Abstract
Birçok beyin ile ilgili bozukluklar kendi patofizyolojisinde rol nöronal hücre ölümünü var. Uyuşturucu ve nöro / nörotoksisitenin moleküler mekanizmaları anlamak ve potansiyel ilaç gelişimini kolaylaştırabilir yardımcı olacağını çıkıyor aşağı yollar nöroprotektif veya nörotoksik etkilerini incelemek için in vitro modellerinde geliştirilmiş. Ancak, birçok mevcut in vitro toksisite deneyleri büyük sınırlamaları var - çoğu değil zaman ders ve etkisi kinetiğini gözlemlemek için izin, tek bir zaman noktasında nörotoksisiteyi ve nöro değerlendirmek. Ayrıca, gerçek zamanlı olarak nöro katılan aşağı sinyal yollar hakkında bilgi toplamak için fırsat büyük önem olurdu. Mevcut protokolde, etiket içermeyen ve gerçek zamanlı iklimlendirme altında, nöronal hücre hattında serotonin 2A (5-HT2A) reseptör agonistlerinin nöro-koruyucu etkisini araştırmak üzere bir reel-zamanlı empedans tabanlı hücre analiz kullanılmasını tarif ederempedans ölçümleri kullanarak iyonları. Ayrıca, ikinci haberci yollarının inhibitörleri nöro-koruyucu etkisinin dahil alt molekülleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca hücre proliferasyonu üzerinde bir etkiye sahip bir gözlenen nöro-koruyucu etkisine katkıda olup olmadığını belirlemek için bu tekniğin programı açıklanmaktadır. Sistem, kuyuların alt yüzeyi üzerinde altın mikro-elektrot diziler alternatif hücre sensör olarak işlev gören ihtiva e-Plakalar olarak adlandırılır özel mikroelektronik plakalar kullanır. Empedans okuma yapışık hücreler, hücre canlılığı, morfolojisi ve yapışma sayısına göre modifiye edilir. Hücre Endeksi olarak adlandırılan bir boyutsuz parametre elektrik empedans ölçümleri elde edilir ve hücre durumunu temsil etmek için kullanılır. Genel olarak, gerçek zamanlı empedans tabanlı hücre analiz fazla katkı, gerçek zamanlı, nöro-korumanın ve nörotoksisite etiketsiz değerlendirmesi, haberci ve ikinci yollar katılımının değerlendirilmesine izin verirtedavi ilaçlarını seçilmesi için in vitro nöro-koruyucu potansiyel bileşiklerin ayrıntılı ve yüksek verim değerlendirmesi.
Introduction
Nöronal hücre ölümü, birçok beyin-1 ile ilişkili bozuklukların patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. In vitro toksisite deneyleri güvenilir ve yüksek verimlilik kullanılabilirliği nörotoksisitenin mekanizmaları daha iyi anlamanıza ve ilaç geliştirme 2 terapötik aday olarak nöro molekülleri seçmenize yardımcı için çok önemlidir. Bununla birlikte, en yaygın olarak kinetik çözülmesine izin veren tek bir zaman noktasında nörotoksisite / değerlendirmek için nöro-nitro nörotoksisite assays.They olarak kullanılan bir çok sınırlamalar mevcuttur; çoğu zaman sinyal yollarına müdahale ve aynı hücre popülasyonunda ek çalışmalar sınırlamak ve genellikle bir iş gücünü gerektirir ve pek çok durumda mekanik bir bilgi sağlar yok olabilir veya bir etiket sonda kullanma. Bu çalışmada gerçek zamanlı ve altında, nöronal hücre hattında nöro-toksisiteyi ve nöro-belirlemek için, gerçek zamanlı bir empedans tabanlı hücre analiz yararlılığını göstermek etiketsizkoşulları etkilenmesinde rol ikinci haberci yollara analizi yoluyla aşağı mekanizmaları içgörü sağlamak ve.
Önceki çalışmalar, standart teknikler ile karşılaştırıldığında, 3,4,5,6 sitotoksisite gibi hücre hatları, hücre çoğalması üzerindeki etkisini belirlemek için, gerçek zamanlı hücre analiz geçerliliğini teyit etmiştir. Örneğin, bir iyi bir korelasyon bazal koşullar altında çoğalması ve HeLa hücrelerinde 3, iki farklı toksik paradigmaların ardından çeşitli zaman noktalarında standart hücre canlılığı, WST-1 deneyinin okumalar ve hücre endeksi değerleri arasında gözlenmiştir. Celi Endeksi ölçümleri ile ve standart olarak kullanılan sülforodamin B (SRB) 4 deney sırasında mikrotübül dengeleyici paklitaksel ile tahrik A549 ve MDA-MB-231 hücreleri çoğalması ve sitotoksisitesinde çok benzer sonuçlar göstermiştir. Ölümsüzleştirilmiş hipokampal nöronlarının nöronal hücre hattı HT-22 Hücre indeksi ölçümlerinin yetenekleri t doğrulanmıştıro yaygın olarak kullanılan 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl) karşı, hücre proliferasyonunu, glutamat sitotoksisitesinin ve sitoproteksiyonunu 2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) deneyi 5 algılar. Aynı çalışmada MTT deneyi sonuçları ve Hücre Endeksi ölçümleri de pan-kaspaz inhibitörü Qvd 5 ile büyüme faktörleri yoksunluk ve sitotoksisite kurtarılması sonrasında nöronal progenitör hücrelerin çoğalması, sitotoksitesi ölçme pozitif ilişkilidir. Vandetanib (vasküler endotel büyüme faktörü reseptör ve epidermal büyüme faktörü reseptörü inhibitörü) ile NIH 3T3 hücrelerinde olduğu sitotoksisitesi, hücre endeksi değerleri ya da nötr kırmızı alım deneyi 6 ölçülen benzer sonuçlar göstermiştir.
Son zamanlarda, serotonin 2A nöro-koruyucu etkisini değerlendirmek için gerçek zaman hücre analiz sistemi kullanılmaktadır (5-HT2A) alıcı agonisti (±) -2,5-dimetoksi-4-iodoamphetamine hidroklorür, nöronal bir hücre hattında (DOI) ( SK-N-SH hücreleri) ve Seco katılımı açısından tarandıgözlenen nöro-7 kimyasal inhibisyon etkinin izlenmesi sayesinde nci mesaj yolakları. İlginç bir şekilde, 5-HT2A reseptör yaygın ve farklı bir ikinci haberci yolları 8 hem de aktive edebilmektedir (Doi ve lisurid, sırasıyla gibi) ve halüsinojen nonhallucinogenic hem agonistler hem de vardır.
Sunulan tekniğin avantajları, gün içerisinde hücre sağkalım üzerine gerçek zamanlı bilgi toplamak için nörokoruma çoğalması etkilerin olası katkısını değerlendirmek için, ve optimal zamanı seçmek için, ikinci-haberci yollar dahil belirginleştiren için izin vardır Aynı hücre popülasyonu üzerinde ek uç nokta çalışmaları için. Mevcut protokolde iş akışının şematik bir diyagramı Şekil 1'de sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık
- 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörü içinde, gerçek zamanlı hücre analiz cihazının istasyonu yerleştirin. , Steril koşullar altında, bir doku kültürü kaputu tüm hücre kültürü işleme ve farmakolojik tedaviler yürütmek.
- Not: kültür standart koşullar ile karşılaştırıldığında farklı bir sıcaklık ayarı gerektiren Nöronal hücre çizgileri, buna göre ayarlanmalıdır. Zayıf, yapışan hücre hatları için, E-Levha 96 kuyu altındaki altın mikroelektrotla hücre etkileşimi kolaylaştırmak için kaplama maddeleri kullanılır.
- (Uygun bir çözücü içinde nöro-koruyucu maddeler ya da ikinci haberci yollar inhibitörleri - dimetilsülfoksit ya da steril su) 1,000X hazır hücre kültürü tedavisi için farmakolojik bileşimlerin çözelti hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Aşağıdaki tedavilerinde araç olarak çözücü kullanın.
- DMEM / F1 Kültürü insan nöroblastoma SK-N-SH hücreleri2 ortamının, yaklaşık% 75 bir yoğunluğa 175 cm2 yüzey ile hücre kültürü şişeleri içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) (çoğalma ortamı) ile takviye edilmiştir. Hücre çoğalması ve sitotoksisite tepki hızı açısından deney arasında tutarlılık tespit etmek için (yaklaşık 10 geçitlerin) aralığında bir hücre kanalı sayısı tutun. Alt geçit numaraları tercih edilir.
- PBS ile yapışık SK-N-SH hücre tabakasını yıkayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile tripsinize edin çözeltisi. Santrifüj, 5 dakika boyunca 170 x g 'de, hücreler tripsin kaldırın. 10 ml çoğalma ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. Scepter hücre sayacı ile hücrelerin sayısı ve çoğalma ortamı ile hücrelerin sulandırarak 300,000 hücre / ml hücre sayısını ayarlayın.
2. Kaplama ve SK-N-SH hücrelerinin çoğalma
- E-96 Levha her çukuruna 100 ul çoğalma ortamı ilave edin ve oda sıcaklığında dengelenmeye doku kültürü kaputu 30 dakika boyunca bırakın. E-Pla takın37 ° C'de CO2 inkübatöründe gerçek zamanlı hücre analiz istasyonunda 96 te.
- Gerçek zamanlı hücre analiz yazılımını başlatın. Düzeni sayfa kuyular deneye dahil seçin ve düzenleme kutularını hücre tipi, hücre sayısı, isimleri ve hücre tedavisinde kullanılan kimyasal bileşiklerin konsantrasyonları hakkında bilgi girin.
NOT: Bu protokolün amaçları için en az 4 replika her tedavi için tavsiye edilir. - Program yazılım sayfada deneyde, Hücre İndeksi ve her adım için yapılan taramalar arasındaki aralığı ölçüm silme sayısını seçerek dahil "Adımlar" belirler. Adım 1 arka plan ölçümü için önceden belirlenmiş olduğundan, hücre indeksi 96 saat boyunca her 15 dakikada ölçmek ve set Adım 2 "bir adım ekleyin" seçeneğini seçin.
NOT: tedaviler için, hangi Hızlı kinetik ile etkiler, beklenen daha kısa aralıklarla süpürür ayarlayın. - Otomatik olarak önceden belirlenmiş Adım başlatmak için Başlat '1ve ortamın arka empedansı ölçmek. Hücreler, oyuklara ilave edilir sonra bu değeri otomatik olarak her bir veri noktasında yazılım tarafından çıkartılır.
- Çoğalma ortamı içinde 300,000 hücre / ml 'lik, daha önce 1.5 adım hazırlandı) hücre süspansiyonu kullanmaktadır. / Oyuk hücre toksisitesi / nöro çalışmalar ve iyi hücre çoğalması çalışmaları için 15,000 hücre / için 30,000 hücre. E-Plate çıkarın ve hücre toksisitesi / nöro çalışmaları için göz başına 100 ul hücre süspansiyonu ekleyin ve hücre çoğalma çalışmaları için oyuk başına 50 ul hücre süspansiyonu, 50 ul çoğalması orta ekleyin. Gözenek başına plakalanan hücre sayısı deneysel olarak her bir hücre hattı için optimize edilmesi gerekmektedir.
- Yavaşça hücrelerin bile kaplanması için E-Plate 96 döndürün. Hücreler kuyuların alt eşit yerleşmek izin vermek için oda sıcaklığında doku kültürü kaputu 30 dakika için E-Plate 96 bırakın.
- Gerçek zamanlı hücre analiz istasyonu E-Plate 96 takın ve zamanlama p Adım 2 başlayacakyaş. Plot sayfa ve yazılımın Hücre İndeks sayfasına ham Hücre Endeksi verilerine hücre eğrileri görüntüleyerek deney boyunca Hücre Endeksi değerleri izleyin.
3. Serum Yoksunluk
- 24 saat hücreleri kaplama sonra, deney duraklatmak ve gerçek zamanlı hücre analiz istasyonuna E-Plakasını 96 kaldırın. DMEM / F12, serum-içermeyen ortam ile 1,000X stoktan ikinci haberci inhibitörleri seyreltin - 200 x son konsantrasyon. Ilgili yolları inhibe etmek için, ikinci haberci yollarının 1 ul önleyicileri 30 dakika geçmeden önce sitotoksisite nörotoksisite / nöro katılımları için test edilecek olan hücrelerin tedavi edin. Istasyonuna E-Plate 96 İade ve deneysel Hücre Endeksi ölçümleri devam.
- 30 dakika sonra tekrar denemenizi durdurabilirsiniz. Dikkatle yapışık hücre tabakasını bozmak için özen bir pipet (veya çok-kanallı pipet) ile e-Plate tam olarak 96 kuyu çoğalması orta kaldırmakKuyunun köşesine pipet kenarını yönlendirerek. 200 ul / serum içermeyen DMEM / F12 ortamında (serum yoksunluğu ortamı) oyuk ilave edin. Hücrelerin mekanik ajitasyon en aza indirmek için, hücre kültür ortamı hızlı bir değişiminin sağlanması.
- Seyreltik bileşikleri nihai konsantrasyon x 200 olacağı şekilde, serum içermeyen DMEM / F12 ortamı ile 1,000X stoktan bunların nöroprotektif etkileri için test edilecek. 1 ul ekle bileşikleri bunların nöroprotektif etkileri, deneysel planına uygun olarak, tek tek oyuklara ikinci haberci yollarının 1 ul inhibitörleri için test edilecek.
- Çoğalma çalışmaları için hücreler ortam içinde değişmez. Oyuk başına 1 ul ile tedavi etmek ve çoğalma ortamı içinde kültüre devam çoğalma ortamı içinde nihai konsantrasyon x 200 1,000X stoktan, test edilecek bileşikler seyreltin.
- Önceden ayarlanmış olarak 96 saat boyunca Hücre Endeksi ölçümleri ile her 15 dk devam deney sürdürün.
4. Veri AANALİZ
- Nörotoksisite için / nöroproteksiyon veri Plot sayfada "Saat normalleştirmek" "normalize Hücre Göstergesi" seçerek deneyler arasındaki farklılıkları azaltmak ve farmakolojik tedavi veya orta değişiminden önce son kez noktaya Hücre Endeksi normalleştirmek.
- Ilgi deney koşulları için Plot sayfasında kuyuları vurgulayın ve normalize Hücre Endeksi eğrileri çizmek için "Ekle" butonuna tıklayınız. Ya da zamanın bir fonksiyonu olarak normalize Celi Endeksi eğrileri gibi ikinci habercileri inhibisyon nörotoksik / nöro-koruyucu etkinin kinetiğinin dikkate alınmalıdır.
- Çoğalması üzerinde bir etkisi nöro-koruyucu / nörotoksik etkisi olarak yer alıp almadığını değerlendirmek için, zamanın bir fonksiyonu olarak çoğalma ortamı içinde, test edilen ilaç tedavileri için Hücre Endeksi eğriler dikkat edin.
- Sonuçların istatistiksel olarak değerlendirilmesi başlatmak için bir Excel dosyası içine Hücre Endeksi yazılım sayfadaki tüm Cep Endeksi zaman noktaları için deneysel bilgi İhracat
- Belirli zaman noktalarında farklı tedavi koşullarında Hücre Endeksi değerlerindeki farklılıkların istatistiksel analizi için, dışa aktarılan Excel dosyasından ilgili zaman noktalarında seçin Hücre Endeks değerleri. Istatistiksel yazılım kullanarak bir post-hoc testi varyansın tek-yönlü veya iki yönlü analizi (ANOVA) ile seçilen zaman noktaları için Hücre Endeksi değerleri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
, Serum yoksunluğu, gerçek-zaman hücre analiz sürekli izlenebilir Celi endeksi değerlerine azalmaya yol açar
Nörotoksik uyarıcı hücrelere sunulan teknik ve spesifik nörotoksik uyaran ve testlerde kullanılan hücre türüne bağımlı olan dinamikleri ile gerçek zamanlı olarak takip edilebilir Celi endeksi değerleri bir azalmaya yol açmaktadır. Şekil 2 'de artış göstermektedir SK-N-SH hücreleri bir plato (yeşil hat) ve mahrumiyet ortamı (kırmızı çizgi) serum hücreleri geçtikten sonra yeni alt seviyelerde bir istikrar ardından Hücre Endeksin damla ulaşana kadar çoğalması ortamda yetiştirilen Hücre İndeksi. Bu düşmesi serumun ortamdan geri çekilmesi için hücresel yapışma içinde değişiklik gösterebilir.
İlaç tedavisinin nöro-koruyucu etkisi, gerçek zamanlı hücre analiz sürekli izlenebilir
"> Aynı anda (eş-tedavi) ya da nörotoksik uyaran sonra (hücre iyileşmeyi göstermektedir) seviyesinde (ön tedavi) ilave bileşiklerinin nöro-koruyucu etkisi hakkında bilgi veren ve böylece, gerçek zaman hücre analizcisi ile sürekli olarak takip edilebilir . oranı ve nöro-koruyucu etkisinin süresi Şekil 3 iki adet 5-HT2A agonistlerinin nöro dinamikleri temsili sonuçlarını göstermektedir - 5 uM DOI (Şekil 3A) ve 20 uM lisurid (Şekil 3B) içine hücrelerin anahtarlama anda ilave , serum yoksunluğu ortamı.Gerçek zaman hücre analiz hücrenin yaşamaya devam etmesi ve hücre çoğalması üzerindeki etkileri arasında ayırım yapmaya imkan vermektedir
Nöronal hücre hatlarında nöro çalışmalarda önemli bir soru hücre çoğalması üzerinde bir etkisi, hücre hayatta kalması ile ilgili en gözlenen bileşiğin etkisine katkıda olup olmadığıdır. Gerçek zaman hücre analYzer proliferasyonu üzerindeki etkisi aynı e-Levha test edilebilir 96 değerlendirmek nörotoksiklik. Şekil 4, gözlenen bir katkıda bulunmaz proliferasyonu üzerindeki bir etkiyi düşündüren, SK-N-SH hücrelerinin çoğalması üzerinde 5 uM DOI tedavinin etkisinin noksanlığını gösterir nöro-koruyucu etkisi.
Gerçek zamanlı hücre analiz ikinci haberci yollar nöroprotektif / nörotoksik etkileri katılan belirlemenize olanak sağlar
Reseptör aktivasyonu ikinci haberciler etkileri zincirini başlatır. Mevcut protokol onların önleyicileri ile ön-muamele yoluyla gerçek zamanlı olarak bir nöro-koruyucu / nörotoksik etkisi, ikinci haberciler bir dizi katılım taranması için izin verir. Zaman doğrusal değil, ikinci haberciler etkisi beri hücre sağkalım üzerine inhibitörleri telaffuz edilebilir ve birçok durumda ise, kendi kinetik aşağıdaki Şekil 5. Çok bilgilendirici 10 uM Phos etkisini sunarserumdan yoksun SK-N-SH hücrelerine hücre hayatta kalma ve DOI Nöroprotektif phatidylinositol 3-kinaz (PI3-Ka) inhibitörü LY294002. Sunulan Grafikte, 10 uM LY294002 serum yoksunluk içinde DOI'nin koruyucu etkisi engelledi, ama aynı zamanda kendi bazı toksik etkisi vardı.
İlgili ikinci haberci yollar ve her test bileşik için konsantrasyonları literatür taraması yoluyla belirlenebilir inhibitörü. Ikinci haberciler inhibitörlerinin konsantrasyonları uygunluğu doğrulanmış olması etti, ve gerekirse deneysel optimize edilmiş. Optimizasyonun amacı yine de etkili biçimde, ayrı ayrı ikinci haberci inhibe ederken, kendi başına hücre endeksi değerleri üzerinde minimal bir etkiye sahip olan bir konsantrasyonunu, seçmektir. Bir örnek olarak, 5-HT2A reseptörü ile ilgili olarak bazı ikinci mesajcı yolları inhibitörleri, Tablo 1'de sunulmuştur Bu inhibitörler, önceden ext serotonerjik artış dahil alt hedefleri değerlendirmek için kullanılmıştırracellular sinyal ile düzenlenen kinaz fosforilasyon 9. Bu teyit edilmesinden sonra ve deneysel örnekte 7 konsantrasyonlarını optimize bazı durumlarda, 5-HT2A reseptörü agonistleri tarafından nöro katılan aşağı yönde yolakları değerlendirmek için bunların kullanımını göstermiştir.
Şekil 1. mevcut protokole sunulan iş akışının şematik. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hücre İndeksi. Serum yoksunluğunun serum yoksunluk Şekil 2. Etkisi (kırmızı çizgi) çoğalması orta (yeşil hat) Hücre Endeks değerleri kademeli artışa kıyasla Hücre Endeksi'nde hızlı bir düşüş, uyarmaktadır. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. bu deney, 5-HT2A agonistleri DOI sitoprotektif ilaçları ile serumdan yoksun kalma sonrasında, hücre içeriği üzerindeki 5-HT2A agonistlerinin etkisi. Tedavisi ((5 uM) (A) (kırmızı çizgi) ve lisurid (20 uM) (B ) (koyu kırmızı çizgi) kısmen serum ayrımı (kırmızı çizgi) azalarak Hücre Endeks değerleri geri yükler. tıklayınızBurada bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
(Geçerli deney 5 mcM DOI) çoğalma ortamında ilaçlar ile hücre çoğalması elbette. Tedavi Şekil 4. Hücre Endeks değerleri (kırmızı hat) araç tedavisi (yeşil hat) göre çoğalması üzerine etkisini değerlendirmek için izin verir. tıklayınız Burada bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 5. İkinci haberci inhibitörleri tek başına hücre canlılığı etkileyebilir ve obse ile ikinci haberci yollarının etkisinin ekran için kullanılabilirSVEd nöro. hücreler içerisinde serum yoksunluğu tabi tutulmuştur Bu deneyde 10 uM, PI3-K inhibitörü LY294002 ile işlemden geçirilmiş ve 1 uM DOI (mavi çizgi) ya da ön-muamele ile muamele edilmiş taşıyıcı (kırmızı çizgi), 1 uM DOI (kırmızı çizgi) ile muamele edilmeden 10 uM LY294002 ve araç (siyah çizgi) ile işlenmiştir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: gerçek zamanlı hücre analiz deneylerinde kullanılan 5-HT 2A reseptör aşağı yolları ve bunların konsantrasyonları için uygun olabilir ikinci haberci inhibitörlerinin, örnekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geçerli protokol sürekli olarak, etiket içermeyen koşullar altında, nöronal hücre hatlarında bileşiklerin nöro-koruyucu / nörotoksik etkilerini değerlendirmek için ve etkisi dahil ikinci haberici yoluna daha iyi anlamak için, gerçek zamanlı bir analiz hücre yararını sunar.
Sitotoksisite ve hücre çoğalması üzerindeki ilaçların etkilerini incelemek için gerçek zamanlı hücre analiz cihazının programı genel kabul görmüş olsa da, sadece birkaç çalışmalarda nöronal ilgili hücre tipleri kullanmıştır. Galante ve ark. Göstermiştir ederken, daha önce bunun nörotoksisiteyi değerlendirmek için de kullanılabilir, insan nöroblastoma SK-N-SH hücreleri, 5-HT2A reseptör agonistinin nöro-izlemek için gerçek zamanlı hücre analizörün faydalanm göstermiştir insan nöroblastoma SH-SY5Y hücrelerinin 7,10 beta-amiloid peptit içerir. Yakın tarihli bir çalışmada gerçek zamanlı hücre analiz ölçülür ise güvenilir bir çoğalmayı ve hücre ölümü hücre önerdieuronal hücre çizgisi ve nöronal öncü hücreleri, primer nöron hücre ölümünü değerlendirirken, hassas boşaltım 5 şiddetine bağlıdır. Önemli olarak, gerçek zaman hücre analiz sistemi için kullanılan alternatif akım üreten mikroamper akım, çok düşük bir önem taşıdığını göstermiştir. Bu akımlar iyi nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin eşik potansiyelinin altındadır. Gerçek zaman hücre analiz sistemi bu nedenle hücre yapışma derecesi kritik bir öneme sahip olan E-Levha 96 deliklerinin taban yüzeyinden direnç ölçümüne dayanır. Bu daha iyi uyum için, hücre dışı matris proteinleri ile e-Plate tabakalarına kaplamada daha fazla optimizasyon primer nöron ile elde edilen sonuçları geliştirmek olasıdır.
Mevcut el yazması nöro katılan ikinci haberci yolları ayırmak için gerçek zaman hücre sistemi kullanılarak yeni bir yaklaşım sergilemektedir. Bizim protokol ikinci Messe kimyasal engellenmesi dayanırhipotez parmaklar bir nöroprotektif ajan eylem dahil olmak üzere. Sunulan deneysel örnek için, uygun Tablo 1, örnek olarak, 5-HT2A reseptörü ile ilgili olarak bazı yaygın olarak kullanılan ikinci ulak yolları inhibitörleri ve bunların konsantrasyonları. Bu deneysel tasarım tamamlayıcı yaklaşımlar aracılığıyla daha detaylı çalışmalar için aşağı hedefleri seçmek için, potansiyel olarak ilgili ikinci haberci yollara hızlı tarama sağlar.
Gerçek zamanlı hücre analiz önemli bir avantajı, aynı zamanda çoğalması üzerinde bir etkisi, gözlenen nöro-koruyucu etkisini gösteren bir parçası olup olmadığını değerlendirmek için yeteneğidir. Yerine toksisite deneylerinde primer nöronların hücre hatları kullanılarak daha düşük maliyet, kolay erişim ve hayvan deney için hiçbir ihtiyaç olarak bazı avantajlar sunmaktadır. Bununla birlikte, birincil nöronlar aksine nöronal hücre çizgileri çoğalan nedeniyle, proliferasyonu üzerindeki olası etkisi için kontrol edilmesi gerekmektedirnörotoksisite deneyleri. Gerçek zamanlı hücre analiz aynı deneysel E-plaka 96 bu denetimi gerçekleştirmek için sunduğu fırsat, deneysel tasarım kolaylaştırır.
Çeşitli teknik parametreler gerçek zamanlı hücre analizörü ile deneylerde dikkat edilmesi gereken. Her çukura test edilen hücre tipi için titrasyon deney yoluyla ampirik olarak belirlenmelidir başına hücre sayısı, kaplama gerekir. Sitotoksisite ve proliferasyonu tedavi tüm hücrelerin tam yapışmasını sağlamak için, hücre kültürünün başlatılmasından 24 saat sonra başladı. Hücreler ulaşmıştır% 65-70 izdiham başlayan sitotoksisite deneylerinde optimum sonuçlar mevcut protokolde elde edilmiştir. Çoğalma deneyleri için daha düşük hücre proliferasyon birleştiği eğri üzerinde, bir ilacın etkisini izlemek için (% 20-30) tercih edilir.
Geçerli protokol serumu yoksunluğu nörotoksite paradigma nedeniyle dayanıklılığı sunuldu, kullanım ve yarar kolaylığı yaklaştığıtrofik yoksunluk geliştirme, akut beyin veya sinir travması, ve nörodejenerasyonda sırasında 11 önemli nöron ölümünü, aracılı. Bununla birlikte, nörotoksisite paradigmaları geniş bir gerçek zaman hücre analiz sistemi ile birlikte kullanılabilir. Burada, sitotoksisite zamanda hücre koruyucu bir madde ile birlikte tedavisi sunulmuştur. Bununla birlikte, bu durumda toksik olayı (değerlendirmek hücresi geri kazanımı) sonra ya da tedavi aynı zamanda, bileşiklerin, test edilen bağlı olarak kullanılabilir.
Genel olarak, mevcut protokol sürekli olarak, etiket içermeyen nöronal hücre hatlarında nöro-toksisiteyi ve nöro-değerlendirmek ve bu etkiler dahil aşağı akış yolakları daha iyi anlamak için, gerçek zamanlı bir analiz sistemi ile hücre yararlılığını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geçerli video-makale için yayın masrafları "ACEA Biyobilimlerdeki" tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Protection Agency. (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
