médiation par les cellules et on utilise de 24 à 48 h après la transfection commedécrit à la section 1.2. Parce que PIEZO1 est activé par l'étirement de la membrane, il faut prendre soin de manipuler la membrane doucement pendant la formation de patch et de dispositifs appropriés pour la livraison et le contrôle de la force mécanique appliquée devrait être disponible. Ces conditions peuvent être obtenues en faisant agrandie enregistrement pipettes, avec une résistance dans la gamme de 2-3 MQ et en utilisant un dispositif de serrage de pression à grande vitesse (HSPC) relié à la pipette d'enregistrement à travers le support de pipette sur la headstage de l'amplificateur. Les paramètres de l'amplificateur sont similaires à celles décrites pour les récepteurs NMDA dans la section 3.3, sauf pour la commutation sur la commande bouton «externe» de sorte que l'amplificateur peut être contrôlé par le logiciel d'acquisition.

Pour enregistrer l'activité de PIEZO1, utiliser une pipette d'enregistrement rempli de (en mM): 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 CaCl _2, MgCl ₂ 1, 10 TEA-Cl, pH 7,3 avec du NaOH. Dans ces conditions, les ouvertures peuvent être surveillés comme icourants de sodium nward, qui apparaîtront sur l'oscilloscope comme des déviations à la baisse d'une base zéro de courant. Placez la pipette d'enregistrement sur la scène de la tête d'amplificateur et assurez-vous que le cadran sur le CSPS est à zéro. Avant d'entrer dans le bain, appliquer 3-5 mmHg de pression positive. Utilisation du micromanipulateur, abaisser la pipette dans le bain, vérifier la résistance à la pipette souhaitée, et apporter la pipette à proximité de la cellule sélectionnée comme décrit dans la section 3.6. Toucher doucement la cellule sous la direction de microscope et en surveillant l'oscilloscope, observer une légère diminution de l'amplitude de la forme d'onde de test d'étanchéité d'une manière similaire à celle effectuée pour les récepteurs NMDA (section 3.7). Libérer rapidement la pression positive appliquée par la pipette en changeant le niveau de maintien de pression de 3-5 à 0 mmHg. Attendez un joint de GQ pour former par la surveillance de la forme d'onde de test d'étanchéité. Dans ce cas, aucune pression négative est appliquée pour former un joint. Une fois une étanchéité optimale est obtenue presse le &# 8216;. Touche d'enregistrement »dans Qub à commencer à acquérir des données figure 7 montre une trace représentant de mPIEZO1 courants monocanal activés en appliquant -20 mmHg de la pression à la pipette de patch. Ces courants ont filtré passe-bas à 2 kHz et échantillonné à 20 kHz.

Contrairement aux ligands canaux fermée avec des domaines de liaison de ligand extracellulaire, le stimulus d'activation des canaux mécano peut varier de moins de 2 protocoles. Le premier est «sans interstice, 'où une pression négative constante est appliquée à la correction pour la durée totale de l'enregistrement. Ce protocole est utile pour obtenir des enregistrements longs minutes et est plus efficace avec des stimuli plus petites de pression (de 0 à 20 mm Hg), qui préservent l'intégrité de la membrane. Activité produite par haute pression, ce qui est susceptible de rompre la membrane, est le meilleur obtenu avec des enregistrements «épisodiques», où des impulsions de pressions différentes peuvent être appliquées à la pièce pour des périodes plus courtes (<strong> Figure 7). Comme avec les chaînes du ligand fermée, les enregistrements de cellules fixés un des correctifs de canaux fournissent une mine d'informations concernant à la fois la conductance et les propriétés de déclenchement du canal de l'enquête.

Neuronale récepteurs NMDA

Le procédé décrit ici pour l'enregistrement d'une cellule attachée canal peut être utilisé pour obtenir des informations sur les propriétés et la conductance des canaux de déclenchement endogène à un type particulier de cellules et / ou le stade de développement. Comme c'est le cas avec de nombreux autres canaux hétéromères, la composition moléculaire exacte des récepteurs NMDA natifs n'est pas connue. En comparant les résultats obtenus à partir de récepteurs recombinants de la composition connue avec ceux obtenus à partir de préparations natifs, des hypothèses sur la composition de sous-unité et la fonction des canaux dans leur environnement natif peuvent être formulés ou testés ^17.

Les neurones ont été isolés à partir préfrontalcortex d'embryons de rat et mises en culture pendant 6 semaines ^17. En plus des composants décrits pour les enregistrements des récepteurs de NMDA recombinants dans la section 2.2, la solution de pipette contenait également CNQX (20 uM) et de la bicuculline (10 uM) pour inhiber l'AMPA et les récepteurs GABA natifs, respectivement. En fonction de l'âge de la culture, les enregistrements obtenus à partir des récepteurs de NMDA natifs ont révélé une cinétique tout à fait différentes. Enregistrements du début (figure 8A, 5 jours in vitro) culture ressemblent plus à cinétique décrites pour les récepteurs et les enregistrements GluN1/GluN2B de la fin (figure 8B, 27 jours in vitro) les cultures se rapprochent davantage cinétique décrites pour les récepteurs GluN1/GluN2A (figures 3A et 5A). Cette observation est cohérente avec les modèles de NMDA isoformes d'expression des récepteurs et des caractérisations précises de courants enregistrés à partir de cellules attachée correctifs à un seul canal à la hanchecultures pocampal ^16.

Figure 1. Sélection d'une cellule HEK293 pour l'enregistrement ci-joint de la cellule. A) HEK293 cellules cultivées dans une boîte de 35 mm sont placées sur la platine du microscope et considérés avec contraste de phase à un grossissement de 40X. B) fluorescence de la GFP à partir du même champ visuel que dans le panneau A identifie les cellules transfectées. La flèche indique une cellule qui exprime la GFP, semble en bonne santé, et il est dans une position prête pour pipette accès. C) La pipette d'enregistrement est amené à proximité immédiate de la cellule sélectionnée en utilisant un manipulateur de mouvement amende en vertu de guidage visuel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de cette figure.

Figure 2. Portable attaché formation de joint. A) Une petite seringue est relié au côté du support de pipette permet la commande manuelle de la pression à l'intérieur de la pipette. B) Le courant traversant la pipette immergée dans une solution de bain en réponse à la vérification de l'amplificateur, qui, à 5 mV (0,5 kHz) est 18 pA, et correspond à une taille de pipette de 28 MQ. En touchant la cellule (flèche vers la gauche), le niveau de la diminution de courant observées, indiquant une résistance accrue de la pipette. En appliquant une pression négative à travers la pipette (flèche vers la droite) amorce la formation de joint d'étanchéité et réduit le signal produit par l'impulsion de test pour seulement transitoires capacitifs. C) En l'absence d'une impulsion de test, et si aucune tension n'est appliquée à travers la pipette (0 V), la ligne de base est stable (à gauche de la flèche). En appliquant une tension positive (flèche, 100 mV) pr oduces courants unitaires stochastiques qui indiquent ouvertures de canaux. Ligne pointillée rouge indique la ligne de base zéro de courant.

. Figure 3 courants cellulaires attachés enregistrées à partir de récepteurs GluN1/GluN2A A) de raccordement à une voie:. D'un segment de 50 secondes d'enregistrement continu illustre ouvertures de canal à une seule amplitude uniforme B) patch-canal multiple:. D'un segment de 50 secondes d'enregistrement continu illustre ouvertures de canal à deux niveaux d'amplitude, indiquant que le patch comprend au moins deux canaux actifs. Ligne pointillée rouge indique zéro de référence actuel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Le traitement des données Figure 4.. A) Correction pour les pointes de bruit. Affichage des données non filtrée et manuellement remplacer le signal parasite (rouge) avec le signal de référence. Vision élargie illustre une pointe avant (au milieu) et après (en bas) de la pointe (rouge) a été remplacé par le signal de référence. B) Correction de la dérive de base. Au début de l'enregistrement, sélectionnez un petit segment de la ligne de base et le définir comme le niveau zéro de courant pour l'ensemble du dossier (ligne violette). Dérive de base correct en sélectionnant une petite partie de dérivé de base (flèche) et l'ajout d'un noeud de référence (cercle violet). C) de plus longues périodes de dossier avec base bruyant (rouge) qui sont difficiles à corriger peut être supprimé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Idéalisation données. A) des traces de courant (noires) ont été enregistrés à partir d'un récepteur de GluN1/GluN2A passant seulement des ions de sodium par la technique de patch-clamp cellule attachée. Points de données idéalisées (rouge) sont illustrées pour un segment d'une chaîne de 30 sec. Ces catégories se recoupent bien, ce qui indique que l'idéalisation est exacte. B) Histogramme des amplitudes de courant illustrent une distribution qui est bien décrite par deux gaussiennes avec des pics à zéro (0,02 ± 0,8 Pa), indiquant des événements de canaux fermés et à 10,3 ± 1,3 pA indicatif d'un seul type d'événements de canaux ouverts pour la durée totale de l'enregistrement (130 min). C) fermé (à gauche) et ouverte (à droite) habitent histogrammes de temps pour l'enregistrement entière montrée dans (A). La probabilitéfonction de densité de lité pour les histogrammes (lignes épaisses) et les composants cinétiques individuelles (lignes fines) sont superposées et ont été calculés en ajustant les données à un modèle contenant cinq états fermé et trois états ouvert. Encarts fournissent la constante de temps (τ d') et de la zone par rapport (a) pour chacune des composantes cinétiques individuelles.

Figure 6. Courants de calcium par les récepteurs de NMDA simples. A) des traces de courant (noires) ont été enregistrés à partir d'un récepteur de GluN1/GluN2A passant seulement des ions calcium avec la technique du patch-clamp cellule attachée. Points de données idéalisées (rouge) sont illustrés pour 30 segment sec. B) Histogramme des amplitudes de courant illustrent une distribution qui est bien décrite par trois fonctions gaussiennes avec des pics à zéro (0 ± 0,3 pA), indicatif de prèsévénements d de canaux, de 1,3 ± 0,4 pA indicative des événements de canal ouvert à une conductance de niveau inférieur, et 2,1 ± 0,3, indiquant des événements de canaux ouverts au niveau de conductance principale. C) fermé (à gauche), le niveau de conductance principal état ​​ouvert (au milieu) et sublevel état ouvert de la conductance (à droite) habitent histogrammes de temps pour l'enregistrement entière montrée dans (A). La fonction de densité de probabilité pour les histogrammes (lignes épaisses) et les composants cinétiques individuelles (lignes fines) sont superposées et ont été calculés en ajustant les données à un modèle contenant cinq états fermés, deux principaux états ouvert au niveau de la conductance et un état ouvert de la conductance de niveau inférieur. Encarts fournissent la constante de temps (τ d') et de la zone par rapport (a) pour chacune des composantes cinétiques individuelles.

Figure 7. Portable attaché un enregistrement de canalde mPIEZO1 exprimé dans les cellules HEK293. L'activité est déclenchée par l'application de pression de -20 mmHg avec un dispositif CSPS par la pipette de patch, lors de l'application constante de la tension (80 mV). Ligne pointillée rouge indique le niveau zéro de courant.

Figure 8. Portable attaché un enregistrement des chaînes de canaux natifs. La pipette a été attaché à la soma d'un neurone qui a été dissocié du cortex préfrontal d'un embryon de rat et a été maintenue en culture pendant 5 jours (A) ou 27 jours (B) . L'activité du récepteur NMDA a été enregistrée en continu avec des solutions de pipette contenant le glutamate (1 mM) et de glycine (0,1 mM), et également CNQX (20 uM) et de la bicuculline (10 uM) pour inhiber l'AMPA et les récepteurs GABA natifs, respectivement. L'activité a été provoquée par l'application de 100 mV through la pipette d'enregistrement. Ligne pointillée rouge indique le niveau zéro de courant.

Discussion

Dans le domaine de canal ionique, un domaine important de la recherche est consacrée à la compréhension de la séquence d'événements qui conduit à la voie d'ouverture ou le mécanisme de déclenchement de la voie. Pour la plupart des canaux, ce processus est complexe et implique plusieurs étapes cinétiques qui ne peuvent être déduites à partir d'un signal multicanal macroscopique. En revanche, les expériences peuvent être conçus où l'observation de la séquence des événements ouverts / fermés dans l'enregistrement de canal unique peut produire des informations plus détaillées sur les mécanismes gating. Dans les procédés décrits ici, le domaine de liaison du ligand situé à l'extérieur possédé par les récepteurs NMDA permet enregistrements patch-clamp minimalement invasives à effectuer dans des conditions constantes. Ce protocole peut être nécessaire d'adapter afin de convenir d'enquêter sur d'autres canaux gated de ligands d'ions en fonction de deux ligand et les propriétés des récepteurs.

Enregistrements de l'activité du canal unique offrent deux types d'informations précieuses. En premier lieu,car l'amplitude du courant unitaire peut être mesuré directement, les expériences peuvent être conçus pour obtenir des informations sur les propriétés des pores tels que la conductance des canaux, la perméabilité et la sélectivité. Deuxièmement, parce que la durée des événements ouverts et fermés peut également être mesuré directement à partir de l'enregistrement, les expériences peuvent être conçus pour obtenir des informations à propos de déclenchement cinétique et donc, faire des inférences sur le mécanisme de fonctionnement du canal. Pour les deux types d'expériences, une analyse statistique significative nécessite binning chaque point individuel de la trace actuelle à une classe de conductance spécifique. Présenté ici a été un tel procédé de cette façon, en utilisant les segments k-means (SKM) ¹¹ algorithme, cependant, cela peut être accompli par plusieurs algorithmes plus ou moins sophistiqués, y compris demi-seuil, SCAN ^12, Baum-Welch, de Viterbi, etc

Enregistrements à l'aide de la configuration cellule attachée sont puissants en ce que les canaux ioniques sont conservés dans biologiquemembranes avec les milieux intracellulaires non perturbés. Pour cette raison, il est crucial que opercules sont adéquatement formés et conservés tout au long de l'enregistrement pour deux raisons: 1) la continuité expérimentale et 2) le maintien d'un rapport favorable signal-sur-bruit (crête à crête bruit de fond <2 pA). La taille et la forme de la pointe de pipette généré détermine la probabilité d'un joint à membrane réussie contenant exactement un canal. Un embout plat assure que lorsque la pipette se rapproche de la cellule, il va toucher et appuyez sur la membrane de la cellule avec la surface de pointe en une seule fois, en aidant à sceller uniformément sur la cellule. Une pipette avec une pointe qui est trop large sera moins susceptible d'entraîner des correctifs à un seul canal; en revanche, sur le tirant d'une pipette avec une pointe qui est trop étroite se traduira par une boucle de membrane en forme d'oméga qui peut sceller à la base et obstruer la pipette ^10.

Un signal favorable par rapport au bruit peut être géré en réduisant les sources d'électricitébruit. La fonction de refroidissement de headstage sur le Axopatch 200B a permis la résolution optimale du signal; Cependant le bruit peut encore être produit par l'un des instruments impliqués dans l'électrophysiologie mis en place, ainsi que des sources externes telles que la lumière et de l'électronique indépendants. Heureusement, plusieurs stratégies peuvent être mises en œuvre pour réduire le bruit à un niveau souhaité ^{2, 27.} En bref, assurez-vous que les pièces d'équipement qui sont capables de produire du bruit sont fondées sur un seul point dans la configuration. En faisant cela, il est important d'éviter la formation de boucles de masse qui provoque un bruit important. En outre, si le bruit de cycle 60 est présent, assurez-vous d'éteindre toutes les lumières qui peuvent interférer avec le signal d'enregistrement. Enfin, placer une cage de Faraday autour de l'appareil d'enregistrement permet d'éviter les obstacles à proximité de causer du bruit électrique.

L'observation d'un canal pendant une longue période de temps a montré que gatingchangements conformationnels peuvent se produire sur une large gamme d'échelles de temps. Temporellement, les données de patch-clamp sont limitées à l'extrémité «court» par la bande passante de l'amplificateur et la vitesse à laquelle le signal amplifié est numérisé et à la fin «long» de la fenêtre d'observation. Pour les changements de conformation qui sont plus rapides que la limite basse, patch-clamp enregistrements ne peuvent offrir de l'information lorsqu'il est couplé avec des approches expérimentales complémentaires. Pour les changements de conformation qui se produisent à un rythme très lent, et par conséquent sont échantillonnés rarement, on peut augmenter le nombre d'observations ou d'augmenter la durée de l'enregistrement, toutefois, ceci peut ne pas toujours être possible.

Malgré ces limites, les données de patch-clamp, en particulier lorsque obtenus à partir d'un canal individuel, contiennent souvent plus d'informations que immédiatement extractible avec les méthodologies de calcul actuels. Ainsi, on s'attend à ce que les augmentations futures de capacité de calcul et de l'sophistication des algorithmes d'analyse fera d'autres applications possibles. Après l'avènement de ces progrès, il est prévisible que les enregistrements de patch-clamp de chaînes simples peuvent être en mesure de se produire en même temps que les mesures de FRET, imagerie calcique ou même dans les préparations in vivo pour fournir de plus amples informations sur la structure, la fonction et la dynamique des canaux ioniques dans les environnements natifs et contrôlées.

Comme la diversité des canaux ioniques enquête augmente, la compréhension détaillée de leurs mécanismes de déclenchement et finalement comprendre comment leur fonctionnement contribue à leurs fonctions biologiques uniques bénéficieront d'observations de molécules simples. En particulier, les données obtenues avec la promesse d'un canal de patch-clamp d'informer sur les propriétés de conductance unitaire et séquences de déclenchement pour les chaînes recombinantes et natives.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1