Abstract
Viele Gehirn-bedingten Erkrankungen haben den Zelltod in ihrer Pathophysiologie beteiligt. In-vitro-Modellen verbessert, um neuroprotektive oder neurotoxischen Wirkungen von Drogen-und nachgelagerten Wegen beteiligt würde helfen, einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Neuroprotektion / Neurotoxizität und Wirkstoffentwicklung könnte potenziell zu erleichtern studieren. Allerdings haben viele der vorhandenen In-vitro-Toxizitätstests wesentliche Einschränkungen - die meisten Neurotoxizität und Neuroprotektion beurteilen an einem einzigen Zeitpunkt, ohne dass sich die Zeit-Verlauf und die Kinetik der Wirkung zu beobachten. Darüber hinaus würde die Möglichkeit, Informationen über nachgeschaltete Signalwege bei der Neuroprotektion in Echtzeit beteiligt sammeln von großer Bedeutung sein. In der aktuellen Protokoll beschreiben wir die Verwendung einer Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse neuroprotektive Effekte von Serotonin 2A (5-HT 2A)-Rezeptor-Agonisten in einer neuronalen Zelllinie unter markierungsfreie Echtzeit-Condit bestimmenIonen unter Verwendung von Impedanzmessungen. Weiterhin zeigen wir, dass Inhibitoren der Second-Messenger-Pfade können verwendet werden, um Moleküle der in der neuroprotektiven Wirkung beteiligt abzugrenzen. Wir beschreiben auch die Nützlichkeit dieser Technik zur Bestimmung, ob eine Wirkung auf die Zellproliferation trägt zu einer beobachteten neuroprotektive Wirkung. Das System nutzt spezielle mikroPlatten als E-Platten, die alternierend Gold enthalten Mikroelektrodenarrays an der Bodenfläche der Vertiefungen als Zell-Sensoren dienen bezeichnet. Die Impedanz wird durch Auslesen der Anzahl der anhaftenden Zellen, Zelllebensfähigkeit, Morphologie und Adhäsion modifiziert. Ein dimensionsloser Parameter genannt Zellenindex wird aus den elektrischen Impedanzmessungen abgeleitet und wird verwendet, um den Zellstatus repräsentieren. Insgesamt ermöglicht die Echtzeit-Impedanz-basierten Zell-Analysator für Echtzeit-, markierungsfreie Beurteilung der Neuroprotektion und Neurotoxizität, und die Bewertung der zweiten Messenger-Pfade Beteiligung, einen Beitrag zu mehrdetaillierte und hohem Durchsatz Beurteilung potenzieller neuroprotektive Verbindungen in vitro, zum Auswählen therapeutischen Kandidaten.
Introduction
Neuronale Zelltod spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von zahlreichen Gehirn 1-bedingten Erkrankungen. Die Verfügbarkeit von zuverlässigen und Hochdurchsatz in vitro Toxizitätstests ist entscheidend, um einen besseren Einblick in die Mechanismen der Neurotoxizität zu gewinnen und zu helfen, wählen Sie neuroprotektive Moleküle als therapeutische Kandidaten in der Medikamentenentwicklung 2. Allerdings gibt es viele Einschränkungen am häufigsten in vitro Neurotoxizität assays.They verwendet beurteilen Neurotoxizität / Neuroprotektion zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt nicht erlaubt kinetische Auflösung; oft Etikett oder Sonde, die mit den Signalwegen stören können und weitere Studien in der gleichen Zellpopulation zu begrenzen, und sind oft arbeitsintensiv, und in vielen Fällen nicht bieten Einblick in den Mechanismus. In der vorliegenden Studie zeigen wir, den Nutzen eines Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse zu Neurotoxizität und Neuroprotektion in einer neuronalen Zelllinie in Echtzeit und unter bestimmen markierungsfreieBedingungen und um einen Einblick in nachgeschalteten Mechanismen, durch Analyse der sekundären Botenwege in der Wirkung beteiligt ist.
Frühere Studien haben die Wirksamkeit der Echtzeit-Zellanalyse bestätigt Zytotoxizität sowie Effekte auf die Zellproliferation in Zelllinien im Vergleich zu Standardtechniken 3,4,5,6 bestimmen. Zum Beispiel wurde eine gute Korrelation zwischen den Ablesungen der Standardzelle Lebensfähigkeit WST-1-Assay und Zellindexwerte zu verschiedenen Zeitpunkten unter basalen Bedingungen und Proliferation nach zwei verschiedenen toxischen Paradigmen in HeLa-Zellen 3 beobachtet. A549 und MDA-MB-231-Zellen-Proliferation und Zytotoxizität der Mikrotubuli-Stabilisator Paclitaxel provoziert zeigten sehr ähnliche Werte, wenn sie von Zellenindex-Messungen bewertet und zur standard Sulforhodamin B (SRB) Test 4. In der neuronalen Zelllinie verewigt Neuronen im Hippocampus wurden HT-22 Zellindex-Messungen für ihre Fähigkeit t validierto detect Zellproliferation, Glutamat-Cytotoxizität und Zellschutz gegen die verbreiteten 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Assay 5. In der gleichen Studie die MTT-Test Ergebnisse und Zellindex-Messungen auch gut in der Messung der neuronalen Vorläuferzellen Proliferation, Zytotoxizität nach Wachstumsfaktoren Not und Rettung der Zytotoxizität von der Pan-Caspase-Inhibitor QVD 5 korreliert. Zytotoxizität in NIH 3T3-Zellen durch Vandetanib (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor und den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) induziert zeigte mit Zellenindex-Werte oder Neutralrot-Aufnahmetest gemessen 6 ähnliche Ergebnisse.
Wir haben vor kurzem verwendet das Echtzeit-Zellanalysesystems neuroprotektiven Wirkungen des Serotonin-2A beurteilen (5-HT 2A)-Rezeptor-Agonisten (±) -2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine Hydrochlorid (DOI) in einer neuronalen Zelllinie ( SK-N-SH-Zellen) und für die Einbeziehung seco gescreentnd messenger Wege durch Überwachen der Wirkung der chemischen Hemmung der beobachteten Neuroprotektion 7. Interessanterweise hat der 5-HT 2A-Rezeptor sowohl halluzinogene und nonhallucinogenic Agonisten (wie DOI und Lisurid, beziehungsweise), die sowohl gemeinsame als auch unterschiedliche Second-Messenger-Signalwege aktivieren kann 8.
Die Vorteile der vorgestellten Technik sind, dass sie es ermöglicht, Informationen in Echtzeit auf das Überleben der Zellen im Laufe der Tage zu sammeln, zu beschreiben zweiten Botenwegen beteiligt, um den möglichen Beitrag der Proliferation Effekte auf die Neuroprotektion zu bewerten und eine optimale Zeit wählen für zusätzliche Endpunktstudien auf der gleichen Zellpopulation. Eine schematische Darstellung des Arbeitsablaufs in der Protokoll ist in 1 dargestellt.
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Protocol
1. Vorbereitung
- Zeigen Station des Echtzeit-Zellanalysegeräts in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. Führen Sie alle Zellkultur Handhabung und pharmakologische Behandlungen in einer Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen.
- HINWEIS: Neuronale Zelllinien im Vergleich zu Standardbedingungen für die Kultur, die unterschiedliche Temperatureinstellungen, sollte entsprechend angepasst werden. Für schwach adhärenten Zelllinien verwenden Überzugsmittel, um die Wechselwirkung von Zellen mit der Goldmikroelektroden in den Boden der Vertiefungen der E-Platte 96 zu erleichtern.
- Bereiten 1,000X Stammlösungen der pharmakologischen Verbindungen für die Zellkultur-Behandlung (neuroprotektive Mittel oder Second-Messenger-Wege-Inhibitoren in dem entsprechenden Lösungsmittel - Dimethylsulfoxid oder sterilem Wasser) und im Kühlschrank bei -20 ° C. Verwenden Sie in den folgenden Behandlungen das Lösungsmittel als Fahrzeug.
- Kultur menschlicher Neuroblastomzellen SK-N-SH-Zellen in DMEM / F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Proliferationsmedium) in Zellkulturflaschen, ergänzt mit 175 cm 2 Oberfläche, um die Dichte von ca. 75%. Halten Zellpassage Zahl in einem Bereich (von etwa 10 Passagen), um die Konsistenz zwischen den Experimenten in Bezug auf Zellproliferationsrate und das Ansprechen auf die Zytotoxizität zu bestimmen. Niedergang Nummern werden bevorzugt.
- Mit PBS waschen Die adhärenten SK-N-SH-Zellschicht und trypsinize mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. Zentrifugation der Zellen bei 170 × g für 5 min auf Trypsin zu entfernen. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Medium Proliferation. Zählen Sie die Zellen mit Scepter Zellzähler und stellen Sie die Zellzahl auf 300.000 Zellen / ml durch Verdünnung Zellen mit Proliferationsmedium.
2. Überzug und die Proliferation von SK-N-SH-Zellen
- 100 l Proliferationsmedium in jede Vertiefung der E-Plate 96 und lassen Sie es für 30 Minuten in der Gewebekultur Haube bei RT ins Gleichgewicht. Legen Sie die E-PlaTE 96 in der Echtzeit-Zellanalysestation in dem CO 2-Inkubator bei 37 ° C aufweist.
- Starten des Echtzeit-Zellanalysesoftware. Auf der Seite Layout auswählen die Brunnen im Experiment enthalten und geben Sie in die Eingabefelder die Informationen über Zelltyp, Zellzahl, Namen und Konzentrationen von chemischen Verbindungen für die Zellbehandlung eingesetzt.
HINWEIS: Für die Zwecke dieses Protokolls mindestens 4 Wiederholungsversuche für jede Behandlung empfohlen. - Auf dem Spielplan Software Seite bestimmen "Steps" enthalten in dem Experiment, indem Sie die Anzahl der Durchläufe Messzelle Index und das Intervall zwischen den Durchläufen für jeden Schritt. Seit Schritt 1 ist für die Hintergrundmessung vorgegeben, wählen Sie "einen Schritt" und stellen Sie Schritt 2, um die Zelle Index alle 15 min für 96 Stunden messen.
HINWEIS: Für Behandlungen, in denen Effekte mit schnellen Kinetik zu erwarten sind, eingestellt Sweeps in kürzeren Abständen. - Klicken Sie auf Start, um die automatisch vorgegebenen Schritt einzuleiten 1und messen Sie den Hintergrund Impedanz der Medien. Dieser Wert wird automatisch durch die Software an jedem Datenpunkt abgezogen, sobald die Zellen in die Vertiefungen gegeben.
- Verwenden Sie den zuvor in Schritt 1.5) hergestellten Zellsuspension von 300.000 Zellen / ml in Proliferationsmedium. 30.000 Zellen / Well für die Zelltoxizität / Neuroprotektion Studien und 15.000 Zellen / Well für die Zellproliferation Studien. Nehmen Sie die E-Plate und 100 l Zellsuspension pro Well für die Zelltoxizität / Neuroprotektion Studien und 50 ul Zellsuspension und 50 ul Proliferationsmedium pro Vertiefung für die Zellproliferation Studien. Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung plattiert muss für jede Zelllinie empirisch optimiert werden.
- Vorsichtig schwenken, die E-Plate 96 für noch Plattierung der Zellen. Verlassen Sie die E-Plate 96 für 30 min in der Gewebekultur Haube bei RT, damit sich die Zellen absetzen gleichmäßig auf den Boden der Vertiefungen.
- Legen Sie die E-Platte 96 in der Echtzeit-Zellanalysestation und starten Sie Schritt 2 auf dem Spielplan S.Alter. Überwachungszelle Indexwerte während des Experiments, indem Sie die Zelle Kurven auf der Profilseite und der Ausgangszell Index-Daten auf dem Handy Index Seite der Software.
3. Serumentzug
- 24 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen, Pause das Experiment, und entfernen Sie die E-Plate 96 von der Echtzeit-Zellanalysestation. Verdünnen second messenger-Inhibitoren aus 1,000X Aktien mit DMEM / F12 Serum-freien Medium - bis 200 × Endkonzentration. Gönnen Zellen mit 1 ul Inhibitoren der zweiten Botenwege, um für ihre Beteiligung an der Neurotoxizität / Neuroprotektion 30 min vor Beginn der Zytotoxizität getestet werden, um die jeweiligen Signalwege hemmen. Bringen Sie die E-Plate 96 bis zum Bahnhof und wieder experimentelle Zellindex-Messungen.
- Nach 30 Minuten Pause, das Experiment wieder. Proliferationsmedium sorgfältig vollständig zu entfernen aus der E-Plate 96 Brunnen mit einer Pipette (oder Multi-Kanal-Pipette), kümmert sich nicht um die adhärenten Zellschicht störenindem der Rand der Pipettenspitze an der Ecke des Bohrloches. Nach Zugabe von 200 ul / Vertiefung serumfreies DMEM / F12-Medium (Medium Serumentzug). Sicherzustellen, schnellen Austausch von Zellkulturmedium zur mechanischen Bewegung der Zellen zu minimieren.
- Verdünnen Verbindungen auf ihre neuroprotektive Wirkung von 1,000X Lager mit Serum-freiem DMEM / F12-Medium und 200 × Endkonzentration getestet werden. 1 ul Verbindungen auf ihre neuroprotektive Wirkung und 1 ul Inhibitoren der Second-Messenger-Pfade in den einzelnen Vertiefungen nach dem Versuchsplan getestet werden.
- In Zellen, die für die Proliferation Studien Medium nicht zu ändern. Verdünnen Verbindungen von 1,000X Lager auf 200 × Endkonzentration in Proliferationsmedium getestet werden, behandeln mit 1 ul pro Well und weiter zu Kultur in Proliferationsmedium.
- Wieder aufnehmen, das Experiment mit Zellindex-Messungen alle 15 min für 96 Stunden weiter wie vorher eingestellt wurde.
4. Daten Analyse
- Für Neurotoxizität / Neuroprotektion Daten normalisieren Zell Index bis zum letzten Zeitpunkt vor pharmakologische Behandlung oder mittlere Veränderung der Variation zwischen den Experimenten durch Auswahl von "normalisierten Zell Index" auf der Profilseite zu reduzieren und "normalisieren Zeit".
- Markieren Sie die Brunnen auf dem Grundstück Seite für den Versuchsbedingungen von Interesse und klicken Sie auf "Hinzufügen", um die normierten Zell Index-Kurven zeichnen. Beobachten der Kinetik der neurotoxischen / neuroprotektive Wirkung oder der zweiten Boten-Hemmung als normierte Zellenindex-Kurven als eine Funktion der Zeit.
- Beachten Sie die Zellenindex-Kurven für die getesteten medikamentöse Behandlungen in Proliferationsmedium als Funktion der Zeit zu beurteilen, ob ein Effekt auf die Proliferation in der neuroprotektive / neurotoxische Wirkung beteiligt.
- Exportieren Sie die Informationen für alle experimentellen Zell Index Zeitpunkten aus der Zelle Index Software Seite in eine Excel-Datei, um die statistische Auswertung der Ergebnisse zu initiieren
- Für die statistische Analyse der Unterschiede in der Zellindexwerte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten, markieren Sie die Zelle Indexwerte an den jeweiligen Zeitpunkten aus der exportierten Excel-Datei. Analysieren Sie die Handy-Index-Werte für die ausgewählten Zeitpunkten mit One-Way-oder Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einer post-hoc-Test unter Verwendung statistischer Software.
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Representative Results
Serumentzug führt zu einer Zellenindex-Werte, die ständig mit dem Echtzeit-Zellanalysegerät überwacht werden kann, zu verringern
Neuro Stimuli zu den Zellen zu einer Abnahme in der Zell-Index-Werte, die in Echtzeit mit den vorgestellte Technik und die Dynamik der abhängig ist von der spezifischen neuro Stimulus und dem Zelltyp sucht überwacht werden können. Abbildung 2 zeigt die Zunahme der Zell Index bei SK-N-SH-Zellen in Proliferationsmedium bis zu einer Hochebene (grüne Linie) und den Abfall der Zell Index, gefolgt von einer Stabilisierung auf den neuen unteren Ebenen nach dem Einschalten die Zellen Entzug Medium (rote Linie) Serum gezüchtet. Dieser Rückgang kann eine Veränderung in der zellulären Adhäsion durch den Entzug des Serums zu vertreten.
Neuroprotektive Wirkung der Arzneimittelbehandlung kann kontinuierlich mit dem Echtzeit-Zellanalysegerät überwacht werden,
"> Die neuroprotektive Wirkung von Verbindungen vor (Vorbehandlung) gegeben, gleichzeitig (Co-Behandlung) oder nach neuro Stimulus (hindeutet Zellgewinnung) kann auch kontinuierlich mit dem Echtzeit-Zellanalyse gefolgt werden, wodurch Informationen über . die Rate und Dauer der neuroprotektiven Wirkung Figur 3 zeigt repräsentative Ergebnisse von der Dynamik der Neuroprotektion von zwei 5-HT 2A-Agonisten - 5 uM DOI (3A) und 20 uM Lisurid (3B) zum Zeitpunkt des Schaltens in die Zellen aufgenommen Serumentzug Medium.Die Echtzeit-Zellanalyse ermöglicht zwischen Wirkungen auf das Zellüberleben und Proliferation differen
Eine wichtige Frage bei der Neuroprotektion Studien in neuronalen Zelllinien ist, ob ein Effekt auf die Zellproliferation trägt zu der beobachteten Wirkung auf die Zellverbindung Überleben. Mit der Echtzeit-Zelle analYzer die Wirkung auf die Proliferation kann in der gleichen E-Platte getestet werden 96 Beurteilung Neurotoxizität. 4 zeigt das Fehlen einer Wirkung von 5 uM DOI Behandlung auf SK-N-SH-Zellen-Proliferation, was auf eine Wirkung auf die Proliferation nicht zu dem beobachteten beitragen neuroprotektive Wirkung.
Die Echtzeit-Zellanalyse ermöglicht zu bestimmen, welche second messenger Wege sind in neuroprotektive / neurotoxischen Wirkungen beteiligt
Rezeptor-Aktivierung löst eine Kaskade von Botenstoffe Wirkungen. Das aktuelle Protokoll ermöglicht es, für die Einbeziehung einer Reihe von Botenstoffe in einer neuroprotektiven / neurotoxische Wirkung in Echtzeit durch eine Vorbehandlung mit deren Inhibitoren zu screenen. Da die Wirkung der zweiten Boten-Inhibitoren auf das Zellüberleben ausgesprochen werden kann, und ist in vielen Fällen nicht mit der Zeit linear ist, nach ihrer Kinetik sehr informativ. Figur 5 zeigt die Wirkung von 10 uM phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3-K)-Inhibitor LY294002 auf das Zellüberleben und DOI Neuroprotektion in Serum entzogen SK-N-SH-Zellen. Im dargestellten Diagramm, dass 10 uM LY294002 die neuroprotektive Wirkung der DOI in Serumentzug, sondern auch eine gewisse toxische Wirkung seines Eigen hatte.
Relevante zweiten Messenger-Pfade und Inhibitorkonzentrationen für jede getestete Verbindung kann durch Literaturrecherche ermittelt werden. Konzentrationen Eignung der Botenstoffe Inhibitoren überprüft werden, und bei Bedarf experimentell optimiert. Das Ziel der Optimierung ist es, eine Konzentration, die eine minimale Wirkung auf die Zellindexwerte von selbst aus, während immer noch effektiv Hemmung des jeweiligen zweiten Messenger. Als ein Beispiel, einige zweite Messenger-Pfade Inhibitoren, die für die 5-HT 2A-Rezeptor sein kann, sind in Tabelle 1 dargestellt Diese Inhibitoren sind zuvor verwendet worden, um nachgeschalteten Targets in serotonergen Erhöhung der ext beteiligt beurteilenracellular signal-regulated kinase Phosphorylierung 9. Wir haben ihre Nützlichkeit gezeigt nachgeschalteten Wege bei der Neuroprotektion durch 5-HT 2A-Rezeptoragonisten involviert nachdem bestätigt und in einigen Fällen die Optimierung ihrer Konzentrationen für unsere experimentellen Paradigma 7 zu bewerten.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Workflows in der aktuellen Protokoll vorgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Wirkung von Serumentzug auf Handy-Index. Serumentzug (rote Linie) induziert eine schnelle Abnahme der Zell Index im Vergleich zum allmählichen Anstieg der Zell Index-Werte in Proliferationsmedium (grüne Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Wirkung von 5-HT 2A-Agonisten auf Zell Index nach Serumentzug. Behandlung mit zellschützende Medikamente (in diesem Experiment 5-HT 2A-Agonisten DOI (5 uM) (A) (magenta Linie) und Lisurid (20 uM) (B ) (dunkelmagentafarbene Linie) Zellindexwerte von Serumentzug (rote Linie) sank teilweise wieder her. Bitte klickenSie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Zellindexwerte im Verlauf der Zellproliferation. Behandlung mit Medikamenten in Proliferationsmedium (im aktuellen Experiment 5 uM DOI) (magentafarbene Linie) ermöglicht es, die Wirkung auf die Proliferation zu bewerten im Vergleich zu Vehikel-Behandlung (grüne Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Second-Messenger-Hemmer können das Überleben der Zelle auf ihre eigenen beeinträchtigen und zum Bildschirm für die Wirkung von sekundären Botenwege auf Obse verwendet werdenrved Neuroprotektion. In diesem Versuch wurden die Zellen in Serumentzug unterzogen, die mit Fahrzeug (rote Linie), 1 uM DOI (magentafarbene Linie) behandelt, mit 10 uM PI3-K-Inhibitor LY294002 vorbehandelt und mit 1 uM DOI (blaue Linie) oder vorbehandelt behandelt mit 10 uM LY294002 und mit Fahrzeug (schwarze Linie) behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Beispiele für zweite Messenger-Inhibitoren, die für die 5-HT 2A-Rezeptor nachgeschalteten Wege und ihre Konzentrationen von uns in Echtzeit Zellanalysator Experimenten verwendet relevant sein können.
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Discussion
Das aktuelle Protokoll stellt den Nutzen eines Echtzeit-Zellanalyse kontinuierlich und unter Label-freien Bedingungen bewerten die neuroprotektive / neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen in neuronalen Zelllinien und einen Einblick in die Second-Messenger-Signalwege in der Wirkung beteiligt zu gewinnen.
Obwohl Dienstprogramm des Echtzeit-Zellanalysegerät zur Zytotoxizität und Wirkungen von Arzneimitteln auf die Zellproliferation zu untersuchen ist allgemein bekannt, haben nur wenige Studien in neuronalen verwandte Zelltypen verwendet. Wir haben zuvor die Nützlichkeit der Echtzeit-Zellanalyseneuroprotektion eines 5-HT 2A-Rezeptor-Agonist in menschlichen Neuroblastom-SK-N-SH-Zellen Monitor angezeigt, während Galante et al. Haben gezeigt, es kann verwendet werden, um die Neurotoxizität von beurteilen Beta-Amyloid-Peptide in humanen Neuroblastom-Zellen SH-SY5Y 7,10. Eine neuere Studie hat vorgeschlagen, daß, während die Echtzeit-Zellanalysegerät zuverlässig Zellproliferation und Zelltod in einemeuronal Zelllinie und neuronaler Vorläuferzellen, ihre Genauigkeit bei der Beurteilung Zelltod in primären Neuronen abhängig von der Schwere der Insult 5. Wichtig ist, dass eine sehr geringe Größe der Wechselstrom für die Echtzeit-Zellanalysesystem verwendet wird, Erzeugen Mikroampere Strom. Diese Ströme sind weit unterhalb der Schwellenspannung der erregbaren Zellen, wie Neuronen. Die Echtzeit-Zellanalysesystem beruht auf Impedanzmessungen von der Bodenfläche der E-Platte mit 96 Vertiefungen, also der Grad der Zellhaftung von entscheidender Bedeutung ist. Es ist möglich, dass weitere Optimierung der Beschichtung der E-Plattenvertiefungen mit extrazellulären Matrixproteinen für bessere Haftung können die Ergebnisse mit primären Neuronen erhalten verbessern.
Die aktuelle Manuskript zeigt einen neuartigen Ansatz für die Verwendung der Echtzeit-Zellanalysesystems zweiten Messenger-Pfade in der Neuroprotektion beteiligt abzugrenzen. Unser Protokoll stützt sich auf die chemische Hemmung der zweiten messeFinger Hypothese in der Wirkung einer neuroprotektiven Agens beteiligt ist. Tabelle 1 listet einige häufig verwendete zweite Messenger-Pfade Inhibitoren, die für die 5-HT 2A-Rezeptor als ein Beispiel sein kann, und ihre Konzentrationen für die präsentierten experimentellen Paradigma. Das Versuchsdesign ermöglicht schnelle Screening von potentiell relevanten sekundären Botenwege, an nachgeschaltete Ziele für genauere Untersuchungen durch komplementäre Ansätze zu wählen.
Ein wichtiger Vorteil der Echtzeit-Zellanalyse ist auch die Fähigkeit, zu beurteilen, ob eine Wirkung auf die Proliferation ist ein Teil einer neuroprotektiven Wirkung beobachtet. Mit neuronalen Zelllinien statt primären Neuronen in Toxizitätstests bietet einige Vorteile, wie geringere Kosten, einfachen Zugang und keine Notwendigkeit für Tierversuche. Aufgrund der Tatsache, dass die neuronalen Zelllinien, im Gegensatz zu primären Neuronen vermehren mögliche Wirkung auf die Proliferation muss jedoch in steuert werdenNeuro Assays. Die Möglichkeit, die Echtzeit-Zellanalyse bietet diese Steuerung in der gleichen Versuchs E-Platte 96 durchzuführen, ermöglicht die Versuchsanordnung.
Mehrere technische Parameter müssen in Experimenten mit dem Echtzeit-Zellanalysegerät betrachtet werden. Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung plattiert werden sollten empirisch durch Titrierung Experiment für jeden getesteten Zelltyp bestimmt werden. Zytotoxizität und Proliferation der Behandlung wurden alle nach 24 h nach Beginn der Zellkultur gestartet, die volle Haftung der Zellen zu ermöglichen. Optimale Ergebnisse in Zytotoxizität Experimente ab, wenn die Zellen erreicht haben 65-70% Konfluenz wurden in der aktuellen Protokoll erhalten. Für Proliferationsexperimente unteren Zellkonfluenz ist bevorzugt (20-30%), um die Wirkung eines Arzneistoffs auf die Proliferation Kurve folgen.
In der aktuellen Protokoll Serumentzug Neurotoxizität Paradigma aufgrund seiner Robustheit vorgestellt, um die Benutzerfreundlichkeit und Gebrauchsnäherntrophische Entzug vermittelten neuronalen Tod, der während der Entwicklung, akute Gehirn oder Nerven Trauma und Neurodegeneration 11 wichtig ist. Allerdings kann eine breite Palette von Neurotoxizität Paradigmen mit der Echtzeit-Zellanalysesystem verwendet werden. Hier Co-Behandlung mit Zellschutzmittel bei der Zytotoxizität wird vorgestellt. Jedoch kann die Vorbehandlung oder Behandlung nach der toxischen Ereignis (Beurteilung Zellgewinnung) auch abhängig von den zu testenden Verbindungen verwendet werden.
Insgesamt ist die aktuelle Protokoll legt nahe, den Nutzen eines Echtzeit-Zellanalysesystem zur Neurotoxizität und Neuroprotektion in neuronalen Zelllinien kontinuierlich und markierungsfreie bewerten und Einblick in nachgeschalteten Signalwege in diesen Effekten beteiligt zu gewinnen.
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Disclosures
Publikationskosten für den aktuellen Video-Artikel wurden von "ACEA Biosciences" gesponsert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
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