Summary
Metabole stoornissen behoren tot een van de meest voorkomende ziekten bij mensen. De genetisch handelbaar modelorganisme D. melanogaster kan worden gebruikt om nieuwe genen te identificeren die metabolisme regelen. Dit artikel beschrijft een relatief eenvoudige methode die het mogelijk maakt het bestuderen van de stofwisseling in vliegen door het meten van hun CO 2-productie.
Abstract
Metabole stoornissen zijn een frequent probleem dat de menselijke gezondheid. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die metabolisme regelen is een belangrijke wetenschappelijke opdracht. Vele ziekteveroorzakende genen bij de mens een vlieg homoloog, Drosophila waardoor een goed model om signalerende wegen betrokken bij de ontwikkeling van verschillende aandoeningen te bestuderen. Daarnaast is de traceerbaarheid van Drosophila vereenvoudigt genetische screens om te helpen bij het identificeren van nieuwe therapeutische targets die de stofwisseling kunnen reguleren. Om dergelijk scherm uitvoeren van een eenvoudige en snelle methode om veranderingen in de metabole toestand van vliegen identificeren noodzakelijk. In het algemeen, carbon dioxide is een goede indicator substraat oxidatie en energieverbruik met informatie over metabole toestand. In dit protocol introduceren we een eenvoudige methode om de CO 2-uitstoot van vliegen te meten. Deze techniek kan mogelijk helpen bij de identificatie van genetische storingen die stofwisseling.
Introduction
De biochemische cyclus Krebs genereert ATP door oxidatie van acetaat verkregen uit koolhydraten, vetten en eiwitten produceren CO2. In Drosophila, O 2-ingang is direct gecorreleerd met de CO 2-uitstoot en weerspiegelt het niveau van het metabolisme 1. Zo, de meting van de CO 2-uitstoot is met succes gebruikt in studies met betrekking tot veroudering en metabolisme 2-5. Hier ons laboratorium heeft gewijzigd ontwierp eerder experimentele opstellingen, waardoor de meting van de CO 2-productie in maximaal achttien monsters zonder dat een gespecialiseerde apparatuur. Anderen en we eerder hebben gebruikt deze methode om verschillen in de stofwisseling in vliegen die deficiënt zijn in de spierdystrofie geassocieerd eiwit, Dystroglycan (DG) 6-8 zijn te tonen.
O 2 voor oxidatief metabolisme wordt omgezet in CO2, die wordt uitgestoten als respiratoire afval. De bouwtie van handgemaakte respirometers beschreven waarmee voor de bepaling van het percentage O2 verbruikt. Vliegen worden in een afgesloten container met een stof die absorbeert uitgestoten CO 2, efficiënt elimineren uit de gasfase. De verandering in volume gas (verminderde druk) wordt gemeten door de verplaatsing van vloeistof in een glazen capillair bevestigd aan het gesloten respirometer.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de andere kosten. Eerdere studies hebben de CO 2-productie door Drosophila met gas analysers en technisch geavanceerde systemen respirometry 1,9 gemeten. Ondanks de meer complexe apparatuur, de gevoeligheid van de hier beschreven werkwijze is vergelijkbaar met gerapporteerde waarden (tabel 1). Daarnaast zijn verscheidene andere groepen variaties van deze techniek gebruikt om de relatieve stofwisseling in Drosophila 4-6 bepalen. Daarom kan deze test worden gebruikt reliab genererenle, reproduceerbare gegevens Drosophila metabolisme relevant zonder aankoop van speciale apparatuur die geïnstalleerd kan worden in elk laboratorium en kan worden gebruikt voor educatieve doeleinden.
In het algemeen aanvaarde het metabolisme van een organisme te bepalen is het meten van de CO 2, O 2 verbruikt, of beide 3,4,9. Hoewel, kan worden aangenomen dat een equivalent O 2 genereert een equivalent CO2, de precieze verhouding CO 2 gegenereerd is afhankelijk van de metabole substraat 10 gebruikt. Zo nauwkeurig bepalen van de stofwisseling in energie-eenheden moet meten zowel O2 verbruikt en CO2 geproduceerd. Hierdoor de hier beschreven werkwijze is bijzonder relevant vergelijken verschillen CO 2 productie tussen dieren en niet de absolute waarde. Onze techniek integreert meerdere dierlijke productie van CO 2 over een periode van time (1-2 uur) en derhalve geeft een gemiddelde activiteit van de dieren. Als er reden is om aan te nemen dat de proefdieren zijn minder actief dan de controle dieren de meting kan verschillende niveaus van activiteit en niet noodzakelijk overeen met de stofwisseling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van respirometers
- Snijd de 1000 ul pipet tip met een scheermesje om het inbrengen van de 50 pl capillaire micropipet toelaten, proberen om de pipet tip zo recht mogelijk te krijgen.
- Leg een stuk schuim in de pipet en duw hem in de pipet tip.
- Voeg een kleine hoeveelheid CO 2 absorberend en indammen door een tweede stuk schuim.
- Breng lijm op de plaats waar de micropipet in de pipet tip is geplaatst.
- Laat de respirometer s nachts zodat de lijm drogen.
Een schema van een respirometer is weergegeven in figuur 1A.
2. Voorbereiding van de meetkamer
- Bereid de kamer oplossing door het mengen van water met eosine in een verhouding die zal resulteren in zichtbare inkleuring.
- Giet het eosine / water-oplossing in de kamer.
- Label een van de zijwanden van de kamer met een centimeter schaal.
- Label de individuele respirometers met een marker.
- Verdoven vliegen een alternatieve methode tot CO2 en plaats 3-5 vliegen van het gewenste genotype in elke respirometer.
- Dicht de respirometers stevig aan de top met behulp van plasticine stopverf.
- Laat vliegen om te herstellen van verdoving voor ongeveer 15 minuten.
- Bereid een respirometer zonder vliegen, die zal worden gebruikt als de atmosferische controle.
4. Uitvoeren van het Experiment
- Hang het respirometers in de kamer door het aanbrengen van een 1,5 ml Eppendorf buisje houder die openen op de bovenkant en de bodem op de bovenzijde van de kamer is.
- Plaats respirometers met de micropipet tip naar beneden in de kamer waardoor de tip om onderdompelen in de gekleurde oplossing.
- Voeg Vaseline tussen de deksel deksel en de kamer om sterker isolatie voorzien van temperatuur en druk fluctaties.
- Sluit het deksel en laat het systeem in evenwicht gedurende 15 minuten.
- Neem een foto van de kamer om ervoor te zorgen dat het niveau van de vloeistof in elk micropipet zichtbaar is en dus is de schaal (zie voorbeeld in figuur 1B).
- Na 1-2 uur, neem een ander beeld.
- Als experiment is voltooid, verwijdert de vliegen uit respirometers en wegen indien gewenst of breng ze terug naar de flacon of verdere nodig.
5. Analyse van de resultaten
- Open verkregen beelden met behulp van ImageJ software 11.
- Met behulp van de schaal voor elke afbeelding, stel de pixel scaling in de software.
- Meet de afstand (waarde van te meten) dat de vloeistof reisde van een bepaalde verwijzing plek in beelden die aan het begin (d1) en het einde van het experiment (d2). Een schematisch voorbeeld wordt getoond in figuur 1C.
- Bereken de hoeveelheid geproduceerde CO2 (pl / uur / fly) met de formule:
R = straal van micropipet buis in centimeters
Waarde van te meten = afstand van de vloeistof is opgeschoven in de micropipet van de monsters gemeten in centimeters
Δc = afstand van de vloeistof is opgeschoven in de micropipet van de negatieve controle monster (zonder vliegen)
n = aantal vliegen gebruikt
h = uur
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om aan te tonen dat de methode is gevoelig we gemeten CO 2-productie van wild-type (Oregon R) mannelijke vliegt op 18, 25 en 29 ° C en vliegt mutant voor Dg. Vliegen zijn gerezen bij 25 ° C en vervolgens verschoven naar de experimentele temperatuur gedurende 5 dagen voorafgaand aan de meting. Zoals verwacht voor deze ectothermic soort, de hoeveelheid CO 2 verhoogd met de temperatuur (fig. 2). We hebben in het verleden aangetoond dat een suikervrij dieet vermindert de stofwisseling van zowel wild-type en mutant Dg vliegt 7. Het verlies van Dg leidt tot verhoogde metabolische niveaus (Figuur 2).
Figuur 1. Setup voor het meten van de CO 2-productie in vliegen A. Schematische tonen t.Hij bouw van de individuele respirometer. B. Foto van de kamer tijdens de meting van CO 2. Brieven markeer de positie van respirometers. Verticale nummers geven schaal in centimeters. C. Schematische toont de mutaties gedurende het experiment. Groene lijn geeft referentievlek (d1), blauw geeft het definitieve standpunt van de vloeistof na 2 uur (d2). Waarde van te meten is de afstand die de vloeistof heeft afgelegd in de micropipet.
Figuur 2. CO 2-productie in vliegen bij verschillende temperaturen en bij DG mutanten. Temperatuur behuizing positief correleert met de CO 2-productie in Drosophila en is aanzienlijk toegenomen in Dg mutanten. Fout balken geven SEM uit vier afzonderlijke experimenten, *** p ≤ 0.01.
| (Pl / fly x uur) | Apparatuur die wordt gebruikt | Verwijzing |
| 2-3 CO 2 | CO 2-gas analyzer | (Van Voorhies, Khazaeli et al.. 2004) |
| 4.68 ± 1.04 CO 2 | CO 2 respirometry systeem | (Khazaeli, Van Voorhies et al.. 2005) |
| 2,9-6,2 O 2 | Evenzo ontworpen respirometers | (Hulbert, Clancy et al.. 2004) |
| 2,20 ± 0,15 O 2 | Hier beschreven handgemaakte respirometers | (Kucherenko, Marrone et al.. 2011) |
| * Tabelwaarden zijn uit studies die numerieke waarden van vliegen gemeten bij 25 ° C te melden |
Tabel 1. Vergelijkingvan de verschillende technieken die gebruikt worden om de CO 2-productie door Drosophila meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een goedkope en betrouwbare methode voor het meten van CO 2 in vliegen. We vonden dat dit experiment is eenvoudig, snel uit te voeren en genereert reproduceerbare gegevens die in overeenstemming is met andere studies 1, 6, 9. Het protocol hier beschreven kan eenvoudig worden aangepast aan elk laboratorium het budget en de beschikbare materialen passen. De constructie van elk respirometer kan zolang de ruimte blijft luchtdicht aangepast. Echter, de langere, dunnere micropipetten bieden meer precisie dan kortere. Het gebruik van de buitenkamer kan facultatief zolang er geen significante omgevingstemperatuur en drukveranderingen het experiment compromitteren. Dit kan worden bepaald door analyse van de negatieve controle en een grote variabiliteit in biologische monster metingen. Bovendien kan het CO 2 absorberende van elke variëteit zolang het niet toxisch is voor de fleugens (bijv. kaliumhydroxide). Het is van groot belang voor een negatieve controle om te garanderen dat de techniek goed werkt hebben. De meest voorkomende probleem is voor de respirometer niet volledig afgesloten. Als dit het geval is, dan zal de meting vergelijkbaar met die van de negatieve controle. Extra problemen kunnen ontstaan als gevolg van vliegen die geen tijd hebben om te herstellen van verdoving heeft gehad of zijn omgekomen.
De meest cruciale stap in dit protocol is de bouw van de respirometer. Zoals hierboven opgemerkt, moet de respirometer luchtdicht. De bevestiging van de micropipet om de grotere pipet kamer moet met de juiste lijm. Een rubber-achtige lijm is het beste werkte. Het wordt aanbevolen om de respirometers inspecteren onder een microscoop om compromissen in de gelijmde structuur waarnemen na afloop. Bovendien is de afdichting van de respirometer na vliegen zijn binnen geplaatst is heel belangrijk. Het gebruik van stopverf hals gevonden om het beste werken en niet zelden. Paraffine is gevonden zeer slecht werken en moeten worden vermeden. De vloeistof die wordt gebruikt om het volume gas te meten is ook erg belangrijk en manometrische moet zijn. Water is dus de beste keuze. Het gebruik van de patronen wordt niet aangeraden omdat het kan verharden in de capillaire het maken van de respirometer nutteloos. Het is ook van cruciaal belang om geen gebruik te reproduceren vrouwtjes, omdat we merkten dat hun CO 2-productie zeer variabel kan zijn. Bovendien leeftijd vliegen is daarom belangrijk de vliegen die vergeleken moeten van dezelfde leeftijd. In onze test gebruikten we 5 dagen oud mannetjes. De genetische achtergrond van de vliegen is ook belangrijk. De besturing voert zou dezelfde genetische achtergrond in vergelijking met mutanten. De gegevens kunnen ook als (ul / uur / mg) van de massa van de vliegen na het uitvoeren van de test indien er significante verschillen in grootte van vliegen worden gepresenteerd. In onze handen, weegt een wild-type fly 0.80 ± 0.11 mg (n = 180). Voorts zij opgemerkt dat in timing van het experiment de waarden van de gemiddelde stofwisseling worden verkregen. We hebben ook gevonden dat het mogelijk is een individuele vliegen meten, maar bereikt de hoogste precisie met 3-5 vliegen. De beschikbare ruimte in respirometer voor vliegen is genoeg dat ze niet het gevoel overvol, maar op hetzelfde moment dat ze niet de ruimte hebben om intensief te lopen: dus gebrekkig geotaxis heeft geen effect op het niveau van de CO 2-productie niet hebben.
Vliegen al lang gevestigd als een van de belangrijkste modelorganismen menselijke ziekten die gerelateerd zijn aan ontwikkelingsbiologie, celbiologie en neurobiologie bestuderen. Een aantal recente studies hebben aangetoond dat vliegen gemakkelijk kan worden gebruikt om energie homeostase bestuderen en (beoordeeld in 12, 13). De hier gepresenteerde methode kan gemakkelijk worden gebruikt in genetische screens om nieuwe moleculaire componenten mogelijk betrokken bij de controle van de mij identificerenmetabole toestand voorafgaand aan de aankoop nauwkeuriger en dure apparatuur. Tot zover de meerderheid van dergelijke schermen werden alleen gedaan in celkweek te geven dat meer geavanceerde studies zijn gerechtvaardigd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen Max-Planck Society bedanken voor de financiering van ons onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
