Abstract
De nombreux troubles liés au cerveau ont mort des cellules neuronales impliquées dans leur physiopathologie. Amélioration des modèles in vitro pour étudier les effets neuroprotecteurs ou neurotoxiques de drogues et les voies en aval concernés aiderait mieux comprendre les mécanismes moléculaires de neuroprotection / neurotoxicité et pourrait faciliter le développement de médicaments. Cependant, de nombreux tests in vitro existantes sur la toxicité comportent des limites importantes - plus évaluer la neurotoxicité et la neuroprotection à un seul point du temps, ne permettant pas d'observer l'évolution temporelle et la cinétique de l'effet. En outre, la possibilité de recueillir des informations sur les voies de signalisation impliquées dans la neuroprotection aval en temps réel serait d'une grande importance. Dans le protocole en vigueur, nous décrivons l'utilisation d'une cellule d'analyse en fonction de l'impédance en temps réel pour déterminer les effets neuroprotecteurs de la serotonine 2A (5-HT 2A) des agonistes du récepteur dans une lignée de cellules neuronales dans le cadre sans marquage et en temps réel conditions à l'aide de mesures d'impédance. De plus, nous démontrons que les inhibiteurs de la seconde piste de messagerie peuvent être utilisés pour délimiter les molécules en aval impliqués dans l'effet neuroprotecteur. Nous décrivons également l'utilité de cette technique pour déterminer si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à un effet neuroprotecteur observé. Le système utilise des plaques spéciales microélectroniques dénommé E-plaques qui contiennent alternance réseaux de microélectrodes d'or sur la surface inférieure des puits, servant de capteurs cellulaires. L'affichage de l'impédance est modifiée par le nombre de cellules adhérentes, la viabilité des cellules, la morphologie, et l'adhérence. Un paramètre sans dimension appelé l'indice cellulaire est dérivé à partir des mesures d'impédance électrique et est utilisée pour représenter l'état de la cellule. Dans l'ensemble, le temps réel analyseur de cellules à base d'impédance permet en temps réel, l'évaluation sans étiquette de la neuroprotection et la neurotoxicité, et l'évaluation de la deuxième participation de voies de messagerie, contribuant à plusévaluation détaillée et à haut débit de composés neuroprotecteurs potentiels in vitro, pour la sélection des candidats thérapeutiques.
Introduction
La mort cellulaire neuronale joue un rôle critique dans la pathophysiologie de nombreux troubles liés au cerveau 1. La disponibilité d'informations fiables et à haut débit dans des tests de toxicité in vitro est essentiel d'avoir un meilleur aperçu des mécanismes de la neurotoxicité et d'aider à sélectionner des molécules neuroprotectrices comme candidats thérapeutiques dans le développement de médicaments 2. Cependant, il ya beaucoup de limitations à la plus largement utilisée in vitro neurotoxicité assays.They évaluer la neurotoxicité / neuroprotection à un seul point dans le temps ne permet pas la résolution cinétique; utilisent souvent l'étiquette ou de la sonde qui peut interférer avec les voies de signalisation et de limiter d'autres études dans la même population de cellules, et sont souvent de main-d'œuvre, et dans de nombreux cas ne fournit pas une approche mécanistique. Dans la présente étude, nous avons démontré l'utilité d'une cellule d'analyse en fonction de l'impédance en temps réel afin de déterminer la neurotoxicité et de neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale, en temps réel et sans marqueur sousconditions et permettent de mieux comprendre les mécanismes en aval à travers l'analyse de la seconde piste de messagerie impliqués dans l'effet.
Des études antérieures ont confirmé la validité de la cellule d'analyse en temps réel afin de déterminer la cytotoxicité, ainsi que les effets sur la prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires par comparaison avec des techniques classiques 3,4,5,6. Par exemple, une bonne corrélation a été observée entre les lectures de la norme viabilité cellulaire WST-1 essai et cellulaires valeurs de l'indice à plusieurs points dans le temps dans des conditions de prolifération basale et après deux paradigmes différents toxiques dans les cellules HeLa 3. Dans A549 et MDA-MB-231 cellules prolifération et la cytotoxicité provoquée par le paclitaxel de stabilisation des microtubules ont montré des valeurs très similaires lors de l'évaluation par la mesure de l'indice cellulaire et la sulforhodamine utilisé en standard B (SRB) essai 4. Dans la lignée cellulaire neuronale de neurones de l'hippocampe immortalisés Index HT-22 cellulaires mesures ont été validés pour leur capacité to détecter la prolifération cellulaire, la cytotoxicité et la glutamate cytoprotection contre le 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl) largement utilisé du 2,5-diphényl-bromure (MTT) 5. Dans la même étude, les résultats d'analyse de MTT et les mesures de l'indice cellulaire aussi bien corrélées à la mesure neuronale des cellules progénitrices prolifération, cytotoxicité après les facteurs de croissance privation et de sauvetage de la cytotoxicité par le pan-caspase inhibiteur QVD 5. La cytotoxicité induite dans des cellules NIH 3T3 par Vandetanib (récepteur du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire et d'un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique) a montré des résultats similaires avec des valeurs mesurées de l'indice cellulaire ou neutre essai d'absorption rouge 6.
Récemment, nous avons utilisé le système d'analyse de cellules en temps réel pour évaluer les effets neuroprotecteurs de la figure 2A de la sérotonine (5-HT 2A) agoniste du récepteur de chlorhydrate de (±) -2,5-diméthoxy-4-iodoamphétamine (DOI) dans une lignée cellulaire neuronale ( cellules SK-N-SH) et criblés pour la participation du second voies de messagerie par le biais de la surveillance de l'effet de leur inhibition chimique sur la neuroprotection observée 7. Fait intéressant, le récepteur 5-HT 2A a agonistes fois hallucinogènes et nonhallucinogenic (comme DOI et lisuride, respectivement), ce qui peut activer les deux secondes voies de messagerie communs et distincts 8.
Les avantages de la technique présentée est qu'il permet de recueillir des informations en temps réel sur la survie des cellules au cours de jours, pour délimiter les voies de seconds messagers impliqués, afin d'évaluer la contribution possible des effets de prolifération à la neuroprotection, et pour sélectionner un temps optimal des études supplémentaires de point final sur la même population de cellules. Un diagramme schématique du flux de travail dans le protocole actuel est présenté sur la figure 1.
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Protocol
Préparation 1
- Placez la station de la temps réel analyseur de cellules dans un incubateur de culture de tissu fixée à 37 ° C et 5% de CO 2. Effectuer toutes les manipulations de culture cellulaire et de traitements pharmacologiques dans une hotte de culture de tissu dans des conditions stériles.
- NOTE: neuronale lignées cellulaires nécessitant différents réglages de température par rapport à des conditions normales de culture, doivent être ajustés en conséquence. Pour les lignées cellulaires faiblement adhérentes, utiliser les agents de revêtement pour faciliter l'interaction des cellules avec les microélectrodes d'or dans le fond des puits de la plaque E-96.
- Préparer 1,000X solutions stock des composés pharmacologiques pour le traitement de culture cellulaire (agents neuroprotecteurs ou deuxième inhibiteurs de voies de messagerie dans le solvant approprié - diméthylsulfoxyde ou de l'eau stérile) et de les stocker à -20 ° C. Utilisez le solvant comme véhicule dans les traitements suivants.
- Culture des cellules de neuroblastome humain SK-N-SH dans du DMEM / F1Deux milieu supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) (milieu de prolifération) dans des flacons de culture cellulaire avec 175 cm 2 de surface de densité d'environ 75%. Garder nombre de passage de cellules dans une plage (environ 10 passages) pour vérifier la cohérence entre les expériences en termes de taux de prolifération cellulaire et de la réponse de cytotoxicité. Les nombres inférieurs de passage sont préférés.
- Laver la couche adhérente de cellules SK-N-SH avec du PBS, et trypsiniser avec une solution de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 5 min à 37 ° C. Centrifuger les cellules à 170 xg pendant 5 min pour éliminer la trypsine. Remettre en suspension les cellules dans du milieu de prolifération de 10 ml. Compter les cellules avec Sceptre compteur de cellules et d'ajuster le nombre de cellules à 300 000 cellules / ml en diluant les cellules avec un milieu de prolifération.
2. placage et la prolifération des cellules SK-N-SH
- Ajouter milieu de prolifération de 100 ul dans chaque puits de la plaque de E-96 et le laisser pendant 30 min dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pour équilibrer. Insérez le E-Plate 96 dans la station d'analyse de cellules en temps réel dans l'incubateur à CO2 à 37 ° C.
- Démarrez le logiciel de l'analyseur de cellules en temps réel. Sur la page Mise sélectionner les puits inclus dans l'expérience et entrent dans les boîtes de saisie des informations sur le type de cellule, le nombre de cellules, les noms et les concentrations de composés chimiques utilisés pour le traitement des cellules.
NOTE: Pour les fins du présent protocole au moins 4 répétitions sont recommandés pour chaque traitement. - Sur la page du logiciel de l'annexe déterminer "Steps" inclus dans l'expérience, en sélectionnant le nombre de balayages de mesure l'indice cellulaire et l'intervalle entre les balayages pour chaque étape. Depuis l'étape 1 est prédéterminée pour la mesure de fond, sélectionnez «Ajouter une étape» et réglez l'étape 2 pour mesurer l'indice cellulaire toutes les 15 minutes pendant 96 heures.
NOTE: Pour les traitements, dans lequel les effets avec une cinétique rapide sont attendus, mis balayages à intervalles plus rapprochés. - Cliquez sur Démarrer pour lancer l'étape prédéterminée automatiquement 1et mesurer l'impédance des supports de fond. Cette valeur est soustraite automatiquement par le logiciel au niveau de chaque point de données une fois que les cellules sont ajoutées aux puits.
- Utilisation préparé précédemment dans l'étape 1.5), suspension de cellules de 300 000 cellules / ml dans du milieu de prolifération. 30 000 cellules / puits pour la toxicité cellulaire / études de neuroprotection et 15 000 cellules / puits pour des études de prolifération de cellules. Sortez le E-Plate et ajouter 100 suspension cellulaire par puits pour la toxicité cellulaire / études de neuroprotection et ajouter 50 ul suspension de cellules et milieu de prolifération de 50 pi par puits pour les études de la prolifération cellulaire. Le nombre de cellules étalées par puits doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire de façon empirique.
- Agitez doucement le E-Plate 96, même pour le placage des cellules. Laisser la plaque E-96 à 30 min dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pour permettre aux cellules de se déposent uniformément sur le fond des puits.
- Insérez le E-Plate 96 dans la station d'analyse cellulaire en temps réel et commencer à l'étape 2 de l'annexe pâge. Surveiller les valeurs de l'indice de la cellule à travers l'expérience en regardant les courbes de cellules sur la page de terrain et les données de l'indice cellulaire premières sur la page Index portable du logiciel.
3. la privation de sérum
- 24 heures après l'étalement des cellules, mettre en pause l'expérience, et retirez le E-Plate 96 de la station d'analyse cellulaire en temps réel. Diluer deuxième inhibiteurs de messager des stocks 1,000X avec un milieu sans sérum / DMEM F12 - 200 × la concentration finale. Traiter les cellules avec 1 pi inhibiteurs de la seconde piste de messagerie pour être testés pour leur implication dans la neurotoxicité / neuroprotection 30 min avant de commencer la cytotoxicité, pour inhiber les voies respectives. Retour le E-Plate 96 de la gare et reprendre les mesures expérimentales de l'indice de la cellule.
- Après 30 min de pause à nouveau l'expérience. Retirez délicatement milieu de prolifération pleinement de l'E-Plate 96 puits avec une pipette (ou multi-canal pipette), en prenant soin de ne pas perturber la couche de cellules adhérentesen orientant le bord de la pointe de la pipette à l'angle du puits. Ajouter 200 pl / puits de DMEM sans sérum / milieu F12 (milieu de privation de sérum). Assurer un échange rapide d'un milieu de culture cellulaire pour réduire au minimum l'agitation mécanique des cellules.
- Diluer les composés à tester pour leurs effets neuroprotecteurs de 1,000X actions avec le milieu DMEM / F12 sans sérum à 200 × la concentration finale. Ajouter 1 composés de pi à tester leurs effets neuroprotecteurs et 1 pi inhibiteurs de la seconde piste de messagerie dans les puits individuels selon le plan expérimental.
- Dans les cellules pour des études de prolifération ne changez pas moyen. Diluer les composés à tester de 1,000X actions à 200 × la concentration finale dans le milieu de la prolifération, de traiter avec 1 l par puits et continuer à la culture en milieu de prolifération.
- Reprendre l'expérience pour poursuivre Index cellulaires mesures toutes les 15 minutes pendant 96 heures comme indiqué précédemment.
4. données Analyse
- Pour neurotoxicité / données de neuroprotection normaliser l'indice cellulaire au dernier point de temps avant le traitement pharmacologique ou changement de milieu pour réduire les variations entre les expériences en sélectionnant "Cell normalisée Index" et "normaliser Time" sur la page de la parcelle.
- Mettez en surbrillance les puits sur la page de la parcelle pour les conditions expérimentales d'intérêt et cliquez sur "Ajouter" pour tracer les courbes normalisées de l'indice de la cellule. Observer la cinétique de l'effet neurotoxique / neuroprotecteur, ou de messagers deuxième inhibition que les courbes de l'indice cellulaire normalisées en fonction du temps.
- Respecter les courbes de l'indice de portable pour les traitements médicamenteux testés en milieu de prolifération en fonction du temps d'évaluer si un effet sur la prolifération est impliqué dans l'effet neuroprotecteur / neurotoxique.
- Exporter l'info expérimental pour tous les points Cell temps Indice de la page du logiciel Indice de cellules dans un fichier Excel pour lancer l'évaluation statistique des résultats
- Pour l'analyse statistique des différences cellulaires valeurs de l'indice sous différentes conditions de traitement à des moments spécifiques, sélectionnez des valeurs de l'indice cellulaire à des moments respectifs à partir du fichier Excel exporté. Analyser les valeurs de l'indice de la cellule pour les points de temps choisis avec un sens ou dans les deux sens l'analyse de variance (Anova) suivie d'un test post-hoc en utilisant un logiciel statistique.
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Representative Results
Privation de sérum conduit à diminuer dans les piles valeurs de l'indice, qui peuvent être surveillés en permanence avec la cellule d'analyse en temps réel
Stimuli neurotoxiques aux cellules conduisent à une diminution de cellulaires valeurs de l'indice, qui peut être surveillé en temps réel avec la technique présentée et dont la dynamique dépend de la relance neurotoxique spécifique et le type de cellule étudiée. Figure 2 montre l'augmentation de la Indice de la cellule lorsque les cellules SK-N-SH sont cultivées dans un milieu de prolifération jusqu'à atteindre un plateau (ligne verte) et la baisse de l'indice cellulaire suivie d'une stabilisation dans les nouveaux niveaux inférieurs après la commutation des cellules de sérum moyen de privation (ligne rouge). Cette chute peut représenter un changement de l'adhésion cellulaire en raison du retrait du sérum.
Effets neuroprotecteurs de traitement médicamenteux peuvent être surveillés en permanence à la cellule d'analyse en temps réel
"> L'effet neuroprotecteur de composés ajoutés avant (pré-traitement), en même temps (co-traitement) ou après stimulation neurotoxique (suggérant la récupération des cellules) peut également être suivi en continu de la cellule d'analyse en temps réel, fournissant ainsi des informations sur . la vitesse et la durée de l'effet neuroprotecteur de la figure 3 montre des résultats représentatifs de la dynamique de la neuroprotection des deux 2A agonistes des récepteurs 5-HT - 5 pM de DOI (figure 3A) et 20 uM de lisuride (figure 3B) a été ajouté au moment de la commutation de cellules dans milieu de privation de sérum.La cellule d'analyse en temps réel permet de différencier les effets sur la survie cellulaire et la prolifération cellulaire
Une question importante dans les études de neuroprotection dans des lignées cellulaires de neurones consiste à déterminer si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à l'effet de composé observée sur la survie des cellules. Avec la cellule anal en temps réelYzer l'effet sur la prolifération peut être testée dans la même E-Planche 96 neurotoxicité évaluation. figure 4 montre l'absence d'effet de 5 uM de traitement de DOI sur les cellules SK-N-SH prolifération, ce qui suggère un effet sur la prolifération ne contribue pas à la observé effet neuroprotecteur.
La cellule d'analyse en temps réel permet de déterminer les secondes voies de messagerie sont associés à des effets neuroprotecteurs / neurotoxiques
L'activation du récepteur déclenche une cascade de seconds messagers effets. Le protocole actuel permet de dépister la participation d'un certain nombre de seconds messagers dans un effet neuroprotecteur / neurotoxiques en temps réel grâce à un prétraitement avec leurs inhibiteurs. Comme l'effet de seconds messagers inhibiteurs sur la survie des cellules peuvent être prononcées, et est dans de nombreux cas non linéaire avec le temps, à la suite de sa cinétique est très instructif. Figure 5 présente l'effet de 10 uM phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) inhibiteur LY294002 sur la survie des cellules et la neuroprotection DOI dans les cellules SK-N-SH dépourvu de sérum. Dans le graphique présenté, 10 uM LY294002 empêché l'effet neuroprotecteur de DOI à la privation de sérum, mais a également eu un certain effet toxique de son propre.
Voies de seconds messagers pertinentes et des concentrations d'inhibiteur pour chaque composé testé peuvent être déterminées par la recherche de la littérature. Les concentrations aptitude d'inhibiteurs deuxième messagers doit être vérifiée et, si nécessaire optimisé expérimentalement. Le but de l'optimisation est de choisir une concentration, ce qui a un effet minime sur les valeurs de l'indice de la cellule par elle-même, tout en inhibant efficacement le second messager respectif. A titre d'exemple, quelques secondes inhibiteurs de voies de messager, qui peuvent présenter un intérêt pour le récepteur 5-HT 2A, sont présentés dans le tableau 1 Ces inhibiteurs ont déjà été utilisés pour évaluer les cibles en aval impliqués dans sérotoninergique augmentation du posteracellular signal-regulated kinase phosphorylation 9. Nous avons démontré l'utilité d'évaluer les voies en aval impliqués dans la neuroprotection par la 5-HT des agonistes des récepteurs de la figure 2A après avoir vérifié et, dans certains cas, pour l'optimisation de leurs concentrations notre paradigme expérimental 7.
Figure 1: Schéma de principe du flux de travail présenté dans le protocole actuel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Effet de la privation de sérum sur l'indice de la cellule. Privation de sérum (ligne rouge) induit une diminution rapide de l'indice cellulaire, comparativement à l'augmentation progressive des cellules valeurs de l'indice en milieu de prolifération (ligne verte). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Effet de la 5-HT 2A agonistes de l'indice cellulaire après une privation de sérum. Traitement avec des médicaments cytoprotecteurs (Dans cette expérience, agonistes 5-HT 2A DOI (5 uM) (A) (ligne magenta) et le lisuride (20 uM) (B ) (ligne magenta foncé) rétablit partiellement valeurs de l'indice cellulaire diminué par la privation de sérum (ligne rouge). S'il vous plaît cliquerici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 cellulaires valeurs de l'indice au cours de la prolifération cellulaire. Traitement avec des médicaments en milieu de prolifération (dans le courant expérience 5 uM DOI) (ligne magenta) permet d'évaluer l'effet sur la prolifération par rapport au traitement du véhicule (ligne verte). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
5. inhibiteurs de seconds messagers figure peuvent affecter la survie des cellules sur leur propre et peut être utilisé pour le dépistage de l'effet de la seconde piste de messagerie sur obseneuroprotection rved. Dans cette expérience, les cellules ont été soumis à la privation de sérum traité par véhicule (ligne rouge), 1 uM DOI (ligne magenta), prétraitée avec 10 uM PI3-K inhibiteur LY294002 et traitée avec 1 uM DOI (ligne bleue) ou prétraité avec 10 uM LY294002 et traités avec le véhicule (ligne noire). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: Exemples d'inhibiteurs de second messager, qui peut présenter un intérêt pour des récepteurs 5-HT 2A voies en aval et leurs concentrations utilisées par nous dans les expériences en temps réel de l'analyseur de la cellule.
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Discussion
Le protocole actuel présente l'utilité d'une cellule d'analyse en temps réel pour évaluer de façon continue et dans des conditions sans étiquette / les effets neuroprotecteurs des composés neurotoxiques dans des lignées cellulaires neuronales et pour mieux comprendre les secondes voies de messagers impliqués dans l'effet.
Même si l'utilité du temps réel analyseur de cellules pour étudier la cytotoxicité et les effets des médicaments sur la prolifération cellulaire est généralement reconnu, seules quelques études ont utilisé dans différents types cellulaires neuronales connexes. Nous avons précédemment montré l'utilité de la cellule d'analyse en temps réel pour surveiller la neuroprotection d'un agoniste du récepteur 5-HT2A dans des cellules SK-N-SH neuroblastome humain, tandis que Galante et al. Ont montré qu'il peut être utilisé pour évaluer la neurotoxicité de les peptides de bêta-amyloïde dans le neuroblastome humain SH-SY5Y 7,10. Une étude récente a suggéré que, bien que la cellule d'analyse en temps réel mesuré de manière fiable cellule prolifération et la mort cellulaire dans uneuronal lignée cellulaire et les cellules précurseurs neuronales, la précision dans l'évaluation de la mort cellulaire dans les neurones primaires dépendent de la sévérité de l'agression 5. Fait important, le courant alternatif utilisé pour le système d'analyse de cellules en temps réel est de très faible amplitude, générant des courants microampères. Ces courants sont bien en dessous du potentiel de seuil de cellules excitables comme les neurones. Le système d'analyse de cellules en temps réel repose sur des mesures d'impédance à partir de la surface inférieure de la plaque 96 E-puits, par conséquent, le degré d'adhérence de la cellule est d'une importance critique. Il est possible que l'optimisation du revêtement des puits E-plaque avec des protéines de la matrice extracellulaire pour améliorer l'adhérence peut améliorer les résultats obtenus avec les neurones primaires.
Le manuscrit actuelle démontre une nouvelle approche de l'utilisation du système d'analyse de cellules en temps réel pour délimiter des voies de messagers secondaires impliqués dans la neuroprotection. Notre protocole repose sur l'inhibition chimique de deuxième messedoigts que l'on suppose être associées à l'action d'un agent neuroprotecteur. Le tableau 1 énumère quelques secondes inhibiteurs couramment utilisés de voies de messager, qui peuvent présenter un intérêt pour le récepteur 5-HT 2A, par exemple, et leurs concentrations appropriées pour le paradigme expérimental présenté. Cette conception expérimentale permet pour le dépistage rapide de la seconde piste de messagerie potentiellement pertinents, pour sélectionner des cibles en aval pour des études plus détaillées grâce à des approches complémentaires.
Un avantage important de la cellule d'analyse en temps réel est également la capacité d'évaluer si un effet sur la prolifération est une partie d'un effet neuroprotecteur observé. En utilisant des lignes de cellules neuronales au lieu de neurones primaires dans les essais de toxicité offre certains avantages, comme un moindre coût, un accès facile et pas besoin de l'expérimentation animale. Toutefois, en raison du fait que les lignées de cellules neuronales, par opposition aux neurones primaires prolifèrent, l'effet potentiel sur la prolifération doit être contrôlé pour enessais de neurotoxicité. La possibilité de la cellule d'analyse en temps réel propose d'effectuer ce contrôle de la même plaque expérimentale E-96, facilite la conception expérimentale.
Plusieurs paramètres techniques doivent être envisagées dans des expériences avec la cellule d'analyse en temps réel. Le nombre de cellules à être plaqué par puits devrait être déterminée de manière empirique par l'expérience de titrage pour chaque type cellulaire testé. Cytotoxicité et le traitement de la prolifération sont tous commencé après 24 h d'initiation de la culture de cellules, pour permettre la pleine adhésion des cellules. Des résultats optimaux dans les expériences de cytotoxicité à partir lorsque les cellules ont atteint 65-70% de confluence ont été obtenus dans le protocole actuel. Pour les expériences de prolifération inférieur confluence cellulaire est préférée (20-30%) à suivre l'effet d'un médicament sur une courbe de prolifération.
Dans le sérum de protocole actuel privation neurotoxicité paradigme est présenté en raison de sa robustesse, la facilité d'utilisation et l'utilité de rapprocherprivation trophique médiation mort neuronale, ce qui est important au cours du développement, le cerveau aiguë ou traumatisme nerveux, et la neurodégénérescence 11. Cependant, un grand nombre de paradigmes de neurotoxicité peut être utilisé avec le système d'analyse de cellules en temps réel. Ici, le co-traitement avec un agent cytoprotecteur au moment de la cytotoxicité est présenté. Toutefois, le prétraitement ou le traitement après l'(récupération des cellules évaluation) événement toxiques peuvent également être utilisés en fonction des composés mis à l'essai.
Dans l'ensemble, le protocole actuel suggère l'utilité d'un système d'analyse de cellules en temps réel pour évaluer la neurotoxicité et une neuroprotection dans des lignées de cellules neuronales en continu et sans marqueur et pour mieux comprendre les voies en aval participant à ces effets.
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Disclosures
Les frais de publication de la vidéo-article en cours ont été parrainés par "ACEA Biosciences".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
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