Abstract
세포 - 세포 부착은 다세포 생물에 기초하고 세포 표면 단백질의 다양한 어레이에 의해 매개된다. 그러나, 이러한 단백질의 많은 접착제의 상호 작용이 불완전하게 이해된다. 여기서 우리는 추정 homophilic 세포 접착 분자의 접착력을 특성화하기위한 간단한 신속한 방법을 제시한다. 배양 된 HEK293 세포를 DNA 플라스미드가 세포 표면 단백질의 분비, 에피토프 태그가 ectodomain를 코딩 형질된다. 에피토프 태그에 특이 기능화 된 비드를 사용하여, 용해, 분비 된 융합 단백질은 배양 배지에서 캡처된다. 코팅 된 비드를 다음 homophilic 밀착성 테스트 분석법 정렬 비드 응집 분석법 또는 형광 비드에 직접 사용할 수있다. 경우에 따라, 돌연변이는 접착에 필요한 특정 아미노산 또는 도메인을 규명하는데 사용될 수있다. 이 분석은 안정한 세포주의 생산을 요구하지 않는, 발현 된 단백질의 소량 만이 필요하며, 수 ACCO사일에 mplished.
Introduction
세포 - 세포 부착은 다세포 생물의 발달 및 무결성에 필수적인 세포 표면 분자의 다양한 어레이에 의해 매개된다. 많은 사람들이 발견되고 남아 있지만이 부착 분자의 대부분은 식별 및 특성화되었다. 여러 가지 방법은 원자력 현미경과 표면력 분광법 9-12 같은 세포 정렬 분석, 세포 응집 분석법 1-8 및 생물 물리학 적 방법을 포함하여 세포 접착 분자의 특성 (캠), 조사하는데 사용된다.
심지어 세포주를 사용하여 시험 관내 시스템에서의 간략화 복잡성 어려운 추정 CAM의 점착 특성을 측정 할 수있다. 일반적으로, 분자는 비 - 접착 성 세포주에 형질 감염 될 때이 세포 응집을 유도하는 경우 CAM 여겨진다. 그러나,이 접착 활성의 직접적인 증거가없는 것이 분명하다. 예를 들어, 셀의 표면 안정성 또는 전달을 용이CAM도 증가 세포 집계 1,13 될 것입니다. 또한, CAM은 진정한 세포주 세포 표면 배달 또는 안정화에 필요한 다른 공동 인자가없는 경우 세포 응집을 매개하지 못할 수도있다.
이러한 복잡한 요인을 피하기 위해, 아이디어를 기반으로보다 직접적인 분석법 사용될 수 접착제 상호 작용은 세포 외 도메인의 본질적인 생화학 등록해야한다고. 비드가 처음 잉-2 CAM을 특성화하는 데 사용되는 동안, 이러한 분석법은 헤린 매개 12,14,15 밀착성을 조사하기 위해 확장되었다. C-cadherin의 ectodomain-FC 융합의 융합을 사용하여 Gumbiner 연구소는 여러 cadherin의 반복이 상호 작용 (14) homophilic에 기여하는 것으로 나타났다. 초파리로부터 protocadherins 1,15-18 Dscam 및 동종 형의 번호를 가지고 유사한 비드 응집 분석, E-카드 헤린 및 N-cadherin의 밀착성을 사용해도, 12,15 특징되었습니다
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Protocol
1 셀 제조 (주 -2 0)
- 분할 HEK293 세포 1 : - 80 %의 합류 (2~3일)와 0.05 % 트립신-EDTA 용액을 사용하여 5 60까지 5 % CO 2와 37 ° C에서 성장 미디어에서 부화. 각 조건의 경우, 2 × 100mm 요리에서 세포를 배양.
2 세포 형질 (1 일)
- 예컨대 리포 펙 타민 형질 감염과 같은 시약을 사용하여 플라스미드 인코딩 된 Fc 융합과 HEK293 세포를 형질 감염. 대등 한 형질 감염 효율을 초래할 다른 방법도 사용될 수있다.
- 24 시간 동안 인큐베이터 형질 세포를 돌려줍니다.
3 셀 전파 (2 일)
- 37 ° C에 소 태아 혈청 (-FBS)없이 예열 성장 미디어.
- 요리를 10 ㎖의 성장 미디어 -FBS으로 2 배 린스, 1 시간 동안 37 ° C 배양기로 요리를 반환합니다.
- 3 세척 총, 10 ml의 성장 미디어 -FBS와 문화 요리를 한 번 더 씻어.
- 인큐BATE 미디어를 수집하기 전에 FBS가없는 또 다른 48 시간 동안 37 ° C에서의 형질 HEK293 세포.
4 구슬 집계 (4 일)
- 배양 접시에서 미디어를 수집하려면, 세포 파편 펠릿 5 분 동안 500 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 스핀에 요리의 각 쌍에서 미디어를 전송할 수 있습니다.
- 30 ML의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터를 사용하여 원심 필터로 50 ML 원뿔 관에서 필터 미디어.
- 농축 배양 배지의 볼륨이 약 500 μL (약 15 분) 때까지 4,000 XG, 4 ° C에서 원심 필터를 스핀. 모든 문화 매체가 추가 농축 될 때까지 반복합니다.
- 자석에 얼음 각 샘플에 대한 1.5 ML microcentrifuge 관에서 버퍼를 바인딩 감기, 장소의 1 ml의 단백질 G 자석 구슬의 1.5 μl를 추가하고 버퍼를 제거합니다. 즉시 단백질 G 자석 구슬에 집중 배양 배지를 추가합니다.
- 2 시간 동안 4 ° C에서 튜브를 회전합니다.
- 경기 수자석에 에이스 튜브 및 용지를 제거합니다. 빨리 얼음 차가운 두 번 버퍼를 바인딩 1 ml에 구슬을 세척 한 다음 결합 완충액 300 μL에 구슬을 재현 탁.
- 분할이 튜브, 각 튜브에 150 μL로 구슬을 재현 탁하고 각각 "칼슘"와 "아니오 칼슘"조건을 200 mM의 염화칼슘이 200 mM의 EDTA의 1.5 μl를 추가합니다.
- 우울증에 전송 각 조건에서 100 ㎕를 잘 밀어 투과광 현미경 (그림 2)를 사용하여 현미경 사진을 수집합니다. 원하는 각 시점에서 각 실험에 대한보기의 다섯 분야에서 이미지를 수집합니다.
(5) 데이터 분석
- ImageJ에, 또는 비슷한 이미지 분석 소프트웨어, 파일 풀다운 메뉴에서 가져 오기 / 이미지 시퀀스 ...를 사용하여 오 영상 데이터 세트를 오픈 한 사용. 이러한 이미지 스택으로 열립니다.
- 이미지 / 등록 ... 대화 상자에서 내가 변경1.0 픽셀로 설정하고 픽셀 너비와 픽셀 높이에 마법사 단위.
- 이미지 풀다운 메뉴에서 조정 / 임계 값 ... 명령을 사용하여 이진하는 이미지를 변환합니다. 구슬 또는 구슬 집계에 기여하는 픽셀을 포함 할 수있는 임계 값을 설정하지만, 그 배경과 작은 입자를 제외합니다. 스택의 모든 이미지에 적용합니다.
- 설정 측정 대화 상자의 영역과 스택 위치 상자를 확인합니다.
- 풀다운 메뉴를 분석에 ... 입자를 분석하여 실행합니다. 이것은 그들의 크기 (면적) 및 그들에 식별 된 이미지를 포함한 식별 입자의 목록을 생성 할 것이다.
- 실험 및 실험 조건에 대해이 과정을 반복합니다.
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Representative Results
예를 들어 실험 된 Fc (NcadEC-FC)에 융합 N-cadherin의의 ectodomain 칼슘 의존 비드 집계를 보여줍니다 그림 2에 제시되어있다. 칼슘이없는 경우, 비드는 응집하는 경향이 거의 없거나 전혀 시간을 나타내고 (도 1a, C)와 골재 크기의 증가가 없다. 칼슘의 존재 하에서, 비드 골재 크기는 시간 (도 1B, C) 이상으로 증가함에 따라, NcadEC-FC 쇼 강력한 응집 코팅. 이 실험은 다섯 겹치지 분야에서 이미지로 이루어진 각각의 인스턴스로, 3 회 반복 하였다. 화소 영역에서의 입경은 오 필드의 각 집계 대해 결정 하였다. 이러한 데이터는 각 실험마다 포인트에 대한 평균 하였다. 세 실험으로부터의 데이터는 각 시점 (도 2c)에서의 측정 수단 및 표준 오차를 결정하기 위해 평균 하였다.
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비드 집계 분석에서 분비, 에피토프 태그 ectodomains의 그림 1을 사용. 신호 서열 (S), ectodomain가 전형적인 단일 패스 횡단 세포 부착 분자 (위)의 구성을 나타내는 (A) 회로도, 막 관통 도메인 (T) 및 세포 내 도메인 (ICD). ectodomain, 인간 IgG (아래). (B) 배양 세포로 형질의 Fc 영역에 융합되는 막 관통 및 세포 내 도메인이 결여 세그먼트의 분비 형태를 생성하기 ectomain-Fc 융합체가 발현되고 분비된다 이 캡처 단백질 또는 단백질 G 자성 비드에 정제 할 수 배지. 단백질 또는 단백질 G가 구슬에 검은 색 원으로 표시됩니다. (C) 세척 한 후, ectodomain-FC 코팅 자석 구슬은 homophilic 접착제의 상호 작용을 시험, 통합 할 수 있습니다.ig1highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2 비드 집계 분석 그림. (A)와 같은 N-카드 헤린 및 E-카드 헤린 같은 고전 cadherins는 칼슘 의존적 homophilic 밀착성을 중재. 칼슘의 부재에서, cadherins 접착 상호 작용을 매개하는 데 실패 (더 칼슘 및 2 mM의 EDTA를 첨가하지 않음). 여기에 표시 된 Fc (NcadEC-FC)에 융합 제브라 피쉬 N-cadherin의의 ectodomain로 코팅 된 단백질 G 자석 구슬의 이미지입니다. (B) NcadEC-FC 코팅 구슬은 2 mM의 염화칼슘의 존재하에 1 시간 동안 집계하는 것이 허용되었다 2. N-카드 헤린의 ectodomains Homophilic 의해 밀착성이 큰 비드 응집체의 형성으로부터 명백하다. 밀착성의 반 정량적 척도로서 (C), 단위의 크기를 측정 할 수있다. 이를 달성하기위한 한 가지 방법은, 점유 면적을 측정하는 방법이다투과광 이미지에있는 개별의 집계. 여기에 도시 한 바와 같이 집합체 영역의 평균 크기는 시간의 함수로서 플롯 팅 될 수 있고, 또는 칼슘의 존재 또는 부재하에 평균 총 면적의 비율을 계산할 수있다. 칼슘 (폐쇄 원)의 존재 NcadEC-FC 코팅 구슬의 통합과 칼슘의 부재 (오픈 원)는 1 시간에 걸쳐 15 분 간격으로 측정 하였다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
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Discussion
세포 접착은 다세포 생활의 필수적인 기능이며, 세포 표면 단백질의 광범위한 어레이에 의해 매개된다. 이들 중에서도, 접착 성 상세한 만 상대적으로 작은 비율에 대한 이해된다. 여기에, 우리는 편리한 에피토프 태그에 융합 분비 ectodomains의 homophilic 접착 능력을 조사하기위한 간단하고 빠른 프로토콜을 설명했다. 이 접근법은 중요한 장점을 갖는다. 단백질의 충분한 양이 100mm 요리의 일시 발현에 의해 발생 될 수 있습니다 첫째, 안정적인 세포주는 14,20를 필요가 없습니다. 예를 들어, 점 또는 삭제 돌연변이 - - 노력없이 생성하고 세포 라인의 많은 수를 유지하는 비용이 구조의 더 많은 수의 검사를 할 수 있습니다. 둘째, 이러한 비드 분석법 감소 시스템에서 추정 부착 분자의 생화학 적 특성을 직접 시험이다. 따라서, 직접 접착 단백질에 기인 할 수있다조사보다는 전위 간접적 인 영향하에. 셋째, 가능한 공동 인자의 효과를 조사하기 위해, 세포를 추정 접착 분자의 분비 형태 및 그 추정 공동 인자, 별개의 에피토프 태그와 각각 공동 형질 감염 될 수있다. 그것은 적절한 에피토프 태그의 다양한 용도로 적용될 수있다 또한,이 접근법은 유연하다. 예를 들어, 균일 한 크기의 자석 구슬이 단백질 A 또는 G (FC 태그)에 결합되는 사용할 수 있으며, 스트렙 타비 딘 (연쇄상 구균 II 태그), 글루타치온 (GST 태그) 또는 TALON 또는 니켈 : NTA는 (그의 태그를 6 배). 마지막으로, 형광 비드의 가용성은 간단한 분류 분석은 homophilic 특이성을 조사하기 위해 동일한 프로토콜이 적응 될 수있다. 이러한 경우, 적색 및 녹색 형광 비드에서, 각각, 별개의 CAM 코팅 혼합 또는 분리 및 상호 혼합의 정도가 평가된다.
이러한 장점에도 불구하고, 또한 가지주의 사항이 있습니다. 첫째, 솔루션 구슬에 단백질 조각은하지 않습니다생체 내 상황 복잡성 요점을 되풀이. 각각의 세포는 세포 표면 단백질 및 세포 내 이펙터 그들의 특정한 보수 표현. 이러한 각각의 밀착성에 직접 또는 간접 중 효과를 가질 수 있고, 이러한 효과의 대부분은 비드 분석에 반영되지 않을 것이다. 예컨대, 분자는 (그것이 CAM 인) 강한 heterophilic 밀착성을 중재 할 수 있지만 이들 분석법에서 비드 응집을 유도하지 않을 것이다. 둘째, 비드 분석법은 반 정량적이고 접착제 상호 작용의 상대적인 강도에 대한 신뢰성, 정량적 정보를 제공하지 않는다. 마지막으로, 우리는 연구 한 모든 분자가 접착 도메인이 하나의 연속 된 폴리펩티드에 존재하는 유형 I, 단일 막 통과 단백질이다. 그것은 많은 캠 여러 ectodomain 영역에서 구축 된 접착제 인터페이스가 멀티 패스 횡단 단백질이 될 수 가능성이 높습니다. 이 분석은 분자에 쉽게 적응할 수 없을 것이다.
FOR 비드 분석에서 신뢰할 수있는, 조건을 재현 할 필요가있다. 이러한 분석의 변동성이 잠재적 인 소스가 있습니다. 제는 단백질 수준에서의 변화이다. 형질 감염 효율 또는 잘못 발현 된 단백질의 변동으로 인해 발현 수준의 변화가있는 경우, 비드 포화되지 않을 수 있고, 그 결과는 신뢰할 수있다. 앞서 비드 집계 구현 정제 ectodomain-융합 단백질의 정량을 사용한다. 전형적으로, 이러한 융합 단백질은 안정 세포주에서 큰 배치로 정제하여 여러 실험에 사용될 수있다. 각각의 실험에 사용 된 비드의 양 및 요구되는 단백질의 양이 매우 작다 같이, 비교 재현성 일시적인 형질 감염을 달성 할 수있다. 우리가 사용하는 자석 구슬은 재 부유 구슬 ~ 250 NG / L의 결합 능력을 가지고있다. 수퍼를 사용하여, 보조 결합 단계가 확인 될 수 단백질의 광대 초과 2 × 100mm 요리 결과 전형적인 트랜natant 비드에 융합 단백질의 결합 후 초기. 변화의 두 번째 잠재적 인 소스는 사용하는 구슬의 양이다. 우리가 사용하는 자석 구슬 빠르게 정착 30 ㎎ / ㎖ 슬러리로 제공됩니다. 재현성, 비드가 완전히 재현 탁되어야하며 비즈 정착하기 전에 관련 볼륨이 빠르게 추출 하였다. 하나의 대안은 큰 부피의 비드 정의 양을 미리 희석하는 것이다. 이러한 예비 희석 비드 피펫 오류를 방지하기 위해 더 큰 볼륨 (15 L보다는 1.5 L)에 첨가 될 수있다. 적절한 치료가 수행되지 않은 경우, 사용 된 비드의 양 실험 대 실험 변동이있을 것이다. 이것은 지정된 시간 골재 크기의 차이로 이어지는 응집 속도에 영향을 미칠 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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