Abstract
العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ لديهم موت الخلايا العصبية المعنية في الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بهم. تحسن في نماذج المختبر لدراسة آثار اعصاب أو عصبية المخدرات ومسارات المصب المعنية من شأنه أن يساعد التبصر في الآليات الجزيئية من العصبية / السمية العصبية ويحتمل تسهيل تطوير الأدوية. ومع ذلك، العديد من المقايسات الموجودة في المختبر سمية لها القيود الرئيسية - الأكثر تقييم السمية العصبية والعصبية عند نقطة زمنية واحدة، وعدم السماح لمراقبة بالطبع الوقت وحركية التأثير. وعلاوة على ذلك، فإن الفرصة لجمع المعلومات عن مسارات الإشارات المشاركة في المصب العصبية في الوقت الحقيقي وتكون ذات أهمية كبيرة. في البروتوكول الحالي وصفنا استخدام الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل لتحديد آثار اعصاب السيروتونين 2A (5-HT 2A) منبهات مستقبلات في خط الخلية العصبية تحت خالية من التسمية والوقت الحقيقي كونديتالأيونات باستخدام قياسات مقاومة. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن على مثبطات مسارات الرسول الثانية يمكن أن تستخدم لتحديد جزيئات المصب المشاركة في تأثير اعصاب. وصفنا أيضا فائدة هذه التقنية لتحديد ما إذا كان لها تأثير على تكاثر الخلايا يساهم في التأثير الملحوظ اعصاب. النظام يستخدم لوحات الإلكترونيات الدقيقة الخاصة المشار إليها باسم E-التي تحتوي على لوحات بالتناوب صفائف مسرى مكروي الذهب على السطح السفلي من الآبار، بمثابة أجهزة استشعار الخلية. يتم تعديل قراءات مقاومة من قبل عدد من الخلايا الملتصقة، بقاء الخلية، مورفولوجيا، والتصاق. مشتق معلمة أبعاد يسمى مؤشر الخلية من قياسات المعاوقة الكهربائية ويستخدم لتمثيل الوضع الخلية. عموما، في الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل يسمح في الوقت الحقيقي، وتقييم خالية من التسمية من العصبية والعصبية، وتقييم الثاني تورط مسارات رسول، والمساهمة في المزيدتقييم مفصل والإنتاجية العالية من المركبات اعصاب المحتملة في المختبر، لاختيار المرشحين العلاجي.
Introduction
موت الخلايا العصبية يلعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية من العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ 1. توافر موثوقة وعالية الإنتاجية في فحوصات المختبر سمية أمر بالغ الأهمية للحصول على فهم أفضل للآليات العصبية وللمساعدة في اختيار جزيئات اعصاب كمرشحين العلاجية في تطوير العقاقير 2. ومع ذلك، هناك العديد من القيود على استخدامها على نطاق واسع في المختبر العصبية assays.They تقييم السمية العصبية / العصبية في وقت واحد نقطة عدم السماح للقرار الحركي. غالبا ما تستخدم التسمية أو التحقيق التي يمكن أن تتداخل مع مسارات الإشارات والحد دراسات إضافية في نفس سكان الخلية، وغالبا ما تكون كثيفة العمالة، وفي كثير من الحالات لا توفر البصيرة الميكانيكية. في هذه الدراسة نحن لشرح فائدة في الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل لتحديد السمية العصبية والعصبية في خط الخلية العصبية في الوقت الحقيقي وتحت خالية من التسميةالظروف وتوفير نظرة ثاقبة آليات المصب من خلال تحليل مسارات الرسول الثانية المشاركة في التنفيذ.
وقد أكدت الدراسات السابقة على صحة محلل خلية في الوقت الحقيقي لتحديد السمية الخلوية وكذلك التأثيرات على تكاثر الخلايا في خطوط الخلايا بالمقارنة مع التقنيات القياسية 3،4،5،6. على سبيل المثال، لوحظ وجود علاقة جيدة بين قراءات من معيار بقاء الخلية WST-1 فحص خلية والقيم مؤشر في عدة نقاط الوقت في ظل ظروف انتشار القاعدية وبعد سنتين نماذج مختلفة السامة في خلايا هيلا 3. في A549 وMDA-MB-231 تكاثر الخلايا وسمية الخلايا أثار مع باكليتاكسيل أنيبيب استقرار أظهرت قيم متشابهة جدا عندما تقدره قياسات مؤشر الخليوي وsulforhodamine تستخدم standardly ب (SRB) فحص 4. في خط الخلية العصبية من الخلايا العصبية قرن آمون خلد تم التحقق من صحة القياسات مؤشر HT-22 الخليوي لقدرتها رس كشف تكاثر الخلايا، الغلوتامات وسمية الخلايا cytoprotection ضد تستخدم على نطاق واسع 3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) 2،5-diphenyltetrazolium الميثيل (MTT) فحص 5. في نفس الدراسة ترتبط نتائج فحص MTT وقياسات مؤشر الخلية بشكل جيد أيضا في قياس انتشار الخلايا الاولية العصبية، السمسة بعد الحرمان عوامل النمو والانقاذ من السمية الخلوية من قبل عموم كاسباس المانع QVD 5. أظهرت سمية الخلايا المستحثة في خلايا NIH 3T3 بواسطة Vandetanib (نمو بطانة الأوعية الدموية ومستقبلات عامل نمو البشرة مستقبلات عامل مثبط) نتائج مماثلة قياس مع قيم مؤشر الخلية أو محايدة امتصاص أحمر فحص 6.
وقد استخدمنا في الآونة الأخيرة في الوقت الحقيقي نظام محلل خلية لتقييم آثار اعصاب من 2A السيروتونين (5-HT 2A) مستقبلات ناهض هيدروكلوريد (±) -2،5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (دوى) في خط الخلية العصبية ( خلايا SK-N-SH) وفرزهم لمشاركة SECOالثانية مسارات رسول من خلال رصد تأثير تثبيط الكيميائي على العصبية وحظ 7. ومن المثير للاهتمام، و5-HT 2A مستقبلات لديه منبهات كل من الهلوسة وnonhallucinogenic (مثل دوى ويسوريد، على التوالي)، والتي قد بتنشيط كل مشتركة ومتميزة مسارات الرسول الثانية 8.
مزايا هذه التقنية المقدمة هي أنه يتيح لجمع المعلومات في الوقت الحقيقي على بقاء الخلية خلال أيام، لتحديد مسارات ثاني رسول المعنية، لتقييم مساهمة ممكنة من آثار انتشار إلى العصبية، وتحديد الوقت الأمثل لإجراء دراسات إضافية نقطة النهاية على نفس السكان الخلية. ويرد الرسم التخطيطي لسير العمل في البروتوكول الحالي في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد
- وضع محطة محلل خلية في الوقت الحقيقي في حاضنة زراعة الأنسجة وضعت في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تنفيذ جميع التعامل زراعة الخلايا والعلاجات الدوائية في نسيج الثقافة هود في ظل ظروف معقمة.
- ملاحظة: خطوط الخلايا العصبية التي تتطلب إعدادات درجة حرارة مختلفة مقارنة الظروف القياسية للثقافة، ينبغي تبعا لذلك. للخطوط الخلايا الملتصقة ضعيفة، واستخدام وكلاء طلاء لتسهيل التفاعل مع الخلايا الميكروية الذهب في قاع الآبار لللوحة E 96.
- إعداد الحلول 1،000X الأسهم من المركبات الدوائية لعلاج زراعة الخلايا (وكلاء اعصاب الثانية أو مثبطات مسارات الرسول في المذيب المناسب - ديمثيلكبريتيد أو الماء المعقم) وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدام المذيبات والمركبات في العلاجات التالية.
- الخلايا العصبية البشرية الثقافة SK-N-SH في DMEM / F12 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (انتشار المتوسطة) في قوارير زراعة الخلايا مع 175 سم 2 كثافة السطح لحوالي 75٪. الاحتفاظ برقم مرور خلية ضمن نطاق (حوالي 10 مقاطع) للتأكد من اتساق بين التجارب من حيث معدل تكاثر الخلايا وردا على سمية الخلايا. ويفضل أرقام مرور أقل.
- غسل طبقة ملتصقة الخلايا SK-N-SH مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين مع 0.05٪ محلول التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 مئوية. الطرد المركزي الخلايا في 170 × ز لمدة 5 دقائق لإزالة التربسين. resuspend الخلايا في 10 مل انتشار المتوسطة. عد الخلايا مع الصولجان مكافحة الخلية وضبط عدد الخلايا إلى 300،000 خلية / مل عن طريق تمييع الخلايا مع انتشار المتوسطة.
2. طلي وانتشار الخلايا SK-N-SH
- إضافة 100 ميكرولتر انتشار المتوسطة إلى كل بئر لللوحة E 96 وتترك لمدة 30 دقيقة في نسيج الثقافة هود في RT لكي تتوازن. إدراج جيش التحرير الشعبى الصينى Eالشركة المصرية للاتصالات 96 في الوقت الحقيقي محطة محلل خلية في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية.
- بدء تشغيل في الوقت الحقيقي البرمجيات محلل الخلية. على الصفحة تحديد تخطيط الآبار المدرجة في التجربة والدخول في مربعات التحرير المعلومات حول نوع من الخلايا، عدد الخلايا والأسماء وتركيزات المركبات الكيميائية المستخدمة في العلاج بالخلايا.
ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول ينصح لا يقل عن 4 مكررات لكل معاملة. - على الصفحة تحديد جدول برنامج "خطوات" المدرجة في التجربة، من خلال تحديد عدد من الاحتلالات قياس مؤشر الخليوي والفترة الفاصلة بين الاحتلالات لكل خطوة. منذ الخطوة 1 ومحددة سلفا لقياس الخلفية، حدد "إضافة خطوة" وتعيين الخطوة 2 لقياس مؤشر خلية كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة.
ملاحظة: للحصول على العلاج، والتي من المتوقع مع تأثيرات حركية سريعة، تعيين الاحتلالات على فترات أقصر. - انقر فوق ابدأ لبدء الخطوة مسبقا تلقائيا 1وقياس مقاومة خلفية وسائل الإعلام. يتم طرح هذه القيمة تلقائيا من قبل البرنامج في كل نقطة البيانات مرة واحدة تضاف الخلايا إلى الآبار.
- استخدام معدة مسبقا في الخطوة 1.5) تعليق خلية من 300،000 خلية / مل في انتشار المتوسطة. 30،000 خلية / جيدا لسمية خلية / الدراسات العصبية و 15،000 خلية / جيدا للدراسات تكاثر الخلايا. إخراج E-بلايت وإضافة 100 تعليق خلية ميكرولتر لكل بئر لسمية خلية دراسات / العصبية وإضافة 50 ميكرولتر التعليق الخلية و 50 ميكرولتر انتشار المتوسطة لكل بئر للدراسات تكاثر الخلايا. عدد الخلايا مطلي لكل بئر يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل خط الخلية تجريبيا.
- دوامة بلطف لوحة E-96 لحتى الطلاء من الخلايا. مغادرة-E 96 لوحة لمدة 30 دقيقة في نسيج الثقافة هود في RT السماح الخلايا بالتساوي تستقر في قاع الآبار.
- إدراج لوحة E 96 في الوقت الحقيقي محطة محلل الخلية وتبدأ الخطوة 2 على جدول صالعمر. مراقبة القيم مؤشر الخلية في كافة مراحل التجربة عن طريق عرض منحنيات خلية على الصفحة مؤامرة وبيانات مؤشر الخلية الخام على الصفحة مؤشر خلية من البرنامج.
3. مصل الحرمان
- 24 ساعة بعد طلاء الخلايا، وقفة التجربة، وإزالة لوحة E-96 من الوقت الحقيقي محطة محلل الخلية. تمييع مثبطات رسول الثانية من المخزونات 1،000X مع DMEM / F12 المصل خالية المتوسطة - إلى 200 × تركيز النهائي. علاج الخلايا مع 1 ميكرولتر مثبطات مسارات الرسول الثانية لفحصها لتورطهم في السمية العصبية / العصبية 30 دقيقة قبل البدء في السمية الخلوية، لمنع مسارات منها. إعادة بليت E 96 إلى المحطة واستئناف قياسات مؤشر الخلية التجريبية.
- بعد 30 دقيقة وقفة التجربة مرة أخرى. إزالة بعناية انتشار المتوسطة بالكامل من لوحة E-96 بئرا مع ماصة (أو متعدد القنوات ماصة)، مع الحرص على عدم تعطيل طبقة الخلايا الملتصقةبتوجيه حافة غيض ماصة لزاوية البئر. إضافة 200 ميكرولتر / جيد من المصل خالية DMEM / F12 المتوسطة (المصل الحرمان المتوسطة). ضمان التبادل السريع للخلية ثقافة المتوسط للحد من الانفعالات الميكانيكية للخلايا.
- تمييع المركبات لفحصها لآثارها اعصاب من المخزون 1،000X مع المصل خالية DMEM / F12 المتوسطة إلى 200 × تركيز النهائي. إضافة 1 ميكرولتر المركبات لفحصها لآثارها اعصاب و1 ميكرولتر مثبطات مسارات الرسول الثانية في الآبار الفردية وفقا للخطة التجريبية.
- في الخلايا للدراسات الانتشار لا تتغير المتوسطة. تمييع المركبات لفحصها من المخزون 1،000X إلى 200 × التركيز النهائي في انتشار المتوسطة، وعلاج مع 1 ميكرولتر لكل بئر والاستمرار في انتشار الثقافة في المتوسط.
- استئناف التجربة على مواصلة قياسات مؤشر خلية كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة كما هو مبين سابقا.
4. البيانات وnalysis
- عن العصبية / تطبيع البيانات العصبية مؤشر الخلية إلى نقطة زمنية الأخيرة قبل العلاج الدوائي أو تغيير المتوسطة للحد من التفاوت بين التجارب عن طريق اختيار "مؤشر الخلية تطبيع" و "تطبيع تايم" على الصفحة مؤامرة.
- تسليط الضوء على الآبار على الصفحة مؤامرة لظروف تجريبية من الفائدة وانقر على "إضافة" لرسم منحنيات طبيعية مؤشر الخلية. مراقبة حركية / الأثر السمي العصبي اعصاب، أو من الرسل الثاني تثبيط وتطبيع منحنيات مؤشر الخلية بوصفها وظيفة من الزمن.
- مراقبة منحنيات مؤشر خلية لاختبار العلاجات المخدرات في وسط انتشار بوصفها وظيفة من الوقت لتقييم ما إذا كان لها تأثير على انتشار ويشارك في اعصاب / الأثر السمي العصبي.
- تصدير المعلومات التجريبية لجميع النقاط خلية وقت الفهرس من خلية الصفحة برنامج مؤشر إلى ملف Excel لبدء التقييم الإحصائي للنتائج
- للتحليل الإحصائي من الاختلافات في قيم مؤشر الخلية في ظل ظروف معاملة مختلفة في نقاط زمنية محددة، حدد القيم مؤشر الخلية في نقاط زمنية منها من ملف Excel المصدرة. تحليل القيم مؤشر الخليوي لنقاط زمنية محددة مع اتجاه واحد أو اتجاهين تحليل التباين (ANOVA)، يليه اختبار آخر، خاصة باستخدام البرامج الإحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يؤدي الحرمان من الدم إلى انخفاض في قيم مؤشر الخلية، والتي يمكن رصدها بشكل مستمر مع محلل خلية في الوقت الحقيقي
المحفزات السمية العصبية إلى الخلايا تؤدي إلى انخفاض في قيم مؤشر الخلية، والتي يمكن رصدها في الوقت الحقيقي مع تقنية عرض وديناميات التي تعتمد على التحفيز العصبي محددة ونوع من الخلايا التي تمت دراستها. يوضح الشكل (2) والزيادة في مؤشر الخلية عندما تزرع الخلايا SK-N-SH في انتشار المتوسطة حتى تصل إلى القاع (الخط الأخضر) وانخفاض مؤشر خلية تليها الاستقرار في المستويات الدنيا الجديدة بعد تحويل الخلايا إلى المصل الحرمان المتوسطة (خط أحمر). قد يمثل هذا الانخفاض تغيير في الالتصاق الخلوي بسبب انسحاب المصل.
يمكن رصد الآثار اعصاب من العلاج من تعاطي المخدرات بشكل مستمر مع محلل خلية في الوقت الحقيقي
"> تأثير اعصاب المركبات وأضاف قبل (قبل المعالجة)، في نفس الوقت (شارك في العلاج) أو بعد التحفيز العصبي (مما يشير إلى انتعاش الخلية) كما يمكن اتباعها باستمرار مع محلل خلية في الوقت الحقيقي، وبالتالي توفير المعلومات حول . معدل ومدة تأثير اعصاب الشكل 3 يبين نتائج ممثلة لديناميات العصبية اثنين من 5-HT منبهات 2A - 5 ميكرومتر دوى (الشكل 3A) و 20 ميكرومتر يسوريد (الشكل 3B) وأضاف في وقت تبديل الخلايا في المصل المتوسطة الحرمان.محلل خلية في الوقت الحقيقي يسمح للتمييز بين الآثار المترتبة على بقاء الخلايا وتكاثر الخلايا
سؤال مهم في الدراسات العصبية في خطوط الخلايا العصبية هو ما إذا كان لها تأثير على تكاثر الخلايا يساهم في التأثير المركب الملحوظ على بقاء الخلية. مع الشرج خلية في الوقت الحقيقيyzer التأثير على انتشار يمكن اختبارها في نفس E-بلايت 96 تقييم السمية العصبية. ويبين الشكل 4 عدم وجود تأثير من 5 ميكرومتر دوى العلاج على الخلايا SK-N-SH انتشار، مما يشير إلى تأثير على انتشار لا تساهم في الملاحظة تأثير اعصاب.
محلل خلية في الوقت الحقيقي يسمح لتحديد المسارات التي تشارك رسول الثانية في اعصاب / التأثيرات السمية العصبية
تنشيط مستقبلات يبدأ سلسلة من الآثار رسل الثانية. البروتوكول الحالي يسمح للكشف عن تورط عدد من رسل الثانية في / الأثر السمي العصبي اعصاب في الوقت الحقيقي من خلال المعالجة مع مثبطات بهم. منذ تأثير مثبطات رسل الثانية على بقاء الخلية يمكن ضوحا، وهو في كثير من الحالات لا خطية مع الوقت، بعد حركية لها هو مفيدة للغاية. الشكل 5 يعرض تأثير 10 ميكرومتر فوسphatidylinositol 3 كيناز (PI3-K) المانع LY294002 على بقاء الخلايا العصبية ودوى في الخلايا SK-N-SH-حرم المصل. في الرسم البياني المقدمة، منعت 10 ميكرومتر LY294002 تأثير اعصاب من الحرمان دوى في المصل، ولكن كان أيضا بعض التأثير السام من تلقاء نفسها.
ذات الصلة مسارات رسول الثاني والمانع يمكن تحديد تركيزات لكل مجمع اختبارها من خلال البحث الأدب. لابد من التحقق من تركيزات ملاءمة رسل الثانية مثبطات، وإذا لزم الأمر الأمثل تجريبيا. هدف الأمثل هو لتحديد تركيز، والذي له تأثير ضئيل على القيم مؤشر الخلية في حد ذاته، في حين لا تزال تمنع بشكل فعال رسول الثاني منها. كمثال، بعض مسارات رسول مثبطات الثانية، والتي يمكن أن تكون ذات صلة إلى 5-HT 2A مستقبلات، ترد في الجدول 1. هذه مثبطات استخدمت سابقا لتقييم أهداف المصب المشاركة في زيادة هرمون السيروتونين من تحويلةracellular التنظيم إشارة كيناز الفسفرة 9. أظهرنا فائدتها لتقييم مسارات المصب المشاركة في العصبية بنسبة 5-HT منبهات مستقبلات 2A بعد التأكد وفي بعض الحالات تحسين تركيزاتها لدينا النموذج التجريبي 7.
الرقم 1. رسم تخطيطي لسير العمل الواردة في البروتوكول الحالي. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تأثير الحرمان المصل على مؤشر الخلية. الحرمان المصل (الخط الأحمر) يؤدي الى انخفاض سريع في مؤشر الخلية، مقارنة مع زيادة تدريجية في خلية القيم المتوسطة في مؤشر انتشار (الخط الأخضر). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. تأثير 5-HT منبهات 2A على مؤشر الخلية بعد الحرمان المصل. العلاج بالأدوية سيتوبروتيكتيفي (في هذه التجربة 5-HT منبهات 2A دوى (5 ميكرومتر) (A) (الخط البنفسجي) ويسوريد (20 ميكرومتر) (B () خط أرجواني غامق) يستعيد جزئيا القيم مؤشر الخلية بنسبة الحرمان المصل (خط أحمر). يرجى النقرهنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. خلية قيم مؤشر في سياق تكاثر الخلايا. العلاج مع المخدرات في انتشار المتوسطة (في التجربة الحالية 5 ميكرومتر دوى) (الخط البنفسجي) تسمح لتقييم تأثير على انتشار بالمقارنة مع العلاج السيارة (الخط الأخضر). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. مثبطات رسول الثانية قد تؤثر على بقاء الخلية من تلقاء نفسها، ويمكن استخدامها للكشف عن تأثير مسارات الرسول الثانية على obseالعصبية rved. في هذه التجربة تعرضوا للحرمان خلايا الدم يعالجون مع سيارة (الخط الأحمر)، 1 ميكرومتر دوى (الخط البنفسجي)، سابقة التجهيز مع 10 ميكرومتر PI3-K المانع LY294002 وتعامل مع 1 ميكرومتر دوى (الخط الأزرق) أو سابقة التجهيز مع 10 ميكرومتر LY294002 وتعامل مع سيارة (الخط الأسود). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: أمثلة من مثبطات رسول الثانية، والتي يمكن أن تكون ذات صلة لمدة 5-HT 2A مستقبلات مسارات المصب وتركيزاتها استخدامها من قبلنا في الوقت الحقيقي التجارب محلل الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم البروتوكول الحالي فائدة محلل خلية في الوقت الحقيقي لتقييم مستمر وتحت ظروف خالية من تسمية / التأثيرات السمية العصبية اعصاب من المركبات في خطوط الخلايا العصبية وإلى التبصر في مسارات الرسول الثانية المشاركة في التنفيذ.
على الرغم من فائدة محلل خلية في الوقت الحقيقي لدراسة السمية الخلوية وآثار المخدرات على تكاثر الخلايا والمعترف بها عموما، استخدمت سوى عدد قليل من الدراسات في أنواع الخلايا العصبية ذات الصلة. أظهرنا سابقا فائدة محلل خلية في الوقت الحقيقي لمراقبة العصبية من 5-HT 2A مستقبلات ناهض في الخلايا العصبية البشرية SK-N-SH، في حين جالانت آخرون، أظهرت أنها يمكن أن تستخدم لتقييم السمية العصبية لل بيتا اميلويد الببتيدات العصبية في الإنسان خلايا SH-SY5Y 7،10. اقترحت دراسة حديثة أنه في حين أن الخلايا محلل في الوقت الحقيقي قياس موثوق انتشار الخلايا وموت الخلايا فيخط الخلية euronal والخلايا العصبية السلائف، والدقة في تقييم موت الخلايا في الخلايا العصبية الأولية تعتمد على شدة الإهانة 5. الأهم من ذلك أن التيار المتناوب المستخدمة في الوقت الحقيقي محلل نظام الخلية من حجم منخفض جدا، وتوليد التيارات مكرو أمبير. هذه التيارات هي أقل بكثير من إمكانات عتبة الخلايا منفعل باسم الخلايا العصبية. يعتمد نظام محلل خلية في الوقت الحقيقي على قياسات مقاومة من السطح السفلي من لوحة E-96 بئرا، وبالتالي فإن درجة الالتزام خلية ذات أهمية حاسمة. فمن الممكن أن مزيد من التحسين من طلاء الآبار E-بلايت مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية لالتزام أفضل قد يحسن النتائج التي تم الحصول عليها مع الخلايا العصبية الأولية.
توضح المخطوطة الحالية نهجا جديدا من استخدام النظام في الوقت الحقيقي محلل خلية لتحديد مسارات الرسول الثانية المشاركة في العصبية. يعتمد بروتوكول لدينا على تثبيط المواد الكيميائية من ميسي الثانيngers افترض أن تشارك في عمل وكيل اعصاب. الجدول 1 بعض القوائم التي يشيع استخدامها الثانية مسارات رسول مثبطات، والتي يمكن أن تكون ذات صلة إلى 5-HT 2A مستقبلات كمثال، وتركيزاتها المناسبة للنموذج التجريبي المقدمة. هذا التصميم التجريبي يسمح للفحص السريع للمسارات الرسول الثانية ذات الصلة المحتملة، لتحديد أهداف المصب لدراسات أكثر تفصيلا من خلال نهج متكاملة.
ميزة هامة للمحلل خلية في الوقت الحقيقي هي أيضا القدرة على تقييم ما إذا كان لها تأثير على انتشار هو جزء من تأثير اعصاب ملاحظتها. باستخدام خطوط الخلايا العصبية بدلا من الخلايا العصبية الأولية في المقايسات سمية يقدم بعض المزايا، وانخفاض التكلفة، وسهولة الوصول، وهناك حاجة لإجراء التجارب على الحيوانات. ولكن نظرا لحقيقة أن خطوط الخلايا العصبية على النقيض من الخلايا العصبية الأولية تتكاثر، التأثير المحتمل على انتشار يحتاج إلى رقابة لفيفحوصات السمية العصبية. الفرصة محلل خلية في الوقت الحقيقي يوفر لأداء هذه السيطرة في نفس تجريبية E-96 لوحة، ويسهل التصميم التجريبي.
تحتاج العديد من المعايير الفنية للنظر في التجارب مع محلل خلية في الوقت الحقيقي. عدد الخلايا إلى أن لكل بئر مطلي ينبغي أن تحدد تجريبيا من خلال تجربة المعايرة لكل نوع من الخلايا التي تم اختبارها. وبدأت سمية الخلايا وانتشار العلاج عن بعد 24 ساعة من بدء زراعة الخلايا، للسماح الالتزام التام من الخلايا. وتم الحصول على أفضل النتائج في التجارب السمسة بدءا عندما تصل خلايا 65-70٪ التقاء في البروتوكول الحالي. للتجارب انتشار ويفضل أقل التقاء الخلية (20-30٪) لمتابعة تأثير المخدرات على منحنى الانتشار النووي.
في المصل البروتوكول الحالي يعرض نموذج الحرمان العصبية بسبب قوة لها، وسهولة الاستخدام وأداة لتقريبالحرمان الغذائي بوساطة موت الخلايا العصبية، وهو أمر مهم خلال تطوير والدماغ الحاد أو الصدمة العصبية، والتنكس العصبي 11. ومع ذلك، مجموعة واسعة من النماذج العصبية يمكن استخدامها مع الوقت الحقيقي نظام محلل الخلية. هنا، يتم تقديم العلاج المشترك مع وكيل سيتوبروتيكتيفي في وقت سمية الخلايا. ومع ذلك، قبل المعالجة أو المعالجة بعد (خلية الانتعاش تقييم) الحدث السامة ويمكن أيضا أن تستخدم هذا يتوقف على المركبات التي يجري اختبارها.
عموما، يوحي البروتوكول الحالي فائدة نظام محلل خلية في الوقت الحقيقي لتقييم السمية العصبية والعصبية في خطوط الخلايا العصبية بشكل مستمر وخالية من التسمية واكتساب نظرة ثاقبة مسارات المصب المشاركة في هذه الآثار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم برعاية تكاليف النشر للفيديو مادة الحالية "ACEA العلوم البيولوجية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Protection Agency. (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
