Real-Time Impedans-baserte Cell Analyzer som et verktøy å avgrense molekylære stier involvert i Neurotoksisitet og nevro i en Neuronal cellelinje

Abstract

Mange hjerne-relaterte lidelser har neuronal celledød er involvert i deres patofysiologi. Forbedret in vitro modeller for å studere nervecellene eller nevrotoksiske effekter av narkotika og nedstrøms trasé involvert ville bidra til å få innsikt i de molekylære mekanismene for neurobeskyttelse / nevrotoksisitet og kan potensielt lette narkotika utvikling. Men mange eksisterende in vitro toksisitetsanalyser har store begrensninger - mest vurdere nevrotoksisitet og neurobeskyttelse hos en enkelt tidspunkt, ikke tillater å observere den tid-kurs og kinetikken av den virkning. Videre vil muligheten til å samle inn informasjon om nedstrøms signalveier involvert i nevro i sanntid være av stor betydning. I den nåværende protokoll beskriver vi bruken av en sanntids-impedans-baserte celle analysator for å bestemme nevrobeskyttende effekter av serotonin 2A (5-HT _2A) reseptoragonister i en neuronal cellelinje i henhold til etikett-fri og sanntids conditioner ved hjelp impedansmålinger. Videre viser vi at inhibitorer av andre messenger-veier kan brukes for å avgrense nedstrøms molekyler som er involvert i nevrobeskyttende virkning. Vi beskriver også anvendelsen av denne teknikken for å bestemme om en effekt på celleproliferasjon bidrar til en observert neurobeskyttende effekt. Systemet benytter spesielle mikroelektroniske platene referert til som e-platene som inneholder alternerende gull microelectrode matriser på den nederste overflaten av brønnene, som tjener som cellefølere. Impedansen avlesning er modifisert ved antallet adherente celler, celle-levedyktighet, morfologi og adhesjon. En dimensjonsløs parameter som kalles celleindeks er avledet fra de elektriske impedansmålinger, og blir brukt til å representere den celletilstand. Samlet sett gir sanntids impedans-baserte celle analysator for real-time, etikett-fri vurdering av nevro og nevrotoksisitet, og evaluering av andre messenger trasé engasjement, bidrar til merdetaljert og high-throughput vurdering av potensielle nevrobeskyttende forbindelser in vitro, for valg av terapeutiske kandidater.

Introduction

Nevronal celledød spiller en avgjørende rolle i patofysiologien av mange hjernerelaterte lidelser ^en. Tilgjengeligheten av pålitelig og høy gjennomstrømming in vitro toksisitets analysene er avgjørende for å få bedre innsikt i mekanismene for nevrotoksisitet og bidra til å velge nervecellene molekyler som terapeutisk kandidater i legemiddelutvikling ^to. Det er imidlertid mange begrensninger til de mest brukte in vitro nevrotoksisitet assays.They vurdere neurotoksisitet / neurobeskyttelse hos en enkelt tidspunkts ikke tillater kinetiske oppløsning; bruker ofte etikett eller sonde som kan forstyrre signalveier og begrense ytterligere studier i samme cellepopulasjon, og er ofte arbeidskrevende, og i mange tilfeller ikke gir mekanistisk innsikt. I den foreliggende undersøkelse viser at det er nytten av en sanntids-impedans-baserte celle analysator for å bestemme neurotoksisitet og nevrobeskyttelse i en neuronal cellelinje i sanntid og under etiketten frittforhold og for å gi innsikt i nedstrøms mekanismer gjennom analyse av andre messenger-veier som er involvert i virkningen.

Tidligere studier har bekreftet gyldigheten av sanntids-celle analysator for å bestemme cytotoksisitet samt virkninger på celleformering i cellelinjer i sammenligning med standardteknikker ^3,4,5,6. For eksempel ble en god korrelasjon observert mellom avlesninger av standard celle levedyktighet WST-1-analysen og celleindeksverdier på flere tidspunkter i henhold basal spredningsforhold og etter to forskjellige giftige paradigmer i HeLa celler ^tre. I A549 og MDA-MB-231 celler spredning og cytotoksisitet provosert med microtubuli stabilisator paclitaxel viste svært like verdier når vurdert av Cell Index målinger og standardly brukt sulforhodamine B (SRB) assay ^fire. I nevronale cellelinje av udødeliggjort hippocampus nevroner HT-22 Cell Index målinger ble validert for sin evne to detektere celleproliferasjon, glutamat cytotoksisitet og cytoprotection mot den mye brukte 3-(4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT) assay ^5. I den samme studien MTT analyseresultatene og Cell Index målinger også korrelert godt i måling nevronale stamceller spredning, cytotoksisitet etter vekstfaktorer deprivasjon og redning av cytotoksisitet av pan-caspase inhibitor Qvd ^fem. Cytotoksisitet indusert i NIH 3T3-celler ved Vandetanib (vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptor, og epidermal vekstfaktor-reseptor-inhibitor), viste tilsvarende resultater målt med Cell indeksverdier eller nøytral-rød opptaksanalyse ^6..

Vi har nylig benyttet sanntidscelleanalysesystemet for å vurdere nevrobeskyttende effekter av serotonin 2A (5-HT _2A) reseptoragonist (±) -2,5-dimetoksy-4-iodoamphetamine hydroklorid (DOI) i en neuronal cellelinje ( SK-N-SH-celler) og skjermet for involvering av second messenger-veier gjennom overvåke effekten av deres kjemiske hemming på den observerte neurobeskyttelse ^7.. Interessant nok har 5-HT _2A reseptor både hallusinogene og nonhallucinogenic agonister (som DOI og lisurid, henholdsvis), som kan aktivere både felles og distinkte andre messenger trasé ^åtte.

Fordelene med den fremlagte teknikk er at det gjør det mulig å samle informasjon i sanntid om celleoverlevelse i løpet av dager, for å avgrense andre messenger-veier som er involvert, for å vurdere den mulige bidrag av spredningseffekter til nevrobeskyttelse, og for å velge en optimal tids for ytterligere end-point-studier på den samme cellepopulasjon. Et skjematisk diagram av arbeidsflyten i den aktuelle protokoll er presentert i figur 1.

Protocol

1. Forberedelse

1. Plasser sanntidscelle analysator stasjon i en vevskultur-inkubator innstilt på 37 ° C og med 5% _CO2. Utføre alle cellekultur håndtering og farmakologisk behandling i en vev kultur hette under sterile forhold.
2. MERK: Neuronal cellelinjer som krever ulike temperaturinnstillinger i forhold til standard forhold for kultur, bør justeres tilsvarende. For svakt adherente cellelinjer, bruk beleggsmidler for å lette interaksjonen av celler med gullmikroelektroder i bunnen av brønnene av E-plate 96.
3. Forbered 1,000X stamløsninger av de farmakologiske forbindelser for behandling cellekultur (neurobeskyttende midler eller andre messenger-trasé-inhibitorer i det passende oppløsningsmiddel - dimetylsulfoksyd eller sterilt vann) og lagre dem ved -20 ° C. Bruk av løsningsmidlet som kjøretøyet i de følgende behandlinger.
4. Kultur human neuroblastoma SK-N-SH-celler i DMEM / F12-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (spredningsmedium) i cellekulturflasker med 175 ^cm2 overflate for å densitet på omtrent 75%. Hold celle passasje nummer innenfor et område (av ca 10 passasjer) for å fastslå samsvar mellom eksperimenter i form av frekvensen av celleproliferasjon og respons på cytotoksisitet. Lavere passasje tall er foretrukket.
5. Vask den vedheftende SK-N-SH celle laget med PBS, og trypsinize med 0,05% trypsin-EDTA-løsning i 5 min ved 37 ° C. Sentrifuger cellene ved 170 x g i 5 min for å fjerne trypsin. Resuspender cellene i 10 ml spredningsmedium. Telle celler med Scepter celleteller og justere celle nummer til 300.000 celler / ml ved fortynning celler med spredning medium.

2. plating og spredning av SK-N-SH Cells

1. Tilsett 100 ul proliferasjon medium til hver brønn av den E-plate 96 og la det stå i 30 min i vevskultur hetten ved RT til likevekt. Sett inn E-Plate 96 i sanntid analysator celle stasjonen i _CO2 inkubator ved 37 ° C.
2. Start sanntid celle analysator programvare. På Layout side velger brønnene inngår i forsøket og inn i redigeringsboksene informasjon om celletype, celle nummer, navn og konsentrasjoner av kjemiske forbindelser som brukes for cellebehandling.
   MERK: Ved anvendelsen av denne protokollen minst 4 gjentak er anbefalt for hver behandling.
3. På Schedule programvare siden bestemmer "Steps" inkludert i forsøket, ved å velge antall feier måle Cell Index og intervallet mellom feier for hvert trinn. Siden Trinn 1 er forhåndsbestemt for bakgrunnen måling, velg "Legg til et trinn" og sette trinn 2 for å måle Cell Index hvert 15 min i 96 timer.
   MERK: For behandlinger, hvor det forventes, setter feier med kortere intervaller effekter med raske kinetikk.
4. Klikk på Start for å starte automatisk forhåndsbestemt Trinn 1og måle bakgrunns impedans for mediet. Denne verdien blir automatisk subtrahert ved programvaren ved hvert datapunkt når cellene blir tilsatt til brønnene.
5. Bruk av på forhånd fremstilt i trinn 1.5) cellesuspensjon på 300.000 celler / ml i spredningsmedium. 30.000 celler / brønn for celletoksisitet / nevro studier og 15 000 celler / brønn for celle spredning studier. Ta ut E-Plate og tilsett 100 mL cellesuspensjon per brønn for celletoksisitet / nevro studier og tilsett 50 mL cellesuspensjon og 50 mL spredning medium per brønn for celle spredning studier. Antall celler per brønn belagt må optimaliseres for hver cellelinje empirisk.
6. Forsiktig virvle E-plate 96 for jevn plettering av cellene. La E-plate 96 i 30 minutter i vevskultur hetten ved RT for å tillate cellene slå seg jevnt på bunnen av brønnene.
7. Sett inn E-Plate 96 i sanntid celle analysator stasjonen og begynne Trinn 2 på timeplanen palder. Monitor Cell indeksverdier gjennom hele forsøket ved å vise celle kurver på siden Plott og rå Cell Index data på Cell Index side av programvaren.

3. Serum deprivasjon

1. 24 timer etter plating cellene, pause eksperimentet, og fjern E-Plate 96 fra sanntids celle analysator stasjon. Fortynn andre messenger-inhibitorer fra 1,000X bestander med DMEM / F12 serumfritt medium - til 200 x den endelige konsentrasjon. Unn-celler med 1 pl inhibitorer av andre messenger-veier som skal testes for deres involvering i neurotoksisitet / neurobeskyttelse 30 min før initiering av cytotoksisitet, for å inhibere de respektive baner. Returnere E-Plate 96 til stasjonen og gjenoppta eksperimentelle Cell Index målinger.
2. Etter 30 min pause eksperimentet på nytt. Fjern forsiktig spredning medium fullt fra E-Plate 96 brønner med en pipette (eller flerkanals pipette), tar seg ikke å forstyrre tilhenger celle lagetved å rette kanten av pipettespissen til hjørnet av brønnen. Tilsett 200 pl / brønn av serumfritt DMEM / F12 medium (serum deprivasjon medium). Sikre en rask utveksling av cellekulturmedium for å minimere mekanisk omrøring av cellene.
3. Fortynn forbindelser testes for deres nevrobeskyttende effekter fra 1,000X lager med serum-fritt DMEM / F12 medium til 200 x den endelige konsentrasjon. Legg 1 pl forbindelser testes for deres nevrobeskyttende effekter og 1 pl inhibitorer av andre messenger-veier i de individuelle brønnene i henhold til den eksperimentelle plan.
4. I celler for spredning studier ikke endrer medium. Fortynn forbindelser som skal testes fra 1,000X lager til 200 x den endelige konsentrasjon i spredningsmedium, behandle med 1 mL per brønn og fortsette å kultur i spredningsmedium.
5. Gjenoppta forsøket å fortsette med Cell Index målinger hvert 15 min i 96 timer som tidligere angitt.

4. Data Analysis

1. For nevrotoksisitet / nevro data normal Cell Index til forrige gang punktet før farmakologisk behandling eller middels endring for å redusere variasjon mellom eksperimenter ved å velge "normalisert Cell Index" og "normalisere Time" på plott.
2. Marker brønnene på tomten siden for de eksperimentelle forhold av interesse, og klikk "Legg til" for å plotte normalisert Cell Index kurver. Observer kinetikken av nevrotoksisk / nervecellene effekt, eller av andre budbringere hemming som normaliserte Cell Indekskurver som en funksjon av tiden.
3. Observer Cell Indeks kurver for de testede medikamentbehandlinger i spredningsmedium som en funksjon av tid for å vurdere om en effekt på proliferasjonen er involvert i den neurobeskyttende / nevrotoksisk effekt.
4. Eksportere den eksperimentelle info for alle Cell Index tidspunkter fra cellen Index software siden i en Excel-fil for å starte statistisk vurdering av resultatene
   
5. For statistisk analyse av forskjeller i celleindeksverdier under ulike behandlingsforhold på bestemte tidspunkter, velger Cell indeksverdier på respektive tids poeng fra den eksporterte Excel-filen. Analyser Cell indeksverdier for de valgte tidspunkter med en-veis eller to-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av en post-hoc-test ved anvendelse av statistiske software.

Representative Results

Serum deprivasjon fører til reduksjon i celle indeksverdier, som kan overvåkes kontinuerlig med sanntids celle analysator

Neurotoksiske stimuli til cellene fører til en reduksjon i celleindeksverdier, som kan overvåkes i sanntid med den fremlagte teknikk og dynamikken av disse er avhengig av det spesifikke nevrotoksisk stimulus og celletype undersøkt. Figur 2 viser økningen i Cell Index når SK-N-SH-celler dyrkes i spredning medium til å nå et platå (grønn linje) og slipp av Cell Index etterfulgt av en stabilisering på de nye lavere nivåer etter bytte cellene til serum deprivasjon medium (rød linje). Denne dråpe kan representere en forandring i cellulær adhesjon på grunn av tilbaketrekning av serumet.

Nevrobeskyttende effekter av behandling kan overvåkes kontinuerlig med sanntids-celle analysator

"> Den neurobeskyttende effekt av forbindelser tilsatt før (før behandling), på samme tid (co-behandling) eller etter nevrotoksisk stimulus (noe som tyder på cellegjenvinning) kan også følges kontinuerlig med sanntids-celle analysator, og dermed gi informasjon om . frekvensen og varigheten av den neurobeskyttende effekten Figur 3 viser representative resultater fra dynamikken i neurobeskyttelse av to 5-HT _2A-agonister - 5 uM DOI (figur 3A) og 20 uM lisurid (figur 3B) tilsatt ved tidspunktet for koblingsceller i serum deprivasjon medium.

Den sanntids celle analysator gjør det mulig å skille mellom virkningene på celleoverlevelse og celleproliferasjon

Et viktig spørsmål i neurobeskyttelse studier i neuronale cellelinjer, er om en effekt på celleproliferasjon bidrar til den observerte forbindelsen effekt på celleoverlevelse. Med sanntids celle analYzer effekten på proliferasjon kan testes i den samme E-plate 96 vurdere neurotoksisitet. Figur 4 viser den manglende effekt av 5 uM DOI behandling på SK-N-SH-celler proliferasjon, noe som tyder på en virkning på proliferasjonen ikke bidrar til den observerte nervecellene effekt.

Sanntids celle analysator gjør det mulig å finne ut hvilke andre messenger trasé er involvert i nervecellene / nevrotoksiske effekter

Reseptoraktivering initierer en kaskade av andre budbringere effekter. Den nåværende protokollen gjør det mulig å screene for involvering av en rekke andre budbringere i en nervecellene / nevrotoksisk effekt i sanntid gjennom forbehandling med sine hemmere. Siden effekten av andre budbringere inhibitorer for celleoverlevelse kan uttales, og er i mange tilfeller ikke er lineær med tiden, etter dens kinetikk er meget informative. Figur 5 viser effekten av 10 pM Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) inhibitor LY294002 på celleoverlevelse og DOI neurobeskyttelse i serum-belastede SK-N-SH-celler. I den fremlagte grafen, 10 mm LY294002 hindret nevroprotektiv effekten av DOI i serum deprivasjon, men hadde også noen toksisk effekt av sine egne.

Relevante andre messenger trasé og inhibitor konsentrasjoner for hver testet forbindelsen kan bli fastsatt gjennom litteratursøk. Konsentrasjoner egnethet andre budbringere hemmere er å bli bekreftet, og om nødvendig optimalisert eksperimentelt. Målet for optimalisering er å velge en konsentrasjon, som har en minimal effekt på celleindeksverdier av seg selv, samtidig effektivt å inhibere de respektive andre budbringer. Som et eksempel, noen andre messenger-trasé-inhibitorer, som kan være relevante for 5-HT _{2A-reseptoren,} er presentert i tabell 1. Disse inhibitorene har tidligere blitt brukt for å vurdere nedstrøms mål som er involvert i serotonerg økning av extracellular signal-regulert kinase fosforylering ^ni. Vi har vist sin nytte for å vurdere nedstrøms trasé som er involvert i nevrobeskyttelse av 5-HT _2A reseptor agonister etter å ha bekreftet, og i noen tilfeller å optimalisere deres konsentrasjoner for våre eksperimentelle paradigme ^7.

Figur 1. Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten presentert i den aktuelle protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Effekt av serum deprivasjon på Cell Index. Serum deprivasjon (rød linje) induserer en rask nedgang i Cell Index, sammenlignet med den gradvise økningen i celle indeksverdier i spredning medium (grønn linje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Effekt av 5-HT _2A-agonister på celleindeks etter serum mangel. Behandling med cellebeskyttende midler (i dette eksperimentet 5-HT _2A agonister DOI (5 uM) (A) (rød linje) og lisurid (20 pM) (B ) (mørk rød linje) delvis gjenoppretter Cell indeksverdiene redusert med serum deprivasjon (rød linje). Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Cell indeksverdier i løpet av celleproliferasjon. Behandling med legemidler i spredning medium (i dagens eksperiment 5 mikrometer DOI) (magenta linje) gjør det mulig å vurdere effekten på spredning i forhold til kjøretøybehandling (grønn linje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Second messenger-hemmere kan påvirke celleoverlevelse på egen hånd, og kan brukes til skjermen for effekten av andre messenger-veier på observed neurobeskyttelse. I dette eksperimentet ble cellene utsatt for serum-deprivasjon blir behandlet med kjøretøyet (rød linje), 1 uM DOI (magenta linje), forbehandlet med 10 mM PI3-K-inhibitor LY294002 og behandlet med 1 pM DOI (blå linje) eller forbehandlet med 10 mm LY294002 og behandlet med kjøretøy (sort linje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Eksempler på andre messenger-hemmere, som kan være relevant for 5-HT _2A reseptor nedstrøms trasé og deres konsentrasjoner brukes av oss i sanntid celle analysator eksperimenter.

Discussion

Den nåværende protokollen presenterer nytten av en real-time celle analysator til kontinuerlig å vurdere og under merkefrie forhold de nervecellene / nevrotoksiske effekter av forbindelser i nevronale cellelinjer og å få innsikt i de andre messenger trasé involvert i effekt.

Selv om sanntids celle analysator verktøyet for å studere cytotoksisitet og effekten av medikamenter på celleproliferasjon er generelt anerkjent, har bare noen få studier anvendes den i neuronale relaterte celletyper. Vi har tidligere vist nytten av sanntids-celle analysator for å overvåke neurobeskyttelse av en 5-HT _2A reseptor-agonist i humane neuroblastom SK-N-SH-celler, mens Galante et al. Har vist at den kan brukes til å vurdere nevrotoksisitet beta-amyloid peptider i human neuroblastom SH-SY5Y celler ^7,10. En fersk studie har antydet at mens sanntid celle analysator måles pålitelig celleproliferasjon og celledød i eneuronal cellelinje og nevrale forløper celler, dens presisjon i vurderingen av celledød i primær nevroner avhengig av alvorlighetsgraden av fornærmelse ^fem. Viktigere, den vekselstrøm som brukes for sanntids-celleanalysesystemet er av meget lav størrelsesorden, genererer microampere strømmer. Disse strømmene er godt under den terskelpotensialet eksiterbare celler, såsom neuroner. Den sanntids-celleanalysesystemet er avhengig av impedansmålinger fra den nedre overflaten av e-Plate 96 brønner, og derfor graden av cellene skulle vedhefte er av avgjørende betydning. Det er mulig at ytterligere optimalisering av belegget på E-Plate brønner med ekstracellulære matrix proteiner for bedre etterlevelse kan forbedre resultatene som oppnås med primære nerveceller.

Den nåværende manuskriptet viser en ny tilnærming for å bruke sanntid celle analysator system for å avgrense andre messenger trasé involvert i nevro. Vår protokollen er avhengig av den kjemiske hemming av andre messengers antatt å være involvert i handlingen av en nervecellene agent. Tabell 1 viser noen brukte andre messenger trasé-hemmere, som kan være relevante for 5-HT _2A reseptor som et eksempel, og deres konsentrasjoner egnet for frem eksperimentelle paradigmet. Dette eksperimentell design tillater rask screening av potensielt relevante andre messenger trasé, for å velge nedstrøms mål for mer detaljerte studier gjennom komplementære tilnærminger.

En viktig fordel av sanntids-celle analysator er også muligheten til å vurdere om en virkning på spredning er en del av en observert neurobeskyttende effekt. Ved hjelp av nevronale cellelinjer i stedet for primære nevroner i toksisitets analyser gir noen fordeler, som lavere kostnader, enkel tilgang og ikke behov for dyreforsøk. Imidlertid, på grunn av det faktum at neuronale cellelinjer i motsetning til primære neuroner spre seg, trenger potensiell effekt på proliferasjonen til å bli styrt for inevrotoksisitet analyser. Muligheten sanntids celle analysator har til å utføre denne kontroll i det samme eksperimentelle E-plate 96, letter den eksperimentelle design.

Flere tekniske parametere som må vurderes i eksperimenter med sanntid celle analysator. Antallet celler som skal bli belagt per brønn bør bestemmes empirisk ved hjelp av titrering eksperimentet for hvert testet celletype. Cytotoksisitet og proliferasjon behandling er alle startet etter 24 timer etter initiering av cellekulturen, for å tillate full tilslutning av cellene. Optimale resultater i cytotoksisitetstester eksperimenter med start når cellene har nådd 65-70% samløpet ble nådd i den aktuelle protokollen. For spredningsforsøk lavere celleløpet er foretrukket (20-30%) for å følge virkningen av et medikament på en spredningskurve.

I dagens protokoll serum deprivasjon nevrotoksisitet paradigmet er presentert på grunn av sin robusthet, til brukervennlighet og nytte tilnærmettrofisk deprivasjon mediert nevronal død, som er viktig under utvikling, akutt hjerneskade eller nerve traumer, neurodegenerering og ^11. Imidlertid, kan et bredt spekter av nevrotoksisitet paradigmer brukes med sanntids-celleanalysesystemet. Her er samtidig behandling med et cytoprotektive middel ved tidspunktet for cytotoksisitet presenteres. Imidlertid kan forbehandling eller behandling etter at det toksiske hendelse (vurdere cellegjenvinning) også bli benyttet, avhengig av forbindelsene som blir testet.

Samlet sett antyder gjeldende protokoll nytten av en real-time celle analysator system for å vurdere nevrotoksisitet og nevro i nervecellelinjer kontinuerlig og etikett-fri og å få innsikt i nedstrøms trasé involvert i disse effektene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate