Summary
Pruebas de aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación Streptococcus pneumoniae, y también ha sido ampliamente aplicada en microbiología de diagnóstico. Este manuscrito describe la producción interna de los reactivos de aglutinación de látex, procedimientos de control de calidad y la aplicación de esta técnica para la serotipificación neumocócica.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los niños menores de cinco años de edad, sobre todo en entornos de escasos recursos en todo el mundo 1,2. Rangos de enfermedad neumocócica de infecciones localizadas a condiciones que amenazan la vida tales como la neumonía, sepsis y meningitis 1,2.
Más de 90 serotipos de neumococo se han identificado sobre la base de las diferencias en su polisacárido capsular 3. Las vacunas actuales se dirigen al polisacárido capsular y proporcionan protección contra los principales serotipos causantes de enfermedad invasiva 4. Serotipificación neumocócica aislamientos es importante para evaluar el impacto de la vacunación en el carro y la enfermedad, así como proporcionar información epidemiológica más amplia de 5,6. El método actual "estándar de oro" para la serotipificación neumocócica es la prueba Quellung, pero es mucho tiempo y requiere cierta habilidad para perform 7. Aglutinación de látex es un método serotipificación alternativa recomendada por la Organización Mundial de la Salud 7. Aglutinación de látex es rápido y fácil de realizar, y se emplea en muchos laboratorios en todo el mundo 8-11. Es importante destacar que, de aglutinación de látex ha demostrado una precisión comparable a la prueba Quellung para serotipificación neumocócica 10,12-14. En general, este método es ideal para entornos de escasos recursos, así como laboratorios de alto rendimiento.
Reactivos de aglutinación del látex ('reactivos de látex') son creados por la unión de anticuerpos a partículas de látex 15. En una reacción positiva, estas partículas marcadas se aglutinan en presencia de antígeno específico. Reactivos de látex comerciales están disponibles para un rango limitado de serotipos. Reactivos de látex también se pueden preparar en casa utilizando comercialmente disponibles antisueros 10. Las mezclas de antisueros ('piscinas'), así como antisueros específicos para s neumocócicaserogroups (por ejemplo, grupo 19), los serotipos individuales (por ejemplo, el serotipo 5), y a los antígenos específicos ("factores", por ejemplo., factor de reconocimiento de serotipo 19A 19C) para definir aún más serotipos dentro de los grupos están disponibles 16.
Este manuscrito describe los pasos principales en la producción de reactivos de látex utilizando fijación pasiva de antisueros disponibles comercialmente a las partículas de látex. Se describen los controles de calidad (QC) aspectos de este método, y un protocolo para el uso de reactivos de látex para la serotipificación neumocócica está incluido.
Protocol
1 Preparación de internos Reactivos de látex
- Preparación de glicina salina tamponada (GBS)
- Añadir 1,5 g de glicina, 11,7 g de cloruro de sodio y 100 ml de agua destilada a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml.
- Mezclar para disolver utilizando un agitador magnético.
- Transferir la mezcla a 500 ml cilindro de medición y añadir agua destilada para hacer un total de 200 ml.
- Transferir la solución de nuevo a la taza de 200 ml, comprobar el pH y ajustar a 8,2 con hidróxido de sodio 5 M. NOTA: El hidróxido de sodio es corrosivo, usar equipo de protección personal.
- Filtro de esterilizar la solución con 0,22 M filtros y varias jeringas 60 ml en una botella de vidrio ml preautoclaved tornillo de tope 250.
- Guarde a temperatura ambiente.
- Preparación de GBS con 0,2% de albúmina de suero bovino
- Añadir 0,2 g de albúmina de suero bovino (BSA) en polvo y 100 ml de GBS a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml y mezclar para disolver utilizando un agitador magnético.
- Filtroesterilizar la solución a través de filtros de 0,22 M utilizando varias jeringas de 60 ml en un ml preautoclaved tornillo de botella de vidrio cubiertas 250.
- Almacenar a 4 ° C.
- La preparación de reactivo de látex
- Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior.
NOTA: redondo tubos de fondo se utilizan para minimizar la sedimentación de partículas que pueden afectar el apego anticuerpo. - Con una pipeta P1000 con puntas estériles añaden 975 l de EGB en el tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir 25 l de antisuero neumocócica apropiado para el reactivo de látex está preparando (es decir, la piscina, grupo, tipo o factor). Invierta cinco veces para mezclar.
- Diluir partículas de látex de poliestireno 1:10 añadiendo 120 l de partículas de látex para 1.080 l de solución salina fisiológica estéril.
NOTA: Este puede hacerse en volúmenes más grandes, pero debe hacerse de nuevo cada vez que se producen los reactivos de látex. - Añadir 1,000 l de la suspensión de látex 1:10 (preparado en el paso 1.3.3) a los 1,000 l de suspensión 1:40 antisuero (preparado en la etapa 1.3.2). Invierta cinco veces para mezclar.
- Incubar a 37 ° C en una rueda que gira lentamente (por ejemplo, 4 rpm para una rueda de 38,5 cm de diámetro) durante 2 horas.
- Centrifugar durante 15 min a 1100 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento en 2 ml de solución salina estéril.
- Centrifugar durante 15 min a 1100 x g. Descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de GBS y resuspender suavemente el pellet.
- Pipetear la suspensión de látex en una etiqueta rosca de 5 ml tubo tapado. Agregar otro 1 ml de GBS.
- Añadir 2 ml de GBS que contiene 0,2% de BSA (w / v) (pH 8,2) (preparado en el paso 1.2). Añadir 40 l de 10% (w / v) de azida sódica como conservante.
NOTA: La azida sódica es peligroso en caso de inhalación, y es un irritante de la piel y los ojos. Es deseable comprar una solución preparada al 10% en lugar de la forma en polvo, ya que esto minimiza el riesgo de exposición por inhalación. Equipo de protección personal (guantes incluidos ungafas d salpicaduras) se deben utilizar para la manipulación de este reactivo. Consulte la hoja de datos de seguridad para obtener más información. - Reactivos de látex Almacenar a 4 ° C.
- Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior.
- Preparación de reactivo de látex control negativo
- Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior.
NOTA: redondo tubos de fondo se utilizan para minimizar la sedimentación de partículas que pueden afectar el apego anticuerpo. - Con una pipeta P1000 con puntas estériles añaden 975 l de EGB en el tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir 25 l de antisuero de conejo normal. Invierta cinco veces para mezclar.
- Proceda como en los pasos 1.3.3 al 1.3.10 arriba
- Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior.
2. Control de Calidad (QC) de látex Reactivos
- Llevar reactivo de látex a RT. Inmediatamente antes de su uso, mezclar suavemente el reactivo de látex invirtiendo el tubo varias veces.
- Compruebe reactivo para autoaglutinación pipeteando 15 l sobre un portaobjetos de vidrio y proceder como en los pasos 4.7 y 4.8 a continuación. No debe haber ungglutination de las partículas de látex. El reactivo debe aparecer en blanco y liso.
- Pruebe el reactivo frente a un panel de pocos pases aislamientos de neumococo. Utilice las culturas recién crecido preparados como en el paso 3 El panel de cepas debería incluir aislamientos del serotipo 'target' (el serotipo específico para el reactivo está probando) y serotipos 'no objetivo' (cepas de otros serotipos que normalmente no debe cruzar reaccionar con el reactivo). Incluya al menos una cepa de cada objetivo y no objetivo serotipo para cada reactivo de látex someterse QC. Si sólo hay un objetivo o serotipo no objetivo, probar dos cepas diferentes del serotipo particular.
NOTA: El panel de prueba debe incluir varios aislamientos de cada serotipo, algunos de los cuales son comunes en la enfermedad invasiva y / o colecciones de cultivos tipo. Es preferible incluir algún carro aislados, ya que a menudo son más exigentes al serotipo (datos no presentados), con lo que la prueba aún más la capacidad of los reactivos y asegurar que los reactivos son probablemente capaces de serotipificación tanto invasiva y el carro aislados. - Proceder con la prueba de reactivos de látex con neumocócica objetivo y no objetivo aislamientos según el método descrito en los pasos 3 y 4 a continuación.
- Reactivos de control de calidad en el momento de la producción y al menos anualmente a partir de entonces.
NOTA: Si un reactivo no pasa QC, el lote debe ser desechado y una nueva preparación hecha. En el caso de fallo de repetición QC recomendamos los reactivos pueden producir usando los métodos alternativos descritos en Ortika et al., 2013 8 y en la discusión a continuación.
3 Preparación de las Culturas antineumocócicas para Serotipificación
- Utilizando un asa estéril seleccionar una sola colonia de la antineumocócica aislar y consecutivas esto en un sólido de agar sangre no selectivo de modo que el inóculo primario cubre aproximadamente un tercio de la superficie de la placa. Racha de colonias individuales.
NOTA: Las placas preparadas a partir de caballo desfibrinada o sangre de oveja son adecuados; pero las placas de sangre preparadas con sangre humana o sangre de animal tratado con citrato no lo son. - Incubar la placa O / N a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2.
- Observar el crecimiento en la placa por la pureza y evaluar que hay un crecimiento suficiente para serotipificación.
NOTA: Un cultivo puro de la cepa neumocócica es necesaria para la serotipificación. En nuestra experiencia, confluente, o cerca de la confluencia de crecimiento que cubre aproximadamente un tercio de la superficie de la placa es generalmente suficiente para completar la serotipificación. Como las culturas neumocócicas pueden ser propensos a la autolisis, cultivos preparados para serotipificación deben probarse dentro de las 24 horas de la subcultura. No tome la placa de cultivo de la incubadora más de 15 a 20 min antes de que comience el serotipado.
4. Realización Serotipificación látex aglutinación
- Retire todos los reactivos de látex de la nevera y deje que alcancen la temperatura ambiente durante aproxmadamente 30 min. Inmediatamente antes de su uso, invertir suavemente los tubos para mezclar los reactivos.
- Etiquetar un portaobjetos de microscopio.
- Coloque 15 l de reactivo de látex de control negativo en el portaobjetos de un microscopio.
- El uso de un bucle de 1 l desechable estéril tomar un barrido de la cultura neumocócica manera que el bucle es de aproximadamente la mitad.
- Manchar suavemente el inóculo sobre la superficie de la corredera cerca de la gota de reactivo de látex control negativo. El inóculo debe ser visible en el portaobjetos de vidrio.
- Rápidamente ya fondo mezclar el inóculo en el reactivo de látex control negativo utilizando el bucle. Asegúrese de que la caída no se propaga más allá de su tamaño inicial.
- Recoge la diapositiva, sujetándola por ambos extremos. Rock the slide de ida y vuelta durante 1 min. Tenga cuidado para que el líquido se mueve lentamente, y asegurarse de que el tamaño de la gota no aumenta.
NOTA: Como alternativa, utilice un rockero plato. - Observar la aglutinación macroscópica (es decir, pora simple vista) y la limpieza de la suspensión contra un fondo negro.
- Si el reactivo de látex de control negativo no muestra aglutinación o compensación continuar probando la cultura, en sustitución de los reactivos de látex de prueba para el reactivo de látex de control negativo en los pasos 4.1 a 4.8 anteriormente. Un bucle fresco debe ser utilizado cada vez. Proceda con la prueba de los reactivos de látex que comienzan con las piscinas.
- Pon a prueba cada uno de los reactivos de látex 'pool' en la serie hasta que se obtenga un resultado positivo.
NOTA:. El orden de las pruebas de las piscinas se pueden hacer en "rounds" para reflejar la incidencia local de serotipos particulares (por ejemplo, mediante pruebas de las tres piscinas más probables en la primera diapositiva Si no se obtiene una reacción positiva, entonces prueba los próximos tres más probable de las piscinas restantes de la segunda corredera, y así sucesivamente hasta que se obtiene una reacción positiva). Esto asegura que los serotipos más comunes se prueban primero, minimizando el tiempo y reactivos necesarios. - Uso de la tecla del fabricante antisueros determinar qué antisueros individuales están representados en el grupo positivo.
- Pon a prueba cada uno de los grupos o tipos que figuran en la piscina positivo individual para determinar el 'grupo' o 'tipo' como en los pasos 4.1 a 4.8 anteriormente.
- Determinar el resultado por referencia a la tecla del fabricante antisueros. Si se determina que un "tipo" (por ejemplo, el serotipo 5), entonces no se necesita más pruebas y este resultado se registra.
- Si se determina que un "grupo" (por ejemplo, grupo 19), a continuación, hacer referencia a la clave de los fabricantes para determinar los factores que deben ser evaluados. Continuar las pruebas con los reactivos de látex individuales 'Factor' y determinar el serotipo final (por ejemplo, el serotipo 19B).
Representative Results
Una reacción positiva de látex se produce cuando el anticuerpo específico del tipo unido a la partícula de látex se une a la cápsula del neumococo, y la aglutinación de las partículas de anticuerpo marcado se produce 15. Figura 1A muestra una reacción positiva que se caracteriza por aglutinación visible y la limpieza de los antecedentes suspensión. Una reacción negativa se caracteriza por la suspensión de reactivo de aglutinación de látex blanco restante suave y (Figura 1B). Los reactivos se optimizan de manera que una reacción positiva se debe observar antes de que el final del intervalo de tiempo de un minuto (normalmente detectable en aproximadamente 20 segundos). No se recomienda la lectura de las reacciones después del intervalo de tiempo de 1 min. Muy ocasionalmente, reacciones muestran aglutinación débil alrededor del borde de la gota que no vaya acompañado de la limpieza de la suspensión de fondo, o aparece 'viscosa' sin compensación fondo (datos no mostrados). Estos son como más reacciones negativas ly. En tales casos, se recomienda volver a probar y / o una mayor investigación utilizando otro método serotipificación (por ejemplo, la reacción de Quellung 17).
Figura 1. reacciones de aglutinación de látex positivos y negativos. Preparaciones del neumocócica aislamiento natural mezclaron con el reactivo de aglutinación de látex que muestra una reacción positiva (A) o una reacción negativa (B). Aglutinación acompañado por compensación de los antecedentes se ve en la reacción positiva (A) es .There aglutinación no visible con el reactivo de control negativo o de látex en una reacción negativo de la prueba (B). Fotografías 8 usan con permiso."Target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación neumocócica. Neumocócicas reactivos de aglutinación de látex comerciales están disponibles, pero en la actualidad no diferencian todo neumocócica conocida serotipos 10,12. Sin embargo, los reactivos de aglutinación de látex pueden ser fácilmente producidos en la empresa utilizando antisueros comprado levantado contra los antígenos capsulares de neumococos específicos. En el método descrito aquí, los anticuerpos se unen a pasivamente partículas de látex para hacer un conjunto de reactivos de aglutinación de látex.
Una reacción positiva de látex se produce cuando los anticuerpos específicos unidos a las partículas de látex se unen a antígenos en la cápsula de polisacáridos del neumococo aislar 18,19. Las partículas de látex unidos a los anticuerpos permiten la reacción específica antígeno-anticuerpo para ser visualizado sin aumento.
Aglutinación de látex es un método adecuado para laboratorios de alto rendimiento de unD también para entornos de escasos recursos. Principales ventajas del método de aglutinación de látex son que no se requiere equipo especializado para realizar la prueba, los reactivos tienen una vida útil de al menos 2 años cuando se almacena a 4 ° C 8, y que es barato, sencillo y rápido de realizar. Serotipificación un aislado neumocócica por aglutinación de látex tarda aproximadamente 10 min, y hasta cuatro reactivos de látex se puede probar en paralelo por una diapositiva. Además, si la prevalencia de los serotipos es conocido por el ajuste epidemiológica pertinente, las pruebas pueden llevarse a cabo en rondas empezando con las piscinas que contienen los serotipos más comunes de manera similar a la prueba de Quellung 17. Este enfoque minimiza el número de ensayos necesarios para determinar el serotipo. El método también es altamente reproducible entre diferentes operadores (datos no presentados). Una desventaja de la serotipificación de aglutinación del látex es que la producción de los reactivos es mucho tiempo, teniendo aproximadamente 4 horas; aunque múltiples ReageNTS puede ser fácilmente producido en paralelo. Además, algunos antígenos son comunes a través de diferentes serotipos de neumococo, resultando en reacciones cruzadas con algunos antisueros (por ejemplo, el serotipo 29, 42 y el Grupo 35). Sin embargo, estas reacciones cruzadas están bien caracterizados utilizando antisueros comerciales (que generalmente se preabsorbió para eliminar los anticuerpos de reacción cruzada más problemáticas) y tablas de reacción adicionales se proporcionan por el fabricante con el fin de distinguir qué serotipo está presente. Reactivos de látex también pueden cruzar reaccionar si los anticuerpos no están alineados correctamente en las partículas de látex; éstos son detectados como fallas de control de calidad. En nuestra experiencia, riguroso control de calidad es fundamental para el éxito de este método, incluso cuando se utilizan antisueros disponibles comercialmente para la producción. QC tarda aproximadamente 15 min por reactivo y se basa en un conjunto de control de calidad apropiado aislados como se describe anteriormente.
El método aquí descrito da lugar a reactivos que dan una reacción positiva así widelgada el periodo de prueba. En nuestra experiencia, los falsos positivos son raros en la práctica (datos no mostrados). Se observan reacciones negativas falsas ocasionales; por lo general se relacionan con problemas conocidos con un antisuero en particular (por ejemplo, el serogrupo 6 aislados no pueden reaccionar con piscina B antisuero), o regulación a la baja de la expresión de la cápsula por el aislado. Usando el algrorithm serotipificación proporcionado por el fabricante es también importante, ya que en la mayoría de los casos una reacción positiva o negativa falsa dará lugar a un resultado "extremo ciego '. En estos casos, y cuando las reacciones son difíciles de interpretar, se recomienda repetir la prueba-y / o ensayo por un método alternativo tal como la reacción de Quellung.
Algunos de solución de problemas en ocasiones se requiere para hacer los reactivos de látex satisfactorios. En el método descrito aquí, el anticuerpo se une a partículas de látex a través de adsorción pasiva 15,19, por lo que una variable crítica es la concentración de anticuerpo utilizado, que determina qué tan bienla superficie de las partículas de látex se cubre y la posterior alineación de los sitios activos de anticuerpos 15,20. En consecuencia, si el exceso de anticuerpo insuficiente o está unido a las partículas de látex, las reacciones antígeno-anticuerpo no será óptima, y los reactivos pueden ser insatisfactorios producido 15,20,21. Como los títulos de anticuerpos varían entre los diferentes lotes de antisueros, un conjunto estándar de diluciones puede no producir los reactivos que se desempeñan bien 8. Un punto de partida útil es el uso de una dilución 1:40 de antisuero, y si esto no tiene éxito, diluir el antisuero más. En nuestra experiencia, esto generalmente se resuelve el problema 8. En un pequeño número de casos reactivos pueden mostrar aglutinación débil que no vaya acompañado de la limpieza de la suspensión cuando se prueba con destino aísla. En estos casos diluir el antisuero no mejora la calidad del reactivo, pero los reactivos satisfactorios por lo general pueden ser producidos por la omisión de la centrifugación y etapas de lavado 8,22
Partículas de látex recubiertas de anticuerpo se utilizan comúnmente en microbiología de diagnóstico para la detección, identificación o el serotipado de muchos microbios diferentes 15,20. Como tal, el método descrito aquí puede ser adecuado para la preparación de reactivos de látex para otros fines, siempre antisueros adecuado está disponible y los procedimientos de control de calidad adecuados son adoptados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
| Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to RT before use |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to RT before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to rRT before use |
| Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
| Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
| Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
| 5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
| Glycine | Merck | 10119.05 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to RT before use http://www.thermofisher.com.au |
| Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | ||
| Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
| 60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
| Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| *alternative sources are available for most materials |
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